本發(fā)明屬于有機(jī)光化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一類基于熒光“雙響應(yīng)”機(jī)制的探針分子材料，具體來說是一類由鄰位芳香胺和其他共軛單元經(jīng)不同橋聯(lián)單元耦合的推-拉電子型共軛半導(dǎo)體有機(jī)分子材料，其實(shí)現(xiàn)了對(duì)一氧化氮分子雙重信號(hào)響應(yīng)的檢測(cè)和熒光成像應(yīng)用。

背景技術(shù)：

傳感技術(shù)是現(xiàn)代科技的前沿技術(shù)，許多國(guó)家已經(jīng)將傳感技術(shù)列為與通信技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)同等重要的位置，成為信息技術(shù)的三大支柱之一。所謂傳感技術(shù)，是人們?yōu)榱藢?duì)被測(cè)對(duì)象所包含的信息進(jìn)行定性的了解和定量掌握所采取的一系列技術(shù)措施，而傳感器就是完成相應(yīng)傳感功能的器件活裝置。傳感器大致分為三種：(一)物理傳感器(二)化學(xué)傳感器(三)生物傳感器。熒光探針是化學(xué)傳感技術(shù)領(lǐng)域在上個(gè)世紀(jì)八十年代的一項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn)，目前已有愈來愈多的熒光探針應(yīng)用于分子水平上進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。熒光檢測(cè)技術(shù)由于靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、可視性強(qiáng)，且對(duì)細(xì)胞、生物體的損傷小，成為了用于臨床分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)、生物分析及生命科學(xué)等領(lǐng)域不可缺少的檢測(cè)工具。

一氧化氮(NO)在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及免疫功能調(diào)節(jié)中起著重要的作用，是細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的重要調(diào)節(jié)因子，廣泛參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的生理和病理機(jī)制。近幾年來，許多與一氧化氮(NO)相關(guān)的疾病已被報(bào)道。由于一氧化氮(NO)的關(guān)鍵生物學(xué)作用，所以對(duì)于一氧化氮(NO)的研究已經(jīng)迫在眉睫。

因?yàn)樾畔鬟f在人的生理運(yùn)轉(zhuǎn)和疾病機(jī)理中有著重要的作用，所以對(duì)于活性氮化合物(RNS)的研究，尤其是一氧化氮(NO)的研究成為了一個(gè)熱門的領(lǐng)域。人們?cè)谘芯窟^程中所遇到的問題主要集中在缺乏必要的工具對(duì)信息傳遞過程進(jìn)行的實(shí)時(shí)跟蹤。熒光檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用，特別是在結(jié)合了微觀成像技術(shù)后，熒光成像技術(shù)的運(yùn)用對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行實(shí)時(shí)的分析與跟蹤進(jìn)入了一個(gè)全新的領(lǐng)域。

現(xiàn)有的一氧化氮(NO)探針是基于鄰位二胺結(jié)構(gòu)的，但是，通?；卩徫欢返腘O探針往往通過直接利用探針分子本身熒光光譜發(fā)射強(qiáng)度變化進(jìn)行分析檢測(cè)，這樣的方法會(huì)受限于探針本身的背景熒光干擾，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度低。此外，傳統(tǒng)基于鄰苯二胺取代基的NO探針由于本身背景干擾的緣故，很少能在細(xì)胞成像中做半定量、定量檢測(cè)。

因此，發(fā)明和設(shè)計(jì)一種具有高靈敏度的、可用于定量或半定量檢測(cè)的一氧化氮(NO)探針是生物監(jiān)測(cè)領(lǐng)域亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于現(xiàn)有技術(shù)中存在上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種基于熒光“雙響應(yīng)”機(jī)制的一氧化氮的探針分子及其制備方法和應(yīng)用，所述探針分子擬采用構(gòu)筑基于共軛電子給體單元和受體單元、具有推-拉電子效應(yīng)并含有與以往NO檢測(cè)類似的鄰位二胺單元的新型探針分子。所述探針分子具有靈敏度高、選擇性好的探針分子材料，同時(shí)，還具備了響應(yīng)時(shí)間短、膜透性好、背景噪音低、可直接觀察等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下所述：

