本發(fā)明涉及用于檢測16SrI組植原體的LAMP引物組，尤其涉及利用LAMP引物組檢測泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變植原體的檢測方法，還涉及LAMP引物組在泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變植原體的早期診斷和病原菌的監(jiān)測與鑒定中的應(yīng)用，屬于植物病害檢測、鑒定及防治技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

植原體(Phytoplasma，原稱Mycoplasma-like organism簡稱MLO)，是一類類似植物病原細(xì)菌但無細(xì)胞壁的原核生物。能引起許多重要的糧食作物、蔬菜、觀賞植物和果樹等經(jīng)濟林木的嚴(yán)重病害。根據(jù)植原體16S rDNA基因序列，可將植原體分為28個組，其中引起泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變的植原體均屬于16Sr I組。此類病害的分布范圍廣，傳播速度快，致病力強，一旦感病，傳統(tǒng)的病害防治技術(shù)難以治愈。泡桐原產(chǎn)自中國，在中國的栽培面積廣泛，是重要的速生豐產(chǎn)用材林，也是重要的行道樹和環(huán)境美化樹種。泡桐叢枝病在中國大面積發(fā)生，嚴(yán)重影響樹木的生長與發(fā)育。桑樹萎縮病是一種十分危險的病害，分布在中國江蘇、浙江、安徽等省。此病近年來日漸增多，尤其中國江浙江界的太湖地區(qū)，每年發(fā)病率一般為5-15％，重病區(qū)達(dá)30％以上，很多病株數(shù)年后即枯死。萵苣黃化近來被報道在中國福建發(fā)生，發(fā)病后嚴(yán)重降低萵筍的產(chǎn)量和品質(zhì)，給農(nóng)民們帶來嚴(yán)重?fù)p失。為了從根本上解決此類病害的防治問題，最有效的措施就是建立嚴(yán)格的植物檢疫，從源頭上杜絕病原。

植原體病害的檢測，前期主要依靠生物學(xué)、電鏡觀察、抗生素試驗相結(jié)合的傳統(tǒng)方法進(jìn)行檢測，到后期隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基于酶聯(lián)免疫反應(yīng)、核酸雜交以及PCR技術(shù)的檢測方法也相繼建立，檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性不斷提高。但是目前的這些方法往往需要昂貴的儀器設(shè)備，且操作程序復(fù)雜，檢測時間長，對檢測人員的技術(shù)要求較高，這些都大大限制了此類診斷方法的使用和推廣。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增是Notomi等在2000年開發(fā)的一種恒溫核酸擴增方法，是一種新型的分子診斷方法。該方法針對靶基因6個特異區(qū)域設(shè)計特異性引物，并利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫下對核酸實現(xiàn)擴增。由于該方法具有特異性強、操作簡單、不需要復(fù)雜的儀器、檢測周期短和結(jié)果可視化的特點，使得其非常適合作為基層和現(xiàn)場的病害診斷方法進(jìn)行推廣使用。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增作為一種新型的分子診斷方法。已有部分報道將該技術(shù)應(yīng)用于植原體的檢測上，如16Sr I組的翠菊黃化和草莓綠瓣植原體、16Sr II組的銀膠菊叢枝植原體、16Sr V組的棗瘋病和葡萄金黃化植原體、16Sr XII組的番木瓜叢枝植原體等均已開發(fā)出相應(yīng)的LAMP檢測方法。但這些方法的靶標(biāo)基因主要是16S rDNA基因。16S rDNA基因在植原體中為雙拷貝，存在一定的變異性，而蛋白延伸因子編碼基因tuf在植原體中為單拷貝，被認(rèn)為是一種新的進(jìn)化標(biāo)簽。它和16S rDNA基因相比保守性略低，可在16S rDNA基因分組的基礎(chǔ)上進(jìn)一步區(qū)分亞組。

