本發(fā)明涉及基因工程、免疫學(xué)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除人PD-1基因構(gòu)建可靶向CD19新型CAR-T細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

一直以來，癌癥作為人類健康的頭號殺手，引起了無數(shù)科學(xué)家的關(guān)注。盡管手術(shù)治療、化療、放療等治療方式的出現(xiàn)改善了癌癥病人的病情，然而全球無數(shù)癌癥患者依舊受到癌癥的折磨。2013年，科學(xué)家們宣布使用一種新型的免疫細(xì)胞療法成功治愈晚期急性淋巴細(xì)胞白血病，給全世界癌癥病人帶來了新的曙光。這種利用嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor,CAR)T細(xì)胞免疫治療方法，可以特異性地識別腫瘤相關(guān)抗原，最終達(dá)到治愈腫瘤的目的。

CAR-T免疫療法是目前最具顛覆性潛力的新興技術(shù)之一，歐美及亞洲各國都在積極開展該療法的臨床試驗，其中美國開展臨床試驗項目最多，達(dá)41項，占據(jù)了全球CAR-T療法臨床試驗的74.5％。賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)院、費(fèi)城兒童醫(yī)院、美國癌癥研究院(NCI)、Fred Hutchinson癌癥研究中心、紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心和西雅圖兒童醫(yī)院等是最早開展CAR-T細(xì)胞療法的研究機(jī)構(gòu)。新興國際生物制藥公司如Juno、Kite、Celgene、Cellectis、Bluebird以及傳統(tǒng)國際制藥巨頭如諾華、葛蘭素史克、輝瑞、強(qiáng)生等都投入了大量資金和人力到CAR-T療法的研發(fā)中，推動這一極具前景的療法盡早進(jìn)入到臨床，從而造福癌癥及腫瘤患者患者(A service of the U.S.National Institute of Health.http://clinicaltrials.gov)。

CAR-T細(xì)胞療法在晚期難治性白血病和淋巴瘤患者中進(jìn)行的早期臨床試驗已經(jīng)顯示出非常振奮人心的結(jié)果。賓夕法尼亞大學(xué)研究人員今年10月在世界頂尖醫(yī)學(xué)雜志《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》上發(fā)表的一項臨床試驗結(jié)果顯示，在接受了CTL019輸注(靶向CD19抗原的CAR-T療法)的30名復(fù)發(fā)性或難治性ALL受試者中，治療后1個月有27名患者獲得完全緩解，其中甚至包括15位已經(jīng)接受過骨髓干細(xì)胞移植的患者，6個月時無反復(fù)生存率為67％(20人)，總體生存率為78％(23人)。另外還有1名患者2年隨訪時仍然持續(xù)完全緩解(Grupp SA et al,N Engl J Med 2013,368(16):1509-18)。NCI開展的一項臨床試驗也展現(xiàn)了良好的結(jié)果，該試驗入組了20名ALL患兒，在接受CAR-T細(xì)胞療法后，14名達(dá)到了完全緩解；12名患兒的骨髓中已檢測不到未成熟的白血病細(xì)胞，其中10名又接受了干細(xì)胞移植，至今無癌生存。研究結(jié)果還表明，CAR-T細(xì)胞療法可幫助化療無應(yīng)答的患者順利地過度到骨髓移植治療。紀(jì)念斯隆凱特林癌癥中心與NCI在成人患者中開展的1期臨床試驗也取得了類似的結(jié)果(Mazzarella L.2013American Society of Haematology meeting[J]2014,8:390)。

除白血病之外，CAR-T療法對淋巴瘤也顯示了喜人的療效，NCI領(lǐng)導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞臨床試驗招募了15名成人受試者，其中的絕大多數(shù)(9名)都患有晚期彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)。據(jù)Kochenderfer博士及NCI的同事報道，該臨床試驗的大多數(shù)患者都達(dá)到了緩解，在7例可評估的DLBCL受試者中4例獲得完全緩解，持續(xù)時間從9個月到22個月(Kochenderfer JN et al,Blood 2012,119(12):2709-20)。