本發(fā)明提供一種基于熒光“雙響應(yīng)”機(jī)制的一氧化氮的探針分子材料，所述探針分子材料具有下述通式(Ⅰ)所示結(jié)構(gòu)：

其中，Spacer為炔鍵、噻吩或取代芳基；Ar為芳基、取代芳基、雜環(huán)芳基或取代雜環(huán)芳基，其中，所述取代基是醚鏈、烷基鏈、磺酸基或季銨鹽陽離子中的一種。

進(jìn)一步的，在式(Ⅰ)通式中，上述芳基或取代芳基是未取代或取代的苯、聯(lián)苯、萘、苊、蒽、菲、芘、苝、芴中的一種；上述雜環(huán)芳基或取代雜環(huán)芳基是未取代或取代的吡啶、噻吩、咔唑、硅芴、吲哚、噻唑、苯并噻唑或芳基胺中的一種；芳基或雜環(huán)芳基的取代基可以是醚鏈、長(zhǎng)度不超過6個(gè)碳原子的烷基鏈、磺酸基或季銨鹽陽離子中的一種或多種，取代基個(gè)數(shù)為1-4個(gè)。

該探針分子在與NO發(fā)生作用時(shí)，會(huì)導(dǎo)致鄰位二胺由強(qiáng)給電子特性轉(zhuǎn)為弱吸電子特性，從而深度影響共軛體系的電子云分布，從而導(dǎo)致不僅熒光強(qiáng)度變化，而且熒光發(fā)射峰波長(zhǎng)同樣改變的雙響應(yīng)特性。

上述探針分子材料，在傳統(tǒng)的基于鄰位二胺結(jié)構(gòu)的探針分子結(jié)構(gòu)中引入了共軛結(jié)構(gòu)，形成了一類由鄰位芳香胺和其他共軛單元經(jīng)不同橋聯(lián)單元耦合的推-拉電子型共軛半導(dǎo)體有機(jī)分子材料。其中，鄰苯二胺基團(tuán)與一氧化氮相互作用發(fā)生關(guān)環(huán)反應(yīng)，引起熒光光譜的變化從而實(shí)現(xiàn)對(duì)一氧化氮檢測(cè)；同時(shí)，這種鄰位二胺單元與一氧化氮的選擇性反應(yīng)能對(duì)共軛分子推-拉電子效應(yīng)產(chǎn)生影響，共軛分子的紫外吸收光譜和熒光光譜在短波和長(zhǎng)波區(qū)域的峰值發(fā)生變化，從而可通過比率法定量或半定量檢測(cè)一氧化氮，實(shí)現(xiàn)對(duì)一氧化氮分子雙重信號(hào)響應(yīng)的檢測(cè)和熒光成像應(yīng)用。

本發(fā)明還提供上述探針分子材料的制備方法，首先是由4位和7位被鹵素取代的苯并噻二唑A通過取代反應(yīng)或偶聯(lián)反應(yīng)制得4位和7位被炔鍵、噻吩或取代芳基取代的苯并噻二唑B，然后是苯并噻二唑B與鹵代芳香化合物反應(yīng)得到炔鍵、噻吩或取代芳基上與Ar相連接的苯并噻二唑C，最后是苯并噻二唑C在硼氫化鈉和六水合氯化鈷的作用下制得具有苯二胺結(jié)構(gòu)的探針分子材料D?；蛘呤紫戎苽渚哂腥叉I、噻吩或取代芳基結(jié)構(gòu)與Ar相連接結(jié)構(gòu)的化合物，然后將該化合物與4位和7位被鹵素取代的苯并噻二唑A通過取代反應(yīng)或偶聯(lián)反應(yīng)制得苯并噻二唑C，最后是苯并噻二唑C在硼氫化鈉和六水合氯化鈷的作用下制得具有苯二胺結(jié)構(gòu)的探針分子材料D。

