本發(fā)明涉及聚乙烯亞胺衍生物，尤其涉及維生素E修飾的聚乙烯亞胺衍生物及其合成方法，本發(fā)明還涉及該維生素E修飾的聚乙烯亞胺衍生物作為基因輸送載體的應(yīng)用，屬于聚乙烯亞胺衍生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：基因治療可用于治療包括癌癥、艾滋病、心血管病、傳染性疾病等在內(nèi)的各種獲得性和遺傳性疾病?；蛑委熛鄬?duì)其它治療方法有著若干優(yōu)勢(shì)，但在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中也面臨著一些挑戰(zhàn)。因此，基因輸送載體對(duì)于基因治療來(lái)說(shuō)是十分必要的。目前開(kāi)發(fā)基因輸送載體的策略主要分為病毒和非病毒介導(dǎo)的輸送系統(tǒng)。病毒載體具有非常高的輸送效率并且可以保證基因的長(zhǎng)期表達(dá)，因此是目前臨床上應(yīng)用最多的載體。但病毒載體在臨床使用過(guò)程中也暴露出了許多缺陷，這些缺陷大大限制了病毒載體的應(yīng)用。為了克服病毒載體的諸多不足，近些年來(lái)非病毒載體得到了迅速發(fā)展。這其中就包括研究最廣泛的非病毒載體聚乙烯亞胺。聚乙烯亞胺(PEI)是一種很常見(jiàn)的人工合成水溶性聚合物，它在廢水處理和造紙業(yè)中有著非常廣泛的應(yīng)用。根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，PEI聚合物大致可以分為支鏈PEI和直鏈PEI。與直鏈PEI相比，多分支的PEI能夠與DNA形成結(jié)合更緊密和顆粒更小的復(fù)合物。支鏈PEI與DNA的復(fù)合與直鏈高分子量PEI相比較對(duì)緩沖條件的依賴性更小，而直鏈高分子量PEI與DNA的復(fù)合很大程度上取決于緩沖條件。實(shí)驗(yàn)證明在高離子強(qiáng)度溶液中直鏈PEI(22kDa)與DNA復(fù)合可以形成較大尺寸的復(fù)合物(1μm)，而在5％葡萄糖中，觀察到形成的復(fù)合物尺寸是30-60nm。PEI是最好的體外轉(zhuǎn)染試劑之一并且已經(jīng)被一些研究工作者當(dāng)成聚合物類基因轉(zhuǎn)染試劑的“金標(biāo)準(zhǔn)”。PEI的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性主要受其分子量、支化程度、表面電勢(shì)和粒徑的影響。隨著分子量的升高，支鏈PEI轉(zhuǎn)染效率升高；然而，細(xì)胞毒性也同時(shí)升高。為了消除或降低與PEI有關(guān)的細(xì)胞毒性，目前已經(jīng)發(fā)展出了多種不同的策略。[49-51]這些策略主要包括使用直鏈高分子量PEI，用多糖、親水性聚合物(如PEG)、二硫鍵連接臂、脂質(zhì)基團(tuán)等取代或連接高分子量和低分子量的支鏈PEI(KoYT,KaleA,HartnerWC,Papahadjopoulos-SternbergB,TorchilinVP.JControlRelease.2009；133:132-8.GodbeyWT,WuKK,MikosAG.Sizematters:JBiomedMaterRes.1998；45:268-75.GraysonAC,DoodyAM,PutnamD.PharmRes.2006；23:1868-76.)。目前PEI及其衍生物已經(jīng)應(yīng)用于體內(nèi)的核酸輸送并且在癌癥治療等領(lǐng)域取得了令人滿意的結(jié)果。有若干研究資料都涉及到通過(guò)PEI衍生物向體內(nèi)輸送核酸來(lái)達(dá)到治療目的。這些衍生物包括多糖連接的PEI或交聯(lián)的PEI納米粒。研究表明使用諸如硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸或葡聚糖等多糖修飾支鏈PEI(MW25kDa)可使聚合物毒性降低，從而改善其體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率?；谥辨淧EI的轉(zhuǎn)染試劑在市場(chǎng)上已經(jīng)可以買到(例如ExGen500、jetPEI)。市場(chǎng)上銷售的PEI分子量范圍非常廣泛，從1000Da以下到1.6×103kDa都有。通常認(rèn)為最適用于基因輸送的PEI的分子量在5kDa和25kDa范圍內(nèi)。PEI的轉(zhuǎn)染效率隨著分子量的增加而升高，但毒性也隨之增加。25kDaPEI與1.8kDaPEI相比轉(zhuǎn)染效率高上百倍，但毒性也顯著增加。有若干研究證明，通過(guò)用小分子化合物對(duì)低分子量的PEI進(jìn)行修飾可以顯著提高轉(zhuǎn)染效率而保持較低的毒性。例如，用膽固醇、磷脂、脂肪酸和硫辛酸等疏水性小分子修飾的PEI轉(zhuǎn)染效率都比修飾前的提高數(shù)十倍到數(shù)百倍，而毒性也有不同程度的降低。在科學(xué)家發(fā)現(xiàn)聚乙烯亞胺(PEI)的基因輸送功能之后的幾十年來(lái)，有大量的研究表明對(duì)PEI進(jìn)行疏水性修飾可以很好的提高轉(zhuǎn)染效率并且降低細(xì)胞毒性。