因此以tuf基因作為靶標(biāo)基因，針對泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變等植原體，設(shè)計有更好特異性的LAMP引物，對泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變植原體的早期診斷和病原菌的監(jiān)測與鑒定具有十分重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的之一是提供泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變植原體的LAMP引物組；

本發(fā)明目的之二是提供泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變植原體的LAMP檢測方法；

本發(fā)明目的之三是提供泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變植原體的LAMP檢測試劑盒；

本發(fā)明目的之四是提供LAMP引物組及其檢測方法在泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變植原體的早期診斷和病原菌的監(jiān)測與鑒定中的應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

本發(fā)明首先公開了檢測泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變植原體的LAMP引物組，包括一對內(nèi)引物對和一對外引物對，所述外引物對(PaWB3-F3/PaWB3-B3):由SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的核苷酸序列組成；所述內(nèi)引物對(PaWB3-FIP/PaWB3-BIP):由SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列組成。

本發(fā)明還公開了一種檢測泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變植原體的LAMP試劑盒，包括：LAMP引物、LAMP反應(yīng)液RM、Bst DNA聚合酶、熒光染料10×SYBR GreenⅠ、待測樣品DNA、陽性和陰性對照、超純水和密封液，所述LAMP引物為上述LAMP引物組。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了上述LAMP引物組在泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變植原體的檢測方法，包括以下步驟：

(1)提取待測樣品DNA；(2)以待檢測樣品的DNA為模板，以上述LAMP引物組為擴增引物建立LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行等溫基因擴增；(3)對擴增產(chǎn)物結(jié)果進(jìn)行判定。

其中，所述LAMP反應(yīng)體系中包含：由SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的核苷酸序列組成外引物對以及由SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列組成內(nèi)引物對組成的引物組，LAMP反應(yīng)液RM，Bst DNA聚合酶，熒光染料10×SYBR Green Ⅰ，待測樣品DNA，超純水和密封液；

優(yōu)選的，所述LAMP反應(yīng)體系為45μL，包含：10μM PaWB3-F3 0.5μL，10μM PaWB3-B3 0.5μL，40μM PaWB3-FIP 1μL，40μM PaWB3-BIP 1μL，LAMP反應(yīng)液RM(2×)12.5μL，8U/μL Bst DNA聚合酶1μL，熒光染料10×SYBR GreenⅠ0.5μL，待測樣品DNA 0.5μL，超純水7.5μL和20μL密封液。

所述等溫基因擴增為63℃恒溫反應(yīng)40～60min，80℃滅活5～10min；優(yōu)選的63℃恒溫反應(yīng)60min，80℃滅活5min。

所述對擴增產(chǎn)物結(jié)果進(jìn)行判定：將擴增產(chǎn)物置于恒溫?zé)晒鈾z測儀或者熒光PCR儀中，實時讀取熒光信號，若出現(xiàn)“S”型擴增曲線則判定為陽性反應(yīng)，即樣品中感染有植原體，若無“S”型擴增曲線則判定為陰性；或，在擴增產(chǎn)物中加入1μL顯色液，所述顯色液為1.25mM鈣黃綠素和12.5mM氯化錳混合液，在日光下，肉眼觀察反應(yīng)管中顏色的變化，若擴增產(chǎn)物變?yōu)榇渚G色則判定為陽性反應(yīng)，即樣品中感染有植原體，若擴增產(chǎn)物仍為棕黃色則判定為陰性。