根據(jù)探針分子結(jié)構(gòu)的不同，在制備時(shí)稍有不同，下面分別舉例說明。

對(duì)于間隔段為噻吩結(jié)構(gòu)的探針分子材料即Spacer為噻吩的探針分子材料，這類材料的制備方法的合成路線如“制備方法(一)”所示，該方法具體包括以下步驟：

i)在堿水溶液條件下，鹵代苯并噻二唑與噻吩硼酸在鈀催化劑作用下，于有機(jī)溶劑中反應(yīng)2-8h，得到如式(2)所示的4,7-二噻吩苯并噻二唑；

其中，所述鹵素X₁為Cl、Br、I原子；所述堿可以是碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸銫或四丁基氫氧化銨等；所述有機(jī)溶劑可以是二氧六環(huán)、四氫呋喃、甲苯、甲基乙二醇等；所述鈀催化劑是四(三苯基膦)鈀、醋酸鈀或二氯二三苯基膦鈀等。

ii)在堿性條件下，上述4,7-二噻吩苯并噻二唑和鹵代芳香化合物在鈀催化劑和三甲基乙酸的作用下，于有機(jī)溶劑中反應(yīng)6-12h，得到一類如式(4)所示共軛分子；

其中，所述鹵素X₂為Cl、Br、I原子；所述堿可以是碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸銫或四丁基氫氧化銨等；所述的有機(jī)溶劑是N.N-二甲基甲酰胺、N.N-二甲基乙酰胺或甲苯，且使用的有機(jī)溶劑須經(jīng)無水無氧處理；所述鈀催化劑是四(三苯基膦)鈀、醋酸鈀或二氯二三苯基膦鈀等；反應(yīng)溫度為100^-130℃。

iii)式(4)所示共軛分子溶于有機(jī)溶劑，加入還原劑和相當(dāng)于還原劑2-10％摩爾比的六水合氯化鈷，攪拌反應(yīng)液，得到如通式(I)所示的一類基于熒光“雙響應(yīng)”機(jī)制的一氧化氮的探針分子，產(chǎn)率最高可達(dá)90％以上。

其中，步驟iii)的所述有機(jī)溶劑是甲醇、乙醇、乙酸乙酯中的一種或其混合溶液，所述還原劑為硼氫化鈉、氫化鋁鋰等。

通過上述制備方法(一)能夠制得間隔段為噻吩結(jié)構(gòu)的探針分子材料，其中，X₁、X₂為Cl、Br、I原子，Ar為芳基、取代芳基、雜環(huán)芳基或取代雜環(huán)芳基；所述的芳基或取代芳基是未取代或取代的苯、聯(lián)苯、萘、苊、蒽、菲、芘、苝、芴或螺芴中的一種；所述雜環(huán)芳基或取代雜環(huán)芳基是未取代或取代的吡咯、吡啶、呋喃、噻吩、咔唑、硅芴、吲哚、噻唑、苯并二唑或苯并噻唑中的一種；所述芳基或雜環(huán)芳基的取代基可以是醚鏈、長(zhǎng)度不超過6個(gè)碳原子的烷基鏈、磺酸基或季銨鹽陽離子中的一種，取代芳基或取代雜環(huán)芳基的取代基個(gè)數(shù)為1-4個(gè)。

對(duì)于間隔段為炔鍵結(jié)構(gòu)的探針分子材料即Spacer為炔鍵的探針分子材料，這類材料的制備方法的合成路線如“制備方法(二)”所示，該方法具體包括以下步驟：

i)將鹵代苯并噻二唑溶于有機(jī)溶劑，加入鈀催化劑、碘化亞銅和三甲基硅乙炔，在50-80℃下攪拌4-24h，得到一類如式(2)所示的三甲基硅乙炔取代的苯并噻二唑化合物；

其中，所述有機(jī)溶劑可以為四氫呋喃、甲苯、苯和二異丙胺、三乙胺、二乙基乙胺、乙二胺等有機(jī)堿的混合溶劑，體積比約為1:1-2:3；所述催化劑是四(三苯基膦)鈀、醋酸鈀、二氯二三苯基膦鈀等。

ii)將三甲基硅乙炔取代的苯并噻二唑化合物溶于有機(jī)溶劑，加入強(qiáng)堿，在20-40℃下攪拌2-12h，得到一類如式(3)所表示的一類乙炔取代的苯并噻二唑化合物；