原因是多方面的，其中的主要原因可能是疏水性修飾不僅可以使聚合物更好的壓縮DNA，使DNA分子變得更致密緊湊同時(shí)還可以增強(qiáng)聚合物/DNA復(fù)合物與細(xì)胞表面的結(jié)合，從而促進(jìn)內(nèi)吞作用，使DNA更有效的進(jìn)入細(xì)胞。目前文獻(xiàn)中常見(jiàn)的修飾基團(tuán)主要是一些天然小分子疏水化合物，如膽固醇、磷脂等。維生素E是一種脂溶性化合物，它包括生育酚和生育三烯酚，其中α-生育酚是自然界中分布最廣泛、含量最豐富并且活性最高的維生素E形式。維生素E的生物功能除了最熟知的抗氧化功能之外，還涉及酶活性的調(diào)節(jié)、基因表達(dá)調(diào)控以及神經(jīng)生物學(xué)功能等。通過(guò)消化道吸收進(jìn)入血漿的維生素E經(jīng)受體介導(dǎo)進(jìn)入肝細(xì)胞，進(jìn)入肝細(xì)胞的維生素E又在維生素E結(jié)合蛋白的運(yùn)輸下進(jìn)入肝外組織。維生素E本身的疏水性質(zhì)、豐富的生物調(diào)節(jié)功能以及其受體介導(dǎo)的肝細(xì)胞攝取方式都預(yù)示著用它來(lái)修飾PEI很可能取得意想不到的效果。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一是提供一種維生素E修飾的聚乙烯亞胺衍生物，所得到的衍生物作為基因輸送載體具有毒性低、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的目的之二是提供一種合成上述維生素E修飾的聚乙烯亞胺衍生物的方法為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：本發(fā)明首先公開(kāi)了一種式Ⅰ所示的維生素E修飾的聚乙烯亞胺衍生物：其中，m或n為任意的整數(shù)；優(yōu)選的，m為1至60的任意整數(shù)，n為1至60的任意整數(shù)；更優(yōu)選的，m為4，n為2，4或6；或者m為54，n為10，20或40。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種合成上述式Ⅰ所示的維生素E修飾的聚乙烯亞胺衍生物，該方法包括：(1)向維生素E中引入羧基得到vitE-COOH；(2)用CDI(N,N-羰基二咪唑)活化vitE-COOH得到活化酯；(3)活化酯直接與PEI進(jìn)行反應(yīng)，得到維生素E修飾的PEI衍生物。優(yōu)選的，步驟(1)向維生素E中引入羧基的方法包括：將維生素E(vitE)和2-溴乙醇進(jìn)行取代反應(yīng)合成vitE-OH；將vitE-OH與己二酸進(jìn)行偶聯(lián)，將羧基引入到維生素E上得到vitE-COOH。優(yōu)選的，步驟(2)中，在室溫下，用CDI活化溶于無(wú)水DCM和TEA中的vitE-COOH得到活化活化酯；其中，所述的室溫可以為15-30℃，優(yōu)選為25℃。步驟(3)中活化酯與PEI在室溫下進(jìn)行反應(yīng)，所述的室溫可以為15-30℃，優(yōu)選為25；為了達(dá)到更好的效果，優(yōu)選的，將反應(yīng)產(chǎn)物旋蒸除去溶劑，將殘余物溶于蒸餾水得到水溶液，將反應(yīng)產(chǎn)物的水溶液pH值調(diào)節(jié)到8-9后進(jìn)行透析并冷凍干燥，得到維生素E修飾的PEI衍生物。為了在PEI上連接不同數(shù)目的維生素E，考慮向維生素E化學(xué)結(jié)構(gòu)中引入羧基，最終通過(guò)該路線順利合成出不同數(shù)目維生素E修飾的PEI衍生物。本發(fā)明最終在綴合反應(yīng)之后用稀鹽酸將所得PEI衍生物水溶液的pH調(diào)節(jié)到8-9，通過(guò)透析、冷凍干燥之后獲得PEI衍生物的鹽酸鹽。通過(guò)控制合成原料之間的比例(即vitE-COOH:PEI投料比)可得到不同數(shù)目維生素E修飾的PEI衍生物。本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)核磁共振氫譜和元素分析對(duì)具體的維生素E數(shù)目進(jìn)行了定量。本發(fā)明通過(guò)1HNMR、FTIR和元素分析對(duì)所得維生素E修飾的PEI衍生物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，確證所得產(chǎn)物即為目標(biāo)產(chǎn)物。本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)多種手段對(duì)合成得到的PEI衍生物的性能進(jìn)行了表征，包括PEI衍生物的緩沖能力、PEI衍生物與DNA的結(jié)合能力、PEI衍生物在核酸酶環(huán)境和血清環(huán)境對(duì)DNA的保護(hù)作用、復(fù)合物粒徑及表面電勢(shì)等方面的表征。通過(guò)表征實(shí)驗(yàn)證明，在每個(gè)PEI上連接不同數(shù)目的維生素E沒(méi)有明顯影響PEI的緩沖能力以及與pDNA的結(jié)合，相反，維生素E的修飾還有利于pDNA的釋放。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示這些PEI-vitEn隨著PEI上的維生素E飾數(shù)目的增加而降低。