本發(fā)明在GeneBank中搜集不同組植原體16S基因和tuf基因的核酸序列，利用DNAMAN軟件對上述序列進(jìn)行比較及相似性比對，找出泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變(16Sr I組)植原體與其他組植原體的基因差異位點和高度保守區(qū)域，利用LAMP引物在線設(shè)計軟件Primer Explorer V4針對16SrI組植原體16S基因和tuf基因(SEQ ID No.1所示的核苷酸序列組成)保守序列的6個區(qū)域設(shè)計出特異性引物。針對植原體16S基因設(shè)計了6套引物組(I-VI)，針對tuf基因設(shè)計了兩套引物組(⑦和⑧)，利用上述引物組進(jìn)行等溫基因擴增，從擴增結(jié)果中看出I組和⑧組不能實現(xiàn)擴增，III組陰性對照同樣出現(xiàn)擴增。因此棄用I組、III組和⑧組引物。對IV組、V組、VI組和⑦組引物進(jìn)行特異性分析，同時對16SⅠ組的泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑樹萎縮病、長春花綠變和萵苣黃化的發(fā)病與健康組織樣品；16SⅡ組的花生叢枝、甘薯叢枝和臭矢菜叢枝的發(fā)病與健康組織樣品；16SⅤ組的棗瘋病、槐樹叢枝、櫻桃致死黃化和重陽木叢枝的發(fā)病與健康組織樣品；16SXIV組的板栗黃化的發(fā)病與健康組織樣品；以及以滅菌ddH₂O作為陰性對照，進(jìn)行泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑樹萎縮病、長春花綠變和萵苣黃化植原體環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的特異性試驗，結(jié)果表明IV組、V組、VI組引物擴增反應(yīng)極其靈敏，所有樣品均出現(xiàn)擴增，包括病樣品和健康對照。另外，從針對植原體16S基因設(shè)計引物的多次重復(fù)實驗顯示：其結(jié)果極其不穩(wěn)定，極易出現(xiàn)健康對照的污染，因此棄用針對16S基因所設(shè)計的引物。而針對⑦組引物只有16Sr I組的泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑樹萎縮病、長春花綠變和萵苣黃化的發(fā)病組織樣品表現(xiàn)為陽性反應(yīng)，在熒光檢測儀器中出現(xiàn)“S”型擴增曲線，同時肉眼觀察可見顏色變?yōu)榇渚G色，而不同屬的花生叢枝、甘薯叢枝、臭矢菜叢枝、棗瘋病、槐樹叢枝、櫻桃致死黃化、重陽木叢枝、板栗黃化和所有的健康對照均為陰性。由此可見，本發(fā)明由⑦組引物(由SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的核苷酸序列組成外引物對和由SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列組成內(nèi)引物對)建立的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法對16Sr I組的泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑樹萎縮病、長春花綠變和萵苣黃化有較強的特異性，能較好的區(qū)分不同組間的植原體，可用于16Sr I組的泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑樹萎縮病、長春花綠變和萵苣黃化植原體的檢測。

本發(fā)明對LAMP引物組(由SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的核苷酸序列組成外引物對和由SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列組成內(nèi)引物對)所建立的泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變植環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法的穩(wěn)定性和靈敏度進(jìn)行了檢測檢驗。

穩(wěn)定性檢測表明：來自不同地方泡桐叢枝病樣品均能表現(xiàn)為陽性反應(yīng)，在熒光檢測儀器中出現(xiàn)“S”型擴增曲線，同時肉眼觀察可見顏色變?yōu)榇渚G色，由此說明，本發(fā)明建立的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法具有較好的穩(wěn)定性。

靈敏度檢驗表明：常規(guī)PCR經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品在稀釋到2^-10的時候達(dá)到檢測限度；本發(fā)明環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法在稀釋到2^-13時檢測結(jié)果仍為陽性(在熒光檢測儀器中出現(xiàn)“S”型擴增曲線，同時肉眼觀察可見顏色變?yōu)榇渚G色)。由此說明，本發(fā)明建立的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法的靈敏度比常規(guī)PCR高8倍。

本發(fā)明還公開了LAMP引物組在泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變植原體的早期診斷和病原菌的監(jiān)測與鑒定中的應(yīng)用。

本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果：

(1)快速高效：整個擴增只需40～60min即可完成。

(2)操作簡便：不需要復(fù)雜的儀器，不需要特殊的試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA變性等步驟，只需一部恒定溫度儀就能完成檢測。