然而癌細(xì)胞在長期的進(jìn)化過程中也發(fā)展出了一套自身的逃逸機(jī)制，可以躲過T細(xì)胞的摧毀，進(jìn)而肆無忌憚地擴(kuò)張。研究人員發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞表面有一個重要的“接頭”分子，他們把它稱為“程序性死亡受體-1”或PD-1(Programmed Death 1)，正常狀態(tài)下，它都能明辨“敵我”。但當(dāng)癌細(xì)胞表面出現(xiàn)“PD-L1”(Programmed Death Like 1)的時候，情況就變了。PD-L1蛋白是PD-1的配體，它倆一旦結(jié)合便會向T細(xì)胞傳遞一種負(fù)向調(diào)控信號，誘導(dǎo)T細(xì)胞進(jìn)入靜息狀態(tài)，讓其無法識別癌細(xì)胞，并且使T細(xì)胞自身增殖減少或凋亡，有效解除機(jī)體的免疫反應(yīng)，因此癌細(xì)胞可以毫不費(fèi)力就“登堂入室”。值得一提的是，許多癌細(xì)胞表面都存在這種PD-L1蛋白，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤等。于是，科學(xué)家們開始思索如何能阻止PD-1與PD-L1的結(jié)合，幫助T細(xì)胞恢復(fù)活性，正常識別癌細(xì)胞的威脅，進(jìn)而全力攻擊癌細(xì)胞。目前各大國際制藥巨頭紛紛致力于PD-1抑制劑和抗體藥物的臨床研究和開發(fā)。

最新的基因組編輯技術(shù)CRISPR-Cas9能快速、簡便、高效、特異性靶向敲除基因，基于PD-1分子在腫瘤免疫逃逸過程中的重要作用，我們利用CRISPR/Cas9在靶向CD19的CAR-T細(xì)胞中將PD-1基因敲除，阻斷癌細(xì)胞對T細(xì)胞的逃逸和抑制作用，使得CAR-T細(xì)胞能更加高效地識別和攻擊癌細(xì)胞。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除人PD-1基因構(gòu)建可靶向CD19新型CAR-T細(xì)胞的方法。

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種新型CAR-T細(xì)胞。

本發(fā)明的第三個目的在于提供上述新型CAR-T細(xì)胞的應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采用以下內(nèi)容：

一種利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除人PD-1基因構(gòu)建可靶向CD19新型CAR-T細(xì)胞的方法，該方法利用CRISPR/Cas9技術(shù)通過使用攜帶人PD-1基因sgRNA和Cas9-HF核酸酶的病毒液同步感染CAR-T細(xì)胞來敲除人PD-1基因，得到可靶向CD19新型CAR-T細(xì)胞；其中，人PD-1基因的mRNA序列由SEQ ID No.22至SEQ ID No.26所示的人PD-1基因外顯子組成，靶向sgRNA序列由SEQ ID No.27至SEQ ID No.32所示的人PD-1基因靶向sgRNA序列PD-1-Tn組成；Cas9-HF核酸酶由序列表SEQ ID No.33至SEQ ID No.36所示的Cas9-HF-NLS-HA核酸酶序列組成。

進(jìn)一步地，所述方法包括以下步驟：

1)構(gòu)建攜帶人PD-1基因sgRNA寡聚核苷酸病毒載體

所述sgRNA在PD-1基因上的靶序列符合5’-N(20)NGG的序列排列規(guī)則，且所述sgRNA在PD-1基因上的靶序列位于基因的外顯子；所述sgRNA在PD-1基因上的靶序列是唯一的，并且所述sgRNA在PD-1上的靶位點序列由SEQ ID No.27至SEQ ID No.32所示的人PD-1基因靶向sgRNA序列PD-1-Tn組成；合成sgRNA寡聚核苷酸雙鏈，并退火，之后與線性化的慢病毒載體連接，獲得攜帶PD-1基因sgRNA寡聚核苷酸病毒載體；

2)構(gòu)建攜帶Cas9-HF核酸酶病毒載體

在Cas9核酸酶氨基酸序列上依次進(jìn)行1-4個位點的突變，包括N497A、R661A、Q695A和Q926A，得到高保真Cas9-HF核酸酶，之后將高保真Cas9-HF克隆進(jìn)慢病毒載體，獲得Cas9-HF核酸酶病毒載體；