本發(fā)明進(jìn)一步對(duì)PEI衍生物的基因輸送性能進(jìn)行研究表明，維生素E的修飾能夠大大增加DNA質(zhì)粒的細(xì)胞攝取以及蛋白的表達(dá)。通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)，在這些PEI-vitEn當(dāng)中，每個(gè)PEI1.8平均連接6.7個(gè)vitE的PEI-vitE6顯示出最佳的質(zhì)粒攝取和基因表達(dá)性能，基因表達(dá)效果大大超過(guò)PEI25對(duì)照并且接近Lipo2000的轉(zhuǎn)染水平。共定位和抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，PEI-vitEn/pDNA的攝取機(jī)制是受體蛋白介導(dǎo)的。此外，本發(fā)明通過(guò)進(jìn)一步的體內(nèi)研究顯示PEI-vitE6可以成功地將pDNA輸送到小鼠的肝臟和肺臟中，并且PEI-vitE6/pDNA復(fù)合物能夠進(jìn)入肝臟和肺臟細(xì)胞，還能夠進(jìn)一步釋放質(zhì)粒DNA用于基因表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所合成的維生素E修飾聚乙烯亞胺是一種低毒、高效、可用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染試劑。附圖說(shuō)明圖1本發(fā)明維生素E修飾的聚乙烯亞胺衍生物的合成路線圖。圖2PEI1.8、vitE-COOH和PEI-vitEn的1HNMR圖譜；根據(jù)相應(yīng)信號(hào)峰的積分面積可以計(jì)算出每個(gè)PEI上修飾的維生素E的數(shù)目。圖3PEI25、vitE-COOH和PEI25-vitEn的1HNMR圖譜。圖4利用酸堿滴定法測(cè)得的PEI25和PEI25-vitEn緩沖曲線；生理pH范圍為5.1-7.4，通過(guò)這個(gè)范圍內(nèi)消耗的滴定劑體積可以計(jì)算出聚合物的緩沖容量。圖5N/P比在0.25至3范圍內(nèi)進(jìn)行的PEI25/pDNA和PEI25-vitEn/pDNA復(fù)合物的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)。圖6DNA釋放實(shí)驗(yàn)。在N/P比為2時(shí)形成PEI25-vitEn/pDNA復(fù)合物，與帶負(fù)電的肝素孵育30min，重量比肝素/pDNA重量比分別為0、1、2、4、8和16。使用25kDaPEI作為對(duì)照。圖7通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)定的不同N/P比(1.25、5、10、15、20、25)的PEI25-vitEn/pDNA復(fù)合物的平均粒徑(a)和表面電勢(shì)(b)，未修飾的25kDaPEI作為對(duì)照。圖8利用酸堿滴定法測(cè)得的PEI1.8、PEI25和PEI-vitEn緩沖曲線；生理pH范圍為5.1-7.4，通過(guò)這個(gè)范圍內(nèi)消耗的滴定劑體積可以計(jì)算出聚合物的緩沖容量，使用150mMNaCl作為空白對(duì)照。圖9A:N/P比在0.25至3范圍內(nèi)進(jìn)行的PEI1.8/pDNA和PEI-vitEn/pDNA復(fù)合物的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)；泳道0中僅加入裸pDNA作為對(duì)照；B:DNA釋放實(shí)驗(yàn)；在N/P比為3時(shí)形成PEI-vitEn/pDNA復(fù)合物，與帶負(fù)電的肝素孵育30min，重量比肝素/pDNA重量比分別為0、1、2、4、8和16；使用1.8kDaPEI作為對(duì)照。圖10PEI-vitE6對(duì)核酸酶或血清的保護(hù)作用；泳道1：裸DNA；泳道2：PEI-vitE6/pDNA(N/P＝2)；泳道3：pDNA與核酸酶I或10％血清孵育2小時(shí)；泳道4：PEI-vitE6/pDNA與核酸酶I或10％血清孵育2小時(shí)；泳道5：PEI-vitE6/pDNA用肝素處理；泳道6：PEI-vitE6/pDNA與核酸酶或10％血清孵育2小時(shí)，接著在65℃孵育10min以滅活核酸酶并隨后用肝素處理。圖11通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)定的不同N/P比(1.25、5、10、15、20、25)的PEI-vitEn/pDNA復(fù)合物的平均粒徑(a)和表面電勢(shì)(b)，未修飾的1.8kDaPEI作為對(duì)照；(c)N/P＝20的PEI-vitE6/pDNA復(fù)合物的粒徑分布，(d)N/P＝20的PEI-vitE6/pDNA復(fù)合物的表面電勢(shì)。圖12N/P比為20的PEI-vitE6/pDNA復(fù)合物的AFM圖片；(a)3D圖像；(b)2D圖像；(c)圖像(b)中白線指示的橫截面的高度圖。圖13采用SRB實(shí)驗(yàn)考察PEI-vitEn聚合物對(duì)HEK-293A細(xì)胞的毒性，PEI1.8和PEI25作為對(duì)照。