(3)高特異性：所用的特異性引物針對植原體tuf基因中6個不同區(qū)域設(shè)計，特異性強，對16Sr V組的棗瘋病、16Sr II組的花生叢枝病以及16Sr XIV組的板栗黃化等均不能發(fā)生擴增。

(4)靈敏度高：相比于普通PCR，其檢測靈敏度提高了8倍以上。

總之，本發(fā)明將LAMP等溫擴增技術(shù)應(yīng)用于泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變植原體檢測上，對此類病害的早期預(yù)警、疫區(qū)的病原監(jiān)測等方面具有重要意義，同時可以免除高昂的儀器投入，適合于基層推廣使用。

本發(fā)明所涉及的術(shù)語定義

除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。

術(shù)語“引物”意指一小段單鏈DNA，作為DNA復(fù)制的起始點，在核酸合成反應(yīng)時，作為每個多核苷酸鏈進(jìn)行延伸的出發(fā)點而起作用的多核苷酸鏈。

術(shù)語“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”，簡稱PCR，意指一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大擴增特定的DNA片段，PCR是利用DNA在體外95℃高溫時變性會變成單鏈，低溫(經(jīng)常是60℃左右)時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度(72℃左右)，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'→3')的方向合成互補鏈。

術(shù)語“環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法”，簡稱LAMP，是2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(63℃左右)保溫30－60分鐘，即可完成核酸擴增反應(yīng)。

附圖說明

圖1為泡桐叢枝病植原體環(huán)介導(dǎo)等溫擴增產(chǎn)物的實時熒光檢測結(jié)果：其中，陽性為LAMP擴增試劑盒自帶陽性對照，陰性為LAMP擴增試劑盒自帶陰性對照，PaWB為泡桐叢枝病樣品，PH為健康泡桐樣品；

圖2為泡桐叢枝病植原體環(huán)介導(dǎo)等溫擴增產(chǎn)物的顏色反應(yīng)檢測結(jié)果：其中，陽性為LAMP擴增試劑盒自帶陽性對照，陰性為LAMP擴增試劑盒自帶陰性對照，PaWB為泡桐叢枝病樣品，PH為健康泡桐樣品；