其中，所述有機(jī)溶劑可以為甲苯、四氫呋喃、二氧六環(huán)、甲醇或乙醇等的混合溶劑；所述強(qiáng)堿是氫氧化鉀、氫氧化鈉、碳酸鉀等。

iii)將鹵代芳香化合物和乙炔取代的苯并噻二唑化合物溶于有機(jī)溶劑，加入鈀催化劑和碘化亞銅，20-60℃進(jìn)行Sonogashira偶聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)4-24h，得到如通式(5)所示的共軛分子；

其中，所述有機(jī)溶劑可以為四氫呋喃、甲苯和二異丙胺、三乙胺、二乙基乙胺、乙二胺等有機(jī)堿的混合溶劑，體積比約為1:1-2:3，所述催化劑可以是四(三苯基膦)鈀、醋酸鈀、二氯二三苯基膦鈀等。

iv)式(5)所示共軛分子溶于有機(jī)溶劑，加入還原劑和相當(dāng)于還原劑2-10％摩爾比的六水合氯化鈷，攪拌反應(yīng)液，得到如通式(I)所示的一類基于熒光“雙響應(yīng)”機(jī)制的一氧化氮的探針分子，產(chǎn)率可達(dá)80％以上；

其中，所述有機(jī)溶劑是甲醇、乙醇、乙酸乙酯中的一種或其混合溶液，所述還原劑為硼氫化鈉、氫化鋁鋰等。

通過上述制備方法(二)能夠制得間隔段為炔鍵結(jié)構(gòu)的探針分子材料，制備過程如“制備方法(二)”所示，其中，X₁、X₂為Cl、Br、I原子，Ar為芳基、取代芳基、雜環(huán)芳基或取代雜環(huán)芳基；所述的芳基或取代芳基是未取代或取代的苯、聯(lián)苯、萘、苊、蒽、菲、芘、苝、芴或螺芴中的一種；所述雜環(huán)芳基或取代雜環(huán)芳基是未取代或取代的吡咯、吡啶、呋喃、噻吩、咔唑、硅芴、吲哚、噻唑、苯并二唑或苯并噻唑中的一種；所述芳基或雜環(huán)芳基的取代基可以是醚鏈、長(zhǎng)度不超過6個(gè)碳原子的烷基鏈、磺酸基或季銨鹽陽離子中的一種，取代芳基或取代雜環(huán)芳基的取代基個(gè)數(shù)為1-4個(gè)。

在上述所有制備方法中，制得的探針分子兩端的芳香取代基團(tuán)Ar可以在制備過程中或制備完成后通過取代反應(yīng)或偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行更改。

此外，本發(fā)明還提供上述基于熒光“雙響應(yīng)”機(jī)制的一氧化氮的探針分子材料在生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用，所述生物監(jiān)測(cè)的具體步驟如下：

A)將上述探針分子材料配成濃度高于10^-6M稀溶液，溶劑可以是PBS混合緩沖液、去離子水或四氫呋喃、二甲亞砜、乙醇等構(gòu)成混合溶劑；

B)將待測(cè)NO儲(chǔ)備液加入探針分子材料溶液中，定容，其中探針分子材料測(cè)試中的最終濃度為10^-6M；

C)測(cè)定在不同NO濃度存在下，探針分子材料的紫外可見吸收光譜、熒光發(fā)射光譜，根據(jù)共軛分子材料熒光光譜在短波和長(zhǎng)波區(qū)域峰值變化，可對(duì)待測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)；

通過對(duì)紫外吸收光譜中特定吸收峰強(qiáng)度變化值或熒光光譜中特定的發(fā)射峰強(qiáng)度變化的比率進(jìn)行分析，確定NO的量。

本發(fā)明還提供上述基于熒光“雙響應(yīng)”機(jī)制的一氧化氮的探針分子材料在細(xì)胞成像領(lǐng)域的應(yīng)用，所述細(xì)胞成像的具體步驟如下：

A)將探針分子或利用再沉淀法制備的具有探針分子的熒光納米顆粒配制0.5-20μM的溶液；

B)將上述溶液與細(xì)胞在培養(yǎng)基中共培養(yǎng)30min到4h，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中染色物質(zhì)熒光光譜，并與探針分子與NO作用的光譜曲線對(duì)比，確認(rèn)其中NO的比例。