圖14通過(guò)高內(nèi)涵成像的GFP基因表達(dá)；將HEK-293A細(xì)胞接種到6孔板中并且孵育24小時(shí)，在不同N/P比的條件下進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，使用Lipo2000(2μL)作為對(duì)照。a)高內(nèi)涵成像的GFP基因表達(dá)，標(biāo)尺是200μm。b)通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)量的GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。圖15體外基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)實(shí)驗(yàn)：(A)PEI-vitEn(n＝2,4,6)攜帶的GFP基因在HEK-293A細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率(N/P＝20)，使用Lipo2000、PEI1.8和PEI25(N/P＝10)作為對(duì)照，比例尺＝200μm.(B)以GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)值采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)GFP基因的表達(dá)效率進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)N/P＝10和20時(shí)，PEI-vitE和PEI1.8的基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果；實(shí)驗(yàn)中使用Lipo2000、和PEI25(N/P＝10)作為對(duì)照；(C)PEI25和PEI-vitE6在不同細(xì)胞系(A375、HepG2和HEK-293A)的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定的FITC的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行檢測(cè)。圖16小鼠體重變化曲線圖；三組小鼠分別注射PBS、PEI25和PEI-vitE6。注射PEI25的小鼠在24h內(nèi)全部死亡。圖17小鼠尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果；a)pDNA、b)TRITC-PEI25/pDNA和c)TRITC-PEI-vitE6/pDNA經(jīng)過(guò)1小時(shí)之后不同器官的分布情況。圖18小鼠靜脈注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果；a)pDNA、b)PEI25/pDNA和c)PEI-vitE6/pDNA后不同組織中的轉(zhuǎn)染及表達(dá)情況。圖19肝臟組織切片熒光圖像；三只小鼠分別注射pDNA、PEI25/pDNA和PEI-vitE6/pDNA。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1PEI1.8-vitEn衍生物的合成及表征1實(shí)驗(yàn)方法1.1vitE-OH中間體的合成按照文獻(xiàn)方法(ChenW,ParkSK,YuW,XiongA,SandersBG,KlineK.EurJMedChem.2012；58:72-83.)通過(guò)維生素E(vitE)和2-溴乙醇之間的取代反應(yīng)合成vitE-OH，實(shí)際操作過(guò)程中有一些改進(jìn)。具體來(lái)講，首先在25mL無(wú)水DMF中混合vitE(5.0g,1.0eq)、2-溴乙醇(1.1mL,1.25eq)和NaOH(0.7g,1.5eq)并且在90℃下攪拌過(guò)夜。次日將混合物冷卻至室溫，倒入水(100mL)中，用甲基叔丁基醚(50mL×3)萃取所述溶液。合并有機(jī)層并且通過(guò)旋蒸除去溶劑，得到淡黃色殘余物，所述殘余物使用石油醚(PE)和乙酸乙酯(EA)的混合物作為洗脫劑(PE:EA＝5:1)通過(guò)硅膠柱色譜法進(jìn)一步純化，得無(wú)色油狀物。產(chǎn)率：4.5g(81.7％)。1HNMR(δ/ppm,400MHz,CDCl3)4.04-3.93(t,2H,OCH2CH2OH),3.85-3.80(t,2H,OCH2CH2OH),2.61(t,J＝6.7Hz,2H,PhCH2CH2),2.35(brs,1H,OH),2.22(s,3H,CH3),2.18(s,3H,CH3),2.13(s,3H,CH3),1.80(m,2H,PhCH2CH2),1.68-1.02(m,24H),1.00-0.80(m,12H,4×CH3).13CNMR(δ/ppm,101MHz,CDCl3):147.9,147.6,127.7,125.7,123.0,117.6,74.8,73.7,67.9,62.4,40.1,39.4,37.4432.7,31.2,28.0,25.6,24.8,24.4,23.8,22.7,21.0,20.6,19.6,12.7,11.8.MS:理論值:474.41,實(shí)驗(yàn)值:474.69[M]+,497.64[M+Na]+。