圖3為引物組(I-VI)和引物組(⑦和⑧)的LAMP擴增產(chǎn)物的實時熒光檢測結(jié)果；

圖4為II組引物的序列比對結(jié)果；其中A為引物PaWBⅡ-F3的序列比對結(jié)果；B為引物PaWBⅡ-B3的序列比對結(jié)果；

圖5為IV組引物的序列比對結(jié)果；其中A為引物PaWBⅣ-F3的序列比對結(jié)果；B為引物PaWBⅣ-B3的序列比對結(jié)果；

圖6引物組IV的LAMP擴增特異性驗證的實時熒光檢測結(jié)果；

圖7為V組引物的序列比對結(jié)果；其中A為引物PaWBV-F3的序列比對結(jié)果；B為引物PaWBV-B3的序列比對結(jié)果；

圖8引物組V組的LAMP擴增特異性驗證的實時熒光檢測結(jié)果；

圖9為VI組引物的序列比對結(jié)果；其中A為引物PaWBVI-F3的序列比對結(jié)果；B為引物PaWBVI-B3的序列比對結(jié)果；

圖10為引物組VI組的LAMP擴增特異性驗證的實時熒光檢測結(jié)果；

圖11為⑦組引物的序列比對結(jié)果；其中A為引物PaWBVI-F3的序列比對結(jié)果；B為引物PaWBVI-B3的序列比對結(jié)果；

圖12引物組⑦組的LAMP擴增特異性驗證的實時熒光檢測結(jié)果；

圖13為引物組⑦組的LAMP擴增特異性驗證的顏色反應(yīng)檢測結(jié)果：其中，1：泡桐叢枝，2：苦楝叢枝，3：桑樹萎縮，4：長春花綠變，5：萵苣黃化，6：花生叢枝，7：甘薯叢枝，8：臭矢菜叢枝，9：棗瘋病，10：重陽木叢枝，11：櫻桃致死黃化，12：紅花槐叢枝，13：板栗黃化，14：健康泡桐，15：健康苦楝，16：健康桑樹，17：健康長春花，18：健康萵苣，19：健康花生，20：健康甘薯，21：健康臭矢菜，22：健康棗樹，23：健康重陽木，24：健康櫻桃，25：健康槐樹，26：健康板栗，CK：空白對照；

圖14為LAMP擴增穩(wěn)定性驗證的實時熒光檢測結(jié)果：其中，陽性為LAMP擴增試劑盒自帶陽性對照，陰性為LAMP擴增試劑盒自帶陰性對照，28：北京泡桐叢枝病樣品，84：福建福州泡桐叢枝病病樣品，95：遼寧大連泡桐叢枝病樣品，96：河北保定泡桐叢枝病樣品，97：貴州貴陽泡桐叢枝病樣品，98：河南開封泡桐叢枝病樣品，PH：為健康泡桐樣品；

圖15為LAMP擴增穩(wěn)定性驗證的顏色反應(yīng)檢測結(jié)果：其中，陽性為LAMP擴增試劑盒自帶陽性對照，陰性為LAMP擴增試劑盒自帶陰性對照，28：北京泡桐叢枝病樣品，84：福建福州泡桐叢枝病病樣品，95：遼寧大連泡桐叢枝病樣品，96：河北保定泡桐叢枝病樣品，97：貴州貴陽泡桐叢枝病樣品，98：河南開封泡桐叢枝病樣品，PH：為健康泡桐樣品；

圖16為常規(guī)PCR1％瓊脂糖凝膠電泳檢測靈敏度：其中，泳道M為4500bp的DNA Maker，其余泳道為采用二倍梯度稀釋DNA作為模板的擴增情況；

圖17為LAMP擴增靈敏度試驗的實時熒光檢測結(jié)果：其中，-10～-18為采用二倍梯度稀釋DNA作為模板的擴增情況，CK為滅菌ddH₂O對照；

圖18為LAMP擴增靈敏度試驗的顏色反應(yīng)檢測結(jié)果：其中，2^-10～2^-18為采用二倍梯度稀釋DNA作為模板的擴增情況，CK為滅菌ddH₂O對照。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

1、試劑來源

植物基因組提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit)購自艾德萊生物科技有限公司；

核酸擴增試劑盒購自廣州迪澳生物科技有限公司；

2×PCR預(yù)混液購自博邁德生物科技有限公司。

實施例1泡桐叢枝病植原體環(huán)介導(dǎo)等溫擴增快速檢測方法的建立

1.植物總DNA的提取

采用植物基因組提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit，艾德萊生物科技有限公司)提取待測植物總DNA，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.LAMP擴增

反應(yīng)體系：總體積45μL，包含有：10μM PaWB3-F3 0.5μL，10μM PaWB3-B3 0.5μL，40μM PaWB3-FIP 1μL，40μM PaWB3-BIP 1μL，LAMP反應(yīng)液RM(2×)12.5μL，8U/μLBst DNA聚合酶1μL，熒光染料10×SYBR GreenⅠ0.5μL，待測樣品DNA 0.5μL，用超純水補齊到25μL，同時加入20μL密封液。