本發(fā)明具有如下有益效果：1、設(shè)計(jì)一類具有靈敏度高、選擇性好的探針分子材料，同時(shí)，還具備了響應(yīng)時(shí)間短、膜透性好、背景噪音低、可直接觀察等優(yōu)點(diǎn)；2、本發(fā)明中所涵蓋的共軛分子材料具有良好的發(fā)光性能，化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性，是一類全新的傳感檢測(cè)平臺(tái)，具有良好的應(yīng)用前景；3、所述共軛分子材料，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)步驟少，易于合成與純化等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1.共軛分子材料B-1與不同量NO儲(chǔ)備液作用后的紫外圖譜。

圖2.共軛分子材料B-1與不同量NO儲(chǔ)備液作用后的熒光圖譜。

圖3.共軛分子材料B-1與不同量NO儲(chǔ)備液作用后，分別在420nm、362nm處吸收光譜強(qiáng)度變化擬合曲線圖。

圖4.共軛分子探針B-1應(yīng)用與Hela細(xì)胞成像，與未加P1的共培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)照?qǐng)D。

具體實(shí)施方式

為了更清楚的說明本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖進(jìn)行進(jìn)一步的說明。應(yīng)當(dāng)知道的是，以下實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明的部分實(shí)施方式，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例制備的探針分子材料A-1的分子結(jié)構(gòu)為：

本實(shí)施例1采用制備方法(一)制備得到，具體步驟為：

i)兩口瓶(100mL)中，將4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑(2.01g,6.84mmol)，2-噻吩硼酸(1.42g,11mmol)溶解在20mL甲苯中,注入2M碳酸鉀溶液15mL.抽換氣三次，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入四(三苯基膦)鈀(150mg,0.14mmol)，加熱至75℃，反應(yīng)2-8h。自然冷至室溫，二氯甲烷萃取，干燥，濃縮，柱層析分離得到紅色晶體4,7-二噻吩-2,1,3-苯并噻二唑1.73g,產(chǎn)率84.3％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.12(dd,J＝3.7,1.1Hz,2H),7.88(s,2H),7.46(dd,J＝5.1,1.1Hz,2H),7.24–7.20(m,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ152.61,139.36,128.02,127.51,126.81,125.75。

ii)在兩口瓶(250ml)中，將3-溴丙酸叔丁基(6.7g，32mmol)，二溴芴(2.9g，12mmol)，碘化鉀(200mg,1.2mmol)溶解在DMSO(100ml)和50％(w/w)NaOH水溶液(30ml)中。反應(yīng)混合物在60℃下攪拌6h。二氯甲烷萃取，干燥，濃縮，柱層析分離得到淡黃色液體9,9-雙(3,3'-二丙酸叔丁酯)-2-溴芴5.2g，直接用于下步。

在100mL的Schlenk管中，三甲基乙酸(33mg,0.32mmol)，碳酸鉀(400mg,2.9mmol)，4,7-二噻吩-2,1,3-苯并噻二唑(340mg,1.13mmol)，9,9-雙(3,3'-二丙酸叔丁酯)-2-溴芴(1g,2mmol)，溶解在35ml無水N,N-二甲基乙酰胺中，抽換氣三次，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入醋酸鈀(60mg,0.27mmol)，加熱至100-130℃，反應(yīng)6-12h。二氯甲烷萃取，干燥，濃縮，柱層析分離得到紅色晶體TBBT-1 1.6g,產(chǎn)率70.2％.¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.13(d,J＝3.7Hz,2H),8.08–8.07(m,1H),7.92(s,2H),7.72(s,8H),7.50(d,J＝3.7Hz,2H),7.45–7.32(m,6H),2.50–2.38(m,8H),1.63–1.48(m,8H),1.31(s,36H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ172.80,152.58,149.04,148.35,145.83,140.98,140.66,138.61,133.52,128.62,127.87,127.68,125.72,125.43,125.30,124.18,123.13,120.50,120.10,120.07,80.19,34.72,28.03。

iii)在兩口瓶(100ml)中，將TBBT-1(200mg,0.4mmol)溶解在乙酸乙酯(10ml)和甲醇(3ml)混合物中，慢慢加入硼氫化鈉(10mg,0.26mmol)及適量的六水合氯化鈷，反應(yīng)混合物在0℃下攪拌2h。二氯甲烷萃取，干燥，濃縮，柱層析分離得到黃色晶體A-1 113.5mg，產(chǎn)率60.2％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.73–7.68(m,4H),7.64(dd,J＝9.7,1.6Hz,4H),7.44(d,J＝3.6Hz,2H),7.42–7.31(m,6H),7.24(d,J＝3.7Hz,2H),7.02(s,2H),2.39(t,J＝8.3Hz,8H),1.52(dd,J＝18.4,8.5Hz,8H),1.30(s,36H).