1.2vitE-COOH中間體的合成vitE-COOH是通過(guò)碳二亞胺化學(xué)方法將己二酸與vitE-OH偶聯(lián)合成的。具體來(lái)講，在0至5℃下，向vitE-OH(3.0g,1.0eq)和己二酸(2.8g,3.0eq)在45mL無(wú)水THF中的溶液中依次加入DCC(2.6g,2.0eq)、DMAP(8.0mg,0.1eq)，并且在室溫下攪拌6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后將白色沉淀過(guò)濾掉,并且旋蒸除去溶劑。將殘余物溶于EA(90mL)，用水洗滌(50mL×2)。有機(jī)層經(jīng)無(wú)水Na2SO4干燥。過(guò)濾并且旋蒸除去溶劑，使用二氯甲烷(DCM)和甲醇(MeOH)的混合物作為洗脫劑通過(guò)硅膠柱色譜法純化殘余物(DCM:MeOH＝200:1,0.5％AcOH)。產(chǎn)率：2.6g(68.3％)。1HNMR(δ/ppm,400MHz,CDCl3)4.51-4.36(t,2H,OCH2CH2OH),3.97-3.83(t,2H,OCH2CH2OH),2.59(t,J＝6.7Hz,2H,PhCH2CH2),2.53-2.36(m,4H,COCH2CH2),2.20(s,3H,CH3),2.16(s,3H,CH3),2.11(s,3H,CH3),1.89-1.01(m,28H),0.97-0.78(m,12H,4×CH3).13CNMR(δ/ppm,101MHz,CDCl3):179.0,173.3,148.0,147.6,127.7,125.7,122.9,117.6,74.8,70.4,63.7,40.0,39.3,37.4,33.8,33.6,32.7,31.2,28.0,24.8,24.4,24.1,23.8,22.7,21.0,20.6,19.6,12.6,11.7.MS:理論值:602.45,實(shí)驗(yàn)值:601.80[M-H]-。1.3PEI-vitEn綴合物的合成PEI-vitEn(n＝2、4和6)綴合物是由1.8kDaPEI和不同當(dāng)量的vitE-COOH合成的，每個(gè)PEI上修飾的vitE的數(shù)目通過(guò)合成過(guò)程中的vitE-COOH:PEI投料比來(lái)控制。具體來(lái)講，在室溫下，用CDI活化溶于無(wú)水DCM和TEA中的vitE-COOH，反應(yīng)2小時(shí)后，將所述混合物逐滴滴加到1.8kDaPEI的無(wú)水DCM溶液中。在室溫下將所述溶液攪拌3小時(shí)，并且旋蒸除去溶劑。隨后將殘余物溶于蒸餾水(10mL,pH用2MHCl調(diào)節(jié)至8-9)并且在1L燒杯中用蒸餾水透析(MWCO2000Da)24小時(shí)純化，期間換水2次。將透析液在凍干機(jī)上冷凍干燥得到最終產(chǎn)品，化學(xué)式表示為PEI-vitEn·xHCl，進(jìn)一步通過(guò)1HNMR、FTIR和元素分析對(duì)具體組成進(jìn)行確認(rèn)。產(chǎn)率(PEI-vitE2:0.45g,90.3％；PEI-vitE4:0.41g,93.9％；PEI-vitE6:0.44g,97.9％)。1HNMR(δ/ppm,400MHz,MeOD)4.36(PhOCH2CH2O),3.79(PhOCH2CH2O),3.21-2.63(CH2CH2NH),2.57(PhCH2CH2),2.49-2.23(COCH2CH2),2.21-1.94(PhCH3),1.86-0.98(vitE的特征峰),0.88(CH3)。表1PEI-vitEn(n＝2、4和6)的投料比nvitE-COOHTEACDIPEI1.8DCM20.20g,1.0eq0.14mL,3.0eq56.5mg,1.05eq0.30g,0.5eq16mL40.25g,1.0eq0.17mL,3.0eq70.6mg,1.05eq0.19g,0.25eq12mL60.30g,1.0eq0.21mL,3.0eq84.7mg,1.05eq0.15g,0.17eq11mL1.4PEI-vitE6和PEI25的熒光標(biāo)記用四甲基羅丹明-5-(和-6)-異硫氰酸酯(TRITC,Bridgen,λex＝543nm，λem＝571nm)或異硫氰酸熒光素(FITC,BBI,λex＝493nm，λem＝525nm)標(biāo)記PEI-vitE6和PEI25，用于激光掃描共焦顯微鏡或體內(nèi)圖像。對(duì)于聚合物的FITC標(biāo)記，將20mgPEI-vitE6(或PEI25)溶于4mLDMSO并且在室溫下攪拌。向所述聚合物溶液中逐滴滴加FITC在DMSO中的溶液(5mg/mL，125μL)，并且在30℃下攪拌4小時(shí)。獲得的產(chǎn)物用PBS透析(MWCO2000Da)24小時(shí)純化。將透析液稀釋適當(dāng)?shù)氖褂脻舛?500ng/μL)。TRITC的標(biāo)記操作與上述相同。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1PEI-vitEn綴合物的確證及及表征通過(guò)1HNMR波譜確認(rèn)了vitE-COOH與PEI成功綴合。