3)轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞

按照MOI＝1-10的值將攜帶PD-1基因sgRNA和Cas9-HF核酸酶的病毒液同步感染CAR-T細(xì)胞，完成敲除人PD-1基因，獲得敲除PD-1基因以及表達(dá)靶向CD19CAR分子的T細(xì)胞，即新型CAR-T細(xì)胞。

為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采用以下內(nèi)容：

一種新型CAR-T細(xì)胞，該T細(xì)胞中PD-1基因被敲除并且表達(dá)靶向CD19的CAR分子，該CAR分子由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.20所示的序列組成；

其中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.2為引導(dǎo)序列；

SEQ ID No.3至SEQ ID No.10為scFv序列；

SEQ ID No.11至SEQ ID No.12為CD8鉸鏈區(qū)；

SEQ ID No.13至SEQ ID No.14為CD8跨膜區(qū)；

SEQ ID No.15至SEQ ID No.16為4-1BB胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；

SEQ ID No.17至SEQ ID No.20為CD3ζ結(jié)構(gòu)域。

將所述CAR分子克隆進(jìn)慢病毒載體，構(gòu)建單一編碼框的全長CAR序列表達(dá)框，利用EF1alpha啟動子(序列表SEQ ID No.21)進(jìn)行表達(dá)。

為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明還公開了上述可靶向CD19新型CAR-T細(xì)胞在制備用于治療腫瘤的制劑中的應(yīng)用，所述腫瘤為CD19陽性腫瘤細(xì)胞、CD20陽性腫瘤細(xì)胞、CD30陽性腫瘤細(xì)胞、CD33陽性腫瘤細(xì)胞、CD138陽性腫瘤細(xì)胞，優(yōu)選為CD19陽性腫瘤細(xì)胞。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)將CAR-T細(xì)胞中的人PD-1基因敲除，阻斷腫瘤細(xì)胞對T細(xì)胞的逃逸和抑制作用，得到可靶向CD19新型CAR-T細(xì)胞，該新型CAR-T細(xì)胞能更有效地靶向攻擊腫瘤細(xì)胞，可用來制備用于治療腫瘤的制劑，尤其是CD19陽性腫瘤細(xì)胞的制劑。本發(fā)明的制備方法步驟簡單、獲得的CAR-T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷率高。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

圖1是PD-1敲除CAR設(shè)計圖。

圖2是KD-019CAR分子的表達(dá)。

圖3是PD-1和Cas9-HF蛋白表達(dá)分析。

圖4是KD-019CAR-T細(xì)胞對Raji細(xì)胞的殺傷率。

具體實施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實施例

一種利用CRISPR/Cas9特異性敲除人PD-1基因構(gòu)建靶向CD19的新型CAR-T細(xì)胞的方法，包括以下步驟：

1)攜帶PD-1基因sgRNA寡聚核苷酸病毒載體的構(gòu)建

sgRNA在PD-1基因上的靶序列符合5’-N(20)NGG的序列排列規(guī)則，且sgRNA在PD-1基因上的靶序列位于基因的外顯子；sgRNA在PD-1基因上的靶序列是唯一的，并且sgRNA在PD-1上的靶位點序列由SEQ ID No.27至SEQ ID No.32所示的人PD-1基因靶向sgRNA序列PD-1-Tn組成；

人PD-1基因的mRNA序列由SEQ ID No.22至SEQ ID No.26所示的人PD-1基因外顯子組成；

合成sgRNA寡聚核苷酸雙鏈(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)，混合后于95℃退火5分鐘，之后與線性化的慢病毒載體lentiGuide-Puro連接，獲得攜帶PD-1基因sgRNA寡聚核苷酸病毒載體；

2)攜帶Cas9-HF核酸酶病毒載體的構(gòu)建

在Cas9核酸酶氨基酸序列上依次進(jìn)行1-4個位點的突變，包括N497A、R661A、Q695A和Q926A，得到高保真Cas9-HF核酸酶，由序列表SEQ ID No.33至SEQ ID No.36所示的Cas9-HF-NLS-HA核酸酶序列組成，之后將高保真Cas9-HF克隆進(jìn)慢病毒載體lentiCas9-Blast，獲得Cas9-HF核酸酶病毒載體；