實(shí)施例2：

本實(shí)施例制備的探針分子材料B-1的分子結(jié)構(gòu)為：

本實(shí)施例2采用制備方法(一)制備得到，具體步驟為：

i)4,7-二噻吩-2,1,3-苯并噻二唑的制備過程與實(shí)施例1步驟i)相同。

ii)在兩口瓶(250ml)中，將1-溴-2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙烷(7.3g，27.4mmol)，二溴芴(2.9g，12mmol)，碘化鉀(200mg,1.2mmol)溶解在DMSO(100ml)和50％(w/w)NaOH水溶液(30ml)中。反應(yīng)混合物在60。反下攪拌6h。二氯甲烷萃取，干燥，濃縮，柱層析分離得到淡黃色液體9,9-雙(3,3'-2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙烷)-2-溴芴4.9g，產(chǎn)率79.1％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.65(dd,J＝5.6,3.0Hz,1H),7.56–7.52(m,2H),7.46(dd,J＝8.0,1.8Hz,1H),7.38(d,J＝2.6Hz,1H),7.33(dd,J＝6.2,2.8Hz,2H),3.55–3.45(m,8H),3.40(t,J＝4.9Hz,4H),3.21(dd,J＝8.3,4.7Hz,4H),2.74(d,J＝7.0Hz,4H),2.39–2.32(m,4H).

在100mL的Schlenk管中，三甲基乙酸(33mg,0.32mmol)，碳酸鉀(400mg,2.9mmol)，4,7-二噻吩-2,1,3-苯并噻二唑(340mg,1.13mmol)，9,9-雙(3,3'-2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙烷)-2-溴芴(1g,2mmol)，溶解在35ml無水N,N-二甲基乙酰胺中,抽換氣三次，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入醋酸鈀(60mg,0.27mmol)，加熱至105℃，反應(yīng)6-12h。二氯甲烷萃取，干燥，濃縮，柱層析分離得到紅色晶體TBBT-2 1.48g,產(chǎn)率68.9％.¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.17(d,J＝3.9Hz,2H),7.96(s,2H),7.77–7.68(m,8H),7.51(d,J＝3.9Hz,2H),7.46–7.42(m,2H),7.39–7.30(m,4H),3.54–3.49(m,8H),3.48–3.43(m,9H),3.43–3.39(m,8H),3.33–3.30(m,12H),3.26–3.21(m,8H),2.87–2.76(m,8H),2.51–2.42(m,8H).

iii)在兩口瓶(100ml)中，將TBBT-2(200mg,0.4mmol)溶解在乙酸乙酯(10ml)和甲醇(3ml)混合物中，慢慢加入硼氫化鈉(10mg,0.26mmol)及適量的六水合氯化鈷，反應(yīng)混合物在0℃下攪拌2h。二氯甲烷萃取，干燥，濃縮，柱層析分離得到墨綠色固體B-1 80.4mg，產(chǎn)率41.1％。

實(shí)施例3：

本實(shí)施例制備的探針分子材料C-1的分子結(jié)構(gòu)為：

本實(shí)施例3采用制備方法(二)制備得到，具體步驟為：

i)兩口瓶(100mL)中，將4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑(2.01g-3.05，6.84-10mmol)，三甲基硅乙炔(0.67g-1.0g，15-22.5mmol)溶解在20-40mL四氫呋喃中，注入15-30mL三乙胺。抽換氣三次，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入四(三苯基膦)鈀(50-150mg,0.05-0.14mmol)，50-80℃，反應(yīng)4-24h。自然冷至室溫，二氯甲烷萃取，干燥，濃縮，柱層析分離得到黃綠色晶體4,7-二三甲基硅乙炔基-2,1,3-苯并噻二唑，產(chǎn)率77-84.3％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.22(dd,J＝3.7,1.1Hz,2H),0.14(m,18H).