δ3.2-2.6ppm的峰對(duì)應(yīng)于PEI1.8的-CH2CH2NH-基團(tuán)，δ4.4-4.2ppm和δ4.0-3.7ppm歸屬于vitE-COOH中的-OCH2CH2O-，δ2.5-2.2ppm峰對(duì)應(yīng)于己二酸中的-CH2CO-，δ2.2-1.9ppm的峰歸屬于vitE苯環(huán)上的-CH3。在δ2.6-2.5ppm和δ1.8-0.7ppm范圍出現(xiàn)的其它峰歸屬于vitE的特征峰。PEI-vitEn綴合物中存在PEI1.8是通過(guò)δ3.2-2.6ppm區(qū)域中的氫信號(hào)峰證明的。這些結(jié)果都可以表明vitE-COOH與PEI1.8成功連接。還通過(guò)紅外波譜(ThermoFisherNicolet-6700)和元素分析(VarioELIII)分別表征了PEI-vitEn的結(jié)構(gòu)和組成。與vitE-COOH的IR波譜相比，在1645cm-1和1549cm-1處出現(xiàn)兩個(gè)全新的吸收帶，分別是最具特征性的C＝O(酰胺I帶)和N-H(酰胺II帶)。在vitE-COOH的波譜中，在1710cm-1處有COOH伸縮振動(dòng)帶，而在PEI-vitE波譜中這個(gè)帶消失了，表明vitE-COOH的羧基與PEI1.8的胺基成功綴合。在3700-3200cm-1處的寬峰對(duì)應(yīng)于PEI1.8的胺基，在PEI1.8和PEI-vitE波譜中都存在，進(jìn)一步確認(rèn)成功的綴合。PEI1.8骨架上修飾的vitE的數(shù)目以及總分子量是由元素分析結(jié)果計(jì)算得到的，進(jìn)一步通過(guò)1HNMR基于vitE-COOH中的-OCH2CH2O-(4.4-4.2ppm)和PEI1.8質(zhì)子(3.2-2.6ppm)的積分比例對(duì)該結(jié)果進(jìn)行了確認(rèn)，兩種不同方法得當(dāng)?shù)慕Y(jié)果基本一致。實(shí)施例2PEI25-vitEn衍生物的合成及表征1.實(shí)驗(yàn)方法1.1vitE-OH中間體的合成(同PEI1.8)在25mL無(wú)水DMF中混合vitE(5.0g,1.0eq)、2-溴乙醇(1.1mL,1.25eq)和NaOH(0.7g,1.5eq)并且在90℃下攪拌過(guò)夜。次日將混合物冷卻至室溫，倒入水(100mL)中，用甲基叔丁基醚(50mL×3)萃取所述溶液。合并有機(jī)層并且減壓旋蒸除去溶劑，得到淡黃色殘余物，殘余物使用石油醚(PE)和乙酸乙酯(EA)的混合物作為洗脫劑(PE:EA＝5:1)通過(guò)硅膠柱色譜法純化，得無(wú)色油狀物。產(chǎn)率：4.5g(81.7％)。1HNMR(δ/ppm,400MHz,CDCl3)4.04-3.93(t,2H,OCH2CH2OH),3.85-3.80(t,2H,OCH2CH2OH),2.61(t,J＝6.7Hz,2H,PhCH2CH2),2.35(brs,1H,OH),2.22(s,3H,CH3),2.18(s,3H,CH3),2.13(s,3H,CH3),1.80(m,2H,PhCH2CH2),1.68-1.02(m,24H),1.00-0.80(m,12H,4×CH3).13CNMR(δ/ppm,101MHz,CDCl3):147.9,147.6,127.7,125.7,123.0,117.6,74.8,73.7,67.9,62.4,40.1,39.4,37.4432.7,31.2,28.0,25.6,24.8,24.4,23.8,22.7,21.0,20.6,19.6,12.7,11.8.MS:理論值:474.41,實(shí)驗(yàn)值:474.69[M]+,497.64[M+Na]+。1.2vitE-COOH中間體的合成(同PEI1.8)在0至5℃下，向vitE-OH(3.0g,1.0eq)和己二酸(2.8g,3.0eq)在45mL無(wú)水THF中的溶液中依次加入DCC(2.6g,2.0eq)、DMAP(8.0mg,0.1eq)，并且在室溫下攪拌6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后將白色沉淀過(guò)濾掉并且旋蒸除去溶劑。將殘余物溶于EA(90mL)，用水洗滌(50mL×2)。有機(jī)層經(jīng)無(wú)水Na2SO4干燥。過(guò)濾并且旋蒸除去溶劑，使用二氯甲烷(DCM)和甲醇(MeOH)的混合物作為洗脫劑通過(guò)硅膠柱色譜法純化殘余物(DCM:MeOH＝200:1,0.5％AcOH)，得無(wú)色油狀物。產(chǎn)率：2.6g(68.3％)。1HNMR(δ/ppm,400MHz,CDCl3)4.51-4.36(t,2H,OCH2CH2OH),3.97-3.83(t,2H,OCH2CH2OH),2.59(t,J＝6.7Hz,2H,PhCH2CH2),2.53-2.36(m,4H,COCH2CH2),2.20(s,3H,CH3),2.16(s,3H,CH3),2.11(s,3H,CH3),1.89-1.01(m,28H),0.97-0.78(m,12H,4×CH3).13CNMR(δ/ppm,101MHz,CDCl3):179.0,173.3,148.0,147.6,127.7,125.7,122.9,117.6,74.8,70.4,63.7,40.0,39.3,37.4,33.8,33.6,32.7,31.2,28.0,24.8,24.4,24.1,23.8,22.7,21.0,20.6,19.6,12.6,11.7.MS:理論值:602.45,實(shí)驗(yàn)值:601.80[M-H]-。