3)轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞

按照MOI＝1-10的值將攜帶PD-1基因sgRNA和Cas9-HF核酸酶的病毒液同步感染靶向CD19的CAR-T細(xì)胞(記為KD-019CAR-T細(xì)胞)，完成敲除人PD-1基因，獲得敲除PD-1基因以及表達(dá)靶向CD19的CAR分子T細(xì)胞，即得到敲除基因后的新型CAR-T細(xì)胞。

該特異CAR分子，記為KD-019CAR分子，由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.20所示的序列組成；其中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.2為引導(dǎo)序列；SEQ ID No.3至SEQ ID No.10為scFv序列；SEQ ID No.11至SEQ ID No.12為CD8鉸鏈區(qū)；SEQ ID No.13至SEQ ID No.14為CD8跨膜區(qū)；SEQ ID No.15至SEQ ID No.16為4-1BB胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；SEQ ID No.17至SEQ ID No.20為CD3ζ結(jié)構(gòu)域。將CAR分子克隆進(jìn)慢病毒載體，構(gòu)建單一編碼框的全長CAR序列表達(dá)框，利用EF1 alpha啟動子(序列表SEQ ID No.21)進(jìn)行表達(dá)。

圖1是PD-1敲除CAR設(shè)計圖。

對獲得的KD-019CAR-T細(xì)胞進(jìn)行體外活性分析

1)T細(xì)胞分離培養(yǎng)

通過密度梯度離心分離新鮮的外周血單核細(xì)胞(PBMC,peripheral blood mononuclear cell)；利用偶聯(lián)anti-CD3和anti-CD28抗體的paramagnetic beads(Dynabeads ClinExVivo CD3/CD28,Invitrogen,Camarillo,CA,USA)富集CD3+細(xì)胞，磁珠與細(xì)胞比例為3：1；細(xì)胞稀釋到TNC(total nucleated cell)濃度為(10-30)×10⁶/mL，在培養(yǎng)皿中與磁珠在室溫共孵育2-3小時；利用Magnetic particles concentrator(MPC)(Invitrogen)富集CD3+細(xì)胞；含有CD3+的細(xì)胞在培養(yǎng)皿中重懸于培養(yǎng)液(OpTmizer^TM CTS^TMT-Cell Expansion SFM,Life Technologies)中，終濃度為1×10⁶cells/mL。在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。

2)病毒液的制備

將KD-019CAR分子、人PD-1基因sgRNA以及高保真Cas9-HF核酸酶DNA片段分別克隆進(jìn)慢病毒穿梭載體；包裝載體按照Lenti-X Packaging Single Shots(Takara)說明書進(jìn)行制備。所有載體進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染Lenti-X 293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h和72h后，分別收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，病毒上清液通過超離心濃縮病毒。

3)敲除人PD-1基因的KD-019CAR-T細(xì)胞的制備

培養(yǎng)T細(xì)胞至濃度為(1-2)×10⁶/ml；將狀態(tài)良好的細(xì)胞接種到24孔板，使細(xì)胞濃度為1×10⁵/ml細(xì)胞，接種細(xì)胞數(shù)量因細(xì)胞的生長速度而略有不同，一般是保證第二天進(jìn)行病毒感染的時候細(xì)胞匯合率介于50-70％之間；第二天將適量的攜帶KD-019CAR分子以及人PD-1基因sgRNA的病毒液和攜帶高保真Cas9-HF核酸酶的病毒液一同加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶后，封好口，放入平角離心機(jī)后，低速(500g-1000g/min)離心1h，然后放入培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。感染后48小時后可以進(jìn)行下一步的功能實驗。

4)利用流式細(xì)胞術(shù)分析檢測CAR分子的表達(dá)