ii)在兩口瓶(150mL)中，將4,7-二三甲基硅乙炔基-2,1,3-苯并噻二唑溶解于四氫呋喃與甲醇的混合溶劑中，加入碳酸鉀(或者氫氧化鉀等堿)，20-40℃氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌2-12h。二氯甲烷萃取，干燥，濃縮，柱層析分離得到橙黃色晶體4,7-二乙炔基-2,1,3-苯并噻二唑，直接用于后續(xù)步驟。

在100mL的Schlenk管中，4,7-二乙炔基-2,1,3-苯并噻二唑(270mg，1.13mmol)，2-碘-N-(三乙氧基甲基)咔唑(1.2g，2mmol)溶解在20-30mL四氫呋喃中，注入15-20mL三乙胺。抽換氣三次，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入四(三苯基膦)鈀(50-150mg,0.05-0.14mmol)，20-60℃，反應(yīng)4-24h。自然冷至室溫，二氯甲烷萃取，干燥，濃縮，柱層析分離得到橘紅色粘液，產(chǎn)率85-95％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.13(d,J＝3.7Hz,2H),7.96(s,2H),7.76(s,4H),7.42(d,J＝3.7Hz,4H),7.45–7.32(m,4H),2.50–2.38(m,8H),1.63–1.48(m,8H),1.31(s,36H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ173.81,155.68,148.07,148.35,145.83,140.98,140.66,138.61,133.52,128.62,127.87,127.68,125.72,125.43,125.30,124.18,123.13,120.50,120.10,119.2，118.7，81.2,33.7,26.23。

iii)在兩口瓶(100ml)中，將上述步驟橘紅色粘液(165mg,0.4mmol)溶解在乙酸乙酯(10ml)和甲醇(3ml)混合物中，慢慢加入硼氫化鈉(10-18mg)及適量的六水合氯化鈷，反應(yīng)混合物在0℃下攪拌2h。二氯甲烷萃取，干燥，濃縮，柱層析分離得到C-1純品98.5mg，產(chǎn)率67％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.94(s,2H),7.75–7.68(m,4H),7.64(dd,J＝9.7,1.6Hz,4H),7.76(s,4H),7.42(d,J＝3.7Hz,4H),7.45–7.32(m,4H),2.50–2.38(m,8H),1.52(dd,J＝18.4,8.5Hz,8H),1.30(s,36H).

實(shí)施例4：

本實(shí)施例制備的探針分子材料D-1的分子結(jié)構(gòu)為：

本實(shí)施例4采用芳基與鄰位二胺直接相連，具體步驟為：

i)在兩口瓶(250ml)中，烷氧基取代的噻吩并吲哚的三丁基錫試劑(7.1g，22.4mmol)，4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑(2.01g-3.05，6.84-10mmol)溶解在甲苯(70ml)中，加入四(三苯基膦)鈀(50-150mg,0.05-0.14mmol)。反應(yīng)混合物在110-130℃反下4-12h。濃縮，柱層析分離得到深紅色液體，產(chǎn)率75-85.1％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.65(dd,J＝5.6,3.0Hz,1H),7.56–7.52(m,2H),7.46(dd,J＝8.0,1.8Hz,1H),7.38(d,J＝2.6Hz,1H),7.33(dd,J＝6.2,2.8Hz,2H),3.55–3.45(m,8H),3.40(t,J＝4.9Hz,4H),3.21(dd,J＝8.3,4.7Hz,4H),2.74(d,J＝7.0Hz,4H),2.39–2.32(m,4H).

ii)在兩口瓶(100ml)中，將上述深紅色樣品(400mg，1.3mmol)溶解在乙酸乙酯(10ml)和甲醇(3ml)混合物中，慢慢加入硼氫化鈉(30-50mg)及適量的六水合氯化鈷，反應(yīng)混合物在0-40℃下攪拌2-4h。二氯甲烷萃取，干燥，濃縮，柱層析分離得到橘紅色蠟狀固體D-1純品325mg，產(chǎn)率83％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.94(s,2H),7.75–7.68(m,4H),7.64(dd,J＝9.7,1.6Hz,4H),7.76(s,4H),7.42(d,J＝3.7Hz,4H),7.45–7.32(m,4H),2.50–2.38(m,8H),1.52(dd,J＝18.4,8.5Hz,8H),1.30(s,36H).