反應(yīng)條件：將配置好的反應(yīng)管混勻后離心，置于63℃恒溫反應(yīng)60min，80℃滅活5min。

3.擴增結(jié)果判定

每次檢測，設(shè)置陰陽性對照，在陰性對照和陽性對照均成立時，整個實驗有效，可判定結(jié)果。

LAMP反應(yīng)結(jié)果的判定：如圖1所示，將反應(yīng)管置于恒溫?zé)晒鈾z測儀或者熒光PCR儀中，實時讀取熒光信號，若出現(xiàn)“S”型擴增曲線則判定為陽性反應(yīng)，即樣品中感染有植原體，若無“S”型擴增曲線則判定為陰性?；蛘咄ㄟ^肉眼觀察反應(yīng)管中顏色的變化(圖2)，反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)混合液中加入1μL顯色液，若擴增產(chǎn)物變?yōu)榇渚G色則判定為陽性反應(yīng)，即樣品中感染有植原體，若擴增產(chǎn)物仍為棕黃色則判定為陰性。該結(jié)果與普通PCR檢測結(jié)果吻合，證明此方法數(shù)據(jù)可靠。

實驗例2引物的制備與初步篩選

1、實驗方法

1.1引物設(shè)計與合成

在GeneBank中搜集不同組植原體16S基因和tuf基因的核酸序列，利用DNAMAN軟件對上述序列進(jìn)行比較及相似性比對，找出泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變(16Sr I組)植原體與其他組植原體的基因差異位點和高度保守區(qū)域，利用LAMP引物在線設(shè)計軟件Primer Explorer V4針對16SrI組植原體16S基因和tuf基因保守序列的6個區(qū)域設(shè)計出特異性引物。其中，針對植原體16S基因設(shè)計了6套引物組(I-VI)，針對tuf基因設(shè)計了兩套引物組(⑦和⑧)，結(jié)果見表1，引物由上海生工生物工程公司按照HPLC純度級別合成。

表1 PCR引物序列

1.2引物的初步篩選

1.2.1植物總DNA的提取

參照實施例1。

1.2.2LAMP擴增

參照實施例1。

1.2.3擴增結(jié)果判定

參照實施例1。

2、實驗結(jié)果

擴增結(jié)果見圖3，從圖中可以看出：I組和⑧組不能實現(xiàn)擴增，III組陰性對照同樣出現(xiàn)擴增。因此棄用I組、III組和⑧組引物。而II組、IV組、V組、VI組和⑦組引物均出現(xiàn)了陽性擴增，同時陰性對照未出現(xiàn)擴增。

實施例3特異性檢驗

1、試驗方法

按照上述實施例1所建立的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)體系，同時對16SⅠ組的泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑樹萎縮病、長春花綠變和萵苣黃化的發(fā)病與健康組織樣品；16SⅡ組的花生叢枝、甘薯叢枝和臭矢菜叢枝的發(fā)病與健康組織樣品；16SⅤ組的棗瘋病、槐樹叢枝、櫻桃致死黃化和重陽木叢枝的發(fā)病與健康組織樣品；16SXIV組的板栗黃化的發(fā)病與健康組織樣品；以及以滅菌ddH₂O作為陰性對照，進(jìn)行泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑樹萎縮病、長春花綠變和萵苣黃化植原體環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的特異性試驗。

分別提取16SⅠ組的泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑樹萎縮病、長春花綠變和萵苣黃化的發(fā)病與健康組織樣品；16SⅡ組的花生叢枝、甘薯叢枝和臭矢菜叢枝的發(fā)病與健康組織樣品；16SⅤ組的棗瘋病、槐樹叢枝、櫻桃致死黃化和重陽木叢枝的發(fā)病與健康組織樣品；16SXIV組的板栗黃化的發(fā)病與健康組織樣品植物總DNA以及滅菌ddH₂O作為模板。

按照上述實施例1中所提供的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)。所用引物分別為：IV組、V組、VI組和⑦組引物。

按照上述實施例1中所提供的LAMP擴增結(jié)果判定方法進(jìn)行結(jié)果判定。

2、試驗結(jié)果

針對IV組(引物序列的比對見圖5)、V組(引物序列的比對見圖7)、VI組引物(引物序列的比對見圖9)，結(jié)果如圖6、8、10所示，從圖中可以看出：擴增反應(yīng)極其靈敏，所有樣品均出現(xiàn)擴增，包括病樣品和健康對照。