離心細(xì)胞，用PBS清洗兩次后重懸于FACS液中(含0.1％疊氮化鈉和0.4％BSA的PBS)；將Biotin-labeled polyclonal goat anti-mouse-F(ab)2抗體(anti-Fab,Jackson Immunoresearch)加入細(xì)胞懸液中，4℃孵育30分鐘；清洗細(xì)胞兩次后，加入phycoerythrin(PE)-labeled streptavidin(BD Pharmingen)，室溫30分鐘；BD FacsCanto II用于獲取染色細(xì)胞，F(xiàn)lowJo用于分析結(jié)果。如圖2所示，對照組為感染空載體病毒液的T細(xì)胞，幾乎檢測不到CAR分子的表達(dá)；而在感染KD-019 CAR分子病毒液的T細(xì)胞中，CAR分子的表達(dá)率達(dá)到44.7％。

5)Cas9-HF的表達(dá)及PD-1基因敲除的驗證

首先利用western blotting檢測了Cas9-HF核酸酶的表達(dá)。感染病毒后的細(xì)胞經(jīng)過離心、清洗以后在含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中裂解1小時，高速離心后得到的裂解上清液與4x LDS上樣緩沖液混合后在10％Bis-Tris預(yù)制膠(Life technologies)中進(jìn)行分離，然后通過電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜在含5％脫脂奶粉的TBST中封閉一小時，在1：1000的兔抗HA抗體中4℃孵育過夜。用TBST清洗膜3次，用1：5000偶聯(lián)HRP的羊抗兔IgG二抗室溫孵育1小時。用ECL Plus發(fā)光液孵育5分鐘后，在Tanon 9500機(jī)器中曝光。如圖3所示，相對于沒有感染病毒液的對照T細(xì)胞而言，在感染Cas9-HF核酸酶病毒液的T細(xì)胞中有很強(qiáng)的Cas9-HF蛋白表達(dá)。

接下來利用western blotting檢測PD-1蛋白在CAR-T細(xì)胞中的表達(dá)情況。感染病毒后的細(xì)胞經(jīng)過離心、清洗以后在含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中裂解1小時，高速離心后得到的裂解上清液與4x LDS上樣緩沖液混合后在10％Bis-Tris預(yù)制膠(Life technologies)中進(jìn)行分離，然后通過電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜在含5％脫脂奶粉的TBST中封閉一小時，在1：1000的兔抗人PD-1抗體中4℃孵育過夜。用TBST清洗膜3次，用1：5000偶聯(lián)HRP的羊抗兔IgG二抗室溫孵育1小時。用ECL Plus發(fā)光液孵育5分鐘后，在Tanon 9500機(jī)器中曝光。如圖3所示，相對對照組，PD-1的蛋白表達(dá)量在敲除組有明顯的下降。

6)KD-019CAR-T細(xì)胞殺傷測試

利用7-AAD/CFSE細(xì)胞毒性測試試劑盒評估KD-019CAR-T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞Raji的殺傷力。CSFE標(biāo)記腫瘤細(xì)胞后，以每孔2×10⁴的細(xì)胞鋪于培養(yǎng)板中，分別以10：1、3：1和1：1的比例將KD-019 CAR-T細(xì)胞加入腫瘤細(xì)胞中，培養(yǎng)20小時后離心去上清，細(xì)胞沉淀清洗之后用7AAD染色，BD FacsCanto II用于獲取染色細(xì)胞，F(xiàn)lowJo 用于分析結(jié)果。如圖4所示，相對于不感染病毒和感染空載體病毒液的對照組，KD-019CAR-T細(xì)胞對靶細(xì)胞Raji有明顯的殺傷作用，并且在KD-019CAR-T細(xì)胞中敲除人PD-1基因能顯著提高該殺傷率。

本發(fā)明的CAR分子能特異性靶向識別CD19陽性的腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的Cas9-HF核酸酶能有效降低CRISPR/Cas9基因組編輯過程中的脫靶現(xiàn)象。利用本發(fā)明方法敲除PD-1基因后得到的靶向CD19新型CAR-T細(xì)胞可用于評估對白血病癌細(xì)胞的靶向殺傷力，對正常細(xì)胞的副作用，以及用于白血病及其他淋巴癌、淋巴瘤等各類血液癌癥。

顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。