實(shí)施例5：

以下實(shí)施例是根據(jù)本發(fā)明的選材選擇了其中一種共軛分子材料B-1(實(shí)施例2所述)，應(yīng)用于生物分子檢測(cè)。

1)在DMSO和PBS混合緩沖溶液(1:5,v/v，PH＝7.04)中配制3μM的B-1，測(cè)其紫外吸收光譜譜圖。

2)在PBS混合緩沖溶液(pH＝7.04)中加入B-1與不同量的NO飽和儲(chǔ)備液(v/v＝0-1)，室溫?cái)嚢?.5-4h。

3)測(cè)定每組溶液的紫外、熒光圖譜，并對(duì)吸收曲線進(jìn)行擬合，如圖1、圖2和圖3所示。

通過圖1可知，隨著NO儲(chǔ)備液加入B-1溶液，原B-1在362納米出的吸收峰逐漸減弱，同時(shí)，在420納米出的吸收峰逐漸增強(qiáng)，且較B-1在362納米處的吸收強(qiáng)度更強(qiáng)，表明新的共軛體系的形成以及新形成的共軛結(jié)構(gòu)具有更強(qiáng)的電子離域程度。由圖2可知，隨著NO儲(chǔ)備液的加入，B-1在466納米處藍(lán)色熒光逐漸減弱，同時(shí)，在500納米處產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于420納米新共軛結(jié)構(gòu)的熒光峰，且其熒光強(qiáng)度更高。這種因?yàn)楣曹椊Y(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的吸收光譜和熒光光譜位置、強(qiáng)度變化非常有利于本發(fā)明所述探針對(duì)NO的有效檢測(cè)和分析。圖3為利用362納米和420納米激發(fā)光分別激發(fā)B-1與一氧化氮儲(chǔ)備液共混溶液后記錄的466納米和520納米出熒光強(qiáng)度變化趨勢(shì)，是對(duì)圖1和圖2的補(bǔ)充。

實(shí)施例6：

以下實(shí)施例是根據(jù)本發(fā)明的選材選擇了其中一種共軛分子材料B-1，應(yīng)用于細(xì)胞成像。

1)在DMSO和PBS混合緩沖溶液(1:5,v/v，PH＝7.04)中配制3μM的B-1。

2)將上述溶液與細(xì)胞在培養(yǎng)基中共培養(yǎng)30min到2h，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中染色物質(zhì)熒光光譜，并與探針分子與NO作用的光譜曲線對(duì)比，確認(rèn)其中NO的比例。

如圖4所示，其中A和B是加入B-1在明場(chǎng)和360nm激發(fā)下，未加NO刺激劑，顯然，這是，僅能觀察到B-1的藍(lán)色熒光(圖4-B中亮的區(qū)域)；C和D是加入B-1在明場(chǎng)和360nm激發(fā)下，加NO刺激劑，此時(shí)，因?yàn)镹O在細(xì)胞中的釋放，與進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的B-1發(fā)生作用，B-1的藍(lán)色熒光減弱，產(chǎn)生黃綠色熒光；E和F是加入B-1在明場(chǎng)和360nm激發(fā)下明場(chǎng)和360nm激發(fā)下，加NO刺激劑及血紅蛋白抑制劑，由于血紅蛋白抑制劑的存在，細(xì)胞釋放的NO優(yōu)先于血紅蛋白結(jié)合，因此，圖4-F顯示依然為B-1本身的藍(lán)色熒光；G和H是未加入P1在明場(chǎng)和360nm激發(fā)下明場(chǎng)和360nm激發(fā)下空白對(duì)照。結(jié)合以上圖片顯示的信息，可知，本發(fā)明所述的NO探針可應(yīng)用與細(xì)胞內(nèi)NO的有效探測(cè)。