1.3PEI25-vitEn綴合物的合成PEI25-vitEn(n＝10、20和40)綴合物是由25kDaPEI和不同當(dāng)量的vitE-COOH合成的，每個(gè)PEI上修飾的vitE的數(shù)目通過(guò)合成過(guò)程中的vitE-COOH:PEI25投料比來(lái)控制。具體來(lái)講，在室溫下，用CDI活化溶于無(wú)水DCM和TEA中的vitE-COOH，反應(yīng)2小時(shí)后，將所述混合物逐滴滴加到25kDaPEI的無(wú)水DCM溶液中。在室溫下將所述溶液攪拌3小時(shí)，并且旋蒸除去溶劑。隨后將殘余物溶于蒸餾水(10mL,pH用2MHCl調(diào)節(jié)至8-9)并且在1L燒杯中用蒸餾水透析(MWCO8000-12000Da)24小時(shí)，期間換水2次。將透析液在凍干機(jī)上冷凍干燥得到最終產(chǎn)品，化學(xué)式表示為PEI25-vitEn·xHCl，進(jìn)一步通過(guò)1HNMR、FTIR和元素分析對(duì)具體組成進(jìn)行確認(rèn)。產(chǎn)率(PEI25-vitE10:0.36g,87.4％；PEI25-vitE20:0.32g,86.8％；PEI25-vitE40:0.35g,85.9％)。1HNMR(δ/ppm,400MHz,MeOD)4.36(PhOCH2CH2O),3.79(PhOCH2CH2O),3.21-2.63(CH2CH2NH),2.57(PhCH2CH2),2.49-2.23(COCH2CH2),2.21-1.94(PhCH3),1.86-0.98(vitE的特征峰),0.88(CH3)。表2PEI25-vitEn(n＝10、20和40)的投料比nvitE-COOHTEACDIPEI25DCM100.08g,1.0eq0.06mL,3.0eq22.6mg,1.05eq0.33g,0.1eq15mL200.12g,1.0eq0.08mL,3.0eq33.9mg,1.05eq0.25g,0.05eq13mL400.20g,1.0eq0.14mL,3.0eq56.5mg,1.05eq0.21g,0.025eq12mL2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1PEI25-vitEn綴合物的確證及及表征通過(guò)1HNMR確認(rèn)了vitE-COOH與PEI成功綴合。如圖3所示，δ3.2-2.6ppm的峰對(duì)應(yīng)于PEI25的-CH2CH2NH-基團(tuán)，δ4.4-4.2ppm和δ4.0-3.7ppm歸屬于vitE-COOH中的-OCH2CH2O-，δ2.5-2.2ppm峰對(duì)應(yīng)于己二酸中的-CH2CO-，δ2.2-1.9ppm的峰歸屬于vitE苯環(huán)上的-CH3。在δ2.6-2.5ppm和δ1.8-0.7ppm范圍出現(xiàn)的其它峰歸屬于vitE的特征峰。PEI25-vitEn綴合物中存在PEI25是通過(guò)δ3.2-2.6ppm區(qū)域中的氫信號(hào)峰證明的。這些結(jié)果都可以表明vitE-COOH與PEI125成功連接。還通過(guò)紅外波譜(ThermoFisherNicolet-6700)和氫譜分別表征了PEI25-vitEn的結(jié)構(gòu)和組成。與vitE-COOH的IR波譜相比，在1645cm-1和1549cm-1處出現(xiàn)兩個(gè)全新的吸收帶，他們分別是最具特征性的C＝O(酰胺I帶)和N-H(酰胺II帶)。在vitE-COOH的波譜中，在1710cm-1處有COOH伸縮振動(dòng)帶，而在PEI25-vitE波譜中這個(gè)帶消失了，表明vitE-COOH的羧基與PEI25的胺基成功綴合。在3700-3200cm-1處的寬峰對(duì)應(yīng)于PEI25的胺基，在PEI25和PEI-vitE波譜中都存在，進(jìn)一步確認(rèn)成功的綴合。PEI25骨架上修飾的vitE的數(shù)目以及分子量是由核磁共振氫譜的峰面積計(jì)算得到的。通過(guò)計(jì)算，n＝10、20和40的實(shí)際修飾數(shù)目分別為9.9、17.2和40.6。2.2PEI-vitEn綴合物緩沖能力的測(cè)定PEI25-vitEn綴合物和對(duì)照PEI(25kDa)的緩沖能力是按照先前的文獻(xiàn)報(bào)告使用酸堿滴定法測(cè)定的，所測(cè)pH值在2.0至11.0范圍內(nèi)，測(cè)定方法與文獻(xiàn)方法相比稍有變化。具體來(lái)講，首先分別在10mLNaCl溶液(150mM)中分別溶解一定量的修飾和未修飾的PEI(0.2mmol氮原子)。正式滴定前用0.1MHCl將PEI溶液調(diào)節(jié)至起始pH2.0，隨后用0.1MNaOH滴定，每次滴加50μL。使用pH計(jì)(MettlerToledoFE20)監(jiān)測(cè)上述溶液pH值的變化并記錄。所測(cè)聚合物的緩沖能力按照以下公式計(jì)算：緩沖能力(％)＝100×(ΔVNaOH×0.1M)/Nmol其中ΔVNaOH是將PEI溶液的pH值從5.1調(diào)節(jié)至7.4所需要的NaOH溶液(0.1M)的體積，Nmol是所滴定的聚合物中的可質(zhì)子化胺基的總摩爾數(shù)(0.2mmol)。