另外，從針對植原體16S基因設(shè)計引物的多次重復(fù)實驗顯示：其結(jié)果極其不穩(wěn)定，極易出現(xiàn)健康對照的污染，因此棄用針對16S基因所設(shè)計的引物。

針對⑦組引物(引物序列的比對見圖11)，結(jié)果如圖12和13所述，從圖中可以看出：只有16Sr I組的泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑樹萎縮病、長春花綠變和萵苣黃化的發(fā)病組織樣品表現(xiàn)為陽性反應(yīng)，在熒光檢測儀器中出現(xiàn)“S”型擴增曲線，同時肉眼觀察可見顏色變?yōu)榇渚G色，而不同屬的花生叢枝、甘薯叢枝、臭矢菜叢枝、棗瘋病、槐樹叢枝、櫻桃致死黃化、重陽木叢枝、板栗黃化和所有的健康對照均為陰性，由此可見，本發(fā)明⑦組引物建立的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法對16Sr I亞組的泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑樹萎縮病、長春花綠變和萵苣黃化有較強的特異性，能較好的區(qū)分不同組間的植原體，可用于16Sr I組的泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑樹萎縮病、長春花綠變和萵苣黃化植原體的檢測。

實施例4穩(wěn)定性檢驗

1、試驗方法

按照上述實施例1所建立的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)體系，同時對來自不同地區(qū)泡桐叢枝病發(fā)病樣品，以及以健康泡桐作為陰性對照，進(jìn)行泡桐叢枝植原體環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的穩(wěn)定性試驗。

分別提取來自不同地區(qū)泡桐叢枝病發(fā)病樣品和健康泡桐的植物組織總DNA作為模板。

按照上述實施例1中所提供的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)。

按照上述實施例1中所提供的LAMP擴增結(jié)果判定方法進(jìn)行結(jié)果判定。

2、試驗結(jié)果

判斷結(jié)果如圖14、圖15所示，來自不同地方泡桐叢枝病樣品均能表現(xiàn)為陽性反應(yīng)，在熒光檢測儀器中出現(xiàn)“S”型擴增曲線，同時肉眼觀察可見顏色變?yōu)榇渚G色，由此說明，本發(fā)明建立的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法具有較好的穩(wěn)定性。

實施例5靈敏度檢驗

1、試驗方法

采用植物基因組提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit，艾德萊生物科技有限公司)提取泡桐叢枝病發(fā)病植株的葉片總DNA，以此做為模板，用滅菌ddH₂O進(jìn)行二倍梯度稀釋，按照上述實施例2中的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增，同時進(jìn)行常規(guī)PCR進(jìn)行靈敏度比較。

常規(guī)PCR檢測：以二倍梯度稀釋的DNA為模板，用植原體通用引物R16mF2/R16mR1進(jìn)行PCR擴增。常規(guī)PCR擴增體系為25μL，擴增反應(yīng)體系中含有制備的DNA模板1μL，正反向引物各0.5μL(10μM)，2×PCR預(yù)混液(0.05U/μLTaq DNA聚合酶,4mM MgCl₂和0.4mM dNTPs)12.5μL，ddH₂O補至25μL。反應(yīng)程序：94℃5min；94℃45s,52℃45s,72℃1min,共35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2、試驗結(jié)果

常規(guī)PCR經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖16所示，樣品在稀釋到2^-10的時候達(dá)到檢測限度。而如圖17、圖18所示環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法在稀釋到2^-13時檢測結(jié)果仍為陽性(在熒光檢測儀器中出現(xiàn)“S”型擴增曲線，同時肉眼觀察可見顏色變?yōu)榇渚G色)。由此說明，本發(fā)明建立的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法的靈敏度比常規(guī)PCR高8倍。