如圖4所示，在生理pH范圍內(nèi)(pH5.1到7.4)，PEI25的緩沖能力為8.0，PEI25-vitE10、PEI25-vitE20、PEI-vitE40的緩沖能力分別為12.5、8.5和10.5。PEI25-vitEn的緩沖能力與PEI25相比變化不大，表明用vitE對(duì)PEI25進(jìn)行的疏水性修飾沒(méi)有明顯地影響其的質(zhì)子化能力。2.3PEI25-vitEn/pDNA復(fù)合物的制備PEI25-vitEn/pDNA復(fù)合物的制備是在PBS或20mMHEPES緩沖液中混合一定量的pDNA儲(chǔ)備溶液和不同量的PEI25-vitEn綴合物完成的。具體來(lái)講，首先向聚合物溶液中加入一定量的pDNA儲(chǔ)備溶液(300ng/μL)，接著渦旋10秒，在室溫下孵育30min即得復(fù)合物溶液。PEI25-vitEn/pDNA的比例是根據(jù)氮/磷(N/P)比計(jì)算的，并且在計(jì)算復(fù)合物中PEI25-vitEn綴合物的量時(shí)將連接在PEI骨架上的vitE的分子量計(jì)算在內(nèi)。類似地，還制備了25kDaPEI/pDNA復(fù)合物作為對(duì)照。2.4瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳可用于研究PEI25-vitEn綴合物的DNA結(jié)合能力。實(shí)驗(yàn)中首先制備N/P比從0.25到3.0(0.25、0.5、1、2、3)并且含有300ngpDNA的PEI25-vitEn/pDNA復(fù)合物，最終體積為10μL。渦旋混合10秒，靜置30分鐘之后，將這些復(fù)合物各自與2μL6×DNA上樣緩沖液混合并且加載到預(yù)先制備的含有溴化乙錠(0.5mg/mL)的0.8％瓊脂糖凝膠上，瓊脂糖凝膠在80V下用Tris-醋酸鹽(TAE)跑45min。跑好的凝膠在ChemiDocXRS成像系統(tǒng)(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)中觀察DNA條帶并且拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為圖5所示，vitE修飾對(duì)PEI25的DNA結(jié)合能力影響很小，其中PEI25-vitE10、PEI25-vitE20和PEI25-vitE40分別在N/P比為1、2和2時(shí)完全阻滯DNA遷移，而未修飾的25kDaPEI完全抑制DNA遷移的N/P比是2。從圖5中可以看出，維生素E的修飾對(duì)PEI25與DNA結(jié)合能力的影響比PEI1.8要小。為了研究vitE修飾對(duì)DNA從復(fù)合物中釋放的影響，用肝素進(jìn)行復(fù)合物中DNA的競(jìng)爭(zhēng)性置換。肝素是一種富含陰離子的聚合物，它可以將DNA從復(fù)合物中置換出來(lái)。對(duì)于本研究來(lái)說(shuō)，按照如上所述的方法制備N/P比為2的PEI25-vitEn/pDNA復(fù)合物。向復(fù)合物中加入不同量的肝素(肝素/pDNA＝0、1、2、4、8和16，w/w)。在37℃孵育30min之后，將樣品按照上述條件進(jìn)行電泳并且進(jìn)行成像。同時(shí)制備PEI25/pDNA作為對(duì)照。如圖6所示，從圖上可以看到未修飾的PEI25復(fù)合物隨著肝素的增加有少量DNA釋放，而所有維生素E修飾的復(fù)合物幾乎沒(méi)有DNA釋放，這與此前維生素E修飾的PEI1.8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，有可能是因?yàn)镻EI25的分子量比PEI1.8大得多而與DNA結(jié)合更為牢固的原因。2.5PEI25-vitE/pDNA復(fù)合物粒徑和電勢(shì)的測(cè)定PEI25-vitEn/pDNA復(fù)合物的尺寸和表面電荷是兩個(gè)重要因素，它們可以顯著地影響復(fù)合物在不同細(xì)胞和組織中的攝取和分布以及細(xì)胞毒性、生物相容性和被動(dòng)靶向作用。本實(shí)驗(yàn)中聚合物/pDNA復(fù)合物的粒徑和表面電勢(shì)是使用ZetasizerNanoZS粒度儀(MalvernInstrument)在25℃下測(cè)量得到的?；谥暗哪z阻滯實(shí)驗(yàn)，測(cè)量之前，按照如上所述的方法制備N/P比在1.25至25范圍內(nèi)(1.25、5、10、15、20、25)的聚合物/pDNA復(fù)合物溶液，每個(gè)樣品中含pDNA約600ng，最終體積為100μL。將上述復(fù)合物樣品分別在1.0mL的20mMHEPES緩沖液中稀釋、震蕩均勻并且盡快測(cè)量。測(cè)量時(shí)樣品的最終濃度為1-20μg/mL。從圖7中的測(cè)量結(jié)果可以看到，在N/P比為2.5及以上的N/P比下，所有PEI25-vitEn綴合物都可以有效地將DNA凝聚成納米粒。而隨著N/P比的增加，PEI25-vitEn復(fù)合物的尺寸基本上相對(duì)恒定。在相同的N/P比下，維生素E修飾的復(fù)合物尺寸比25kDaPEI復(fù)合物小得多得多，說(shuō)明維生素E修飾之后的衍生物與DNA結(jié)合緊密，形成更緊湊的顆粒。表面電勢(shì)測(cè)量結(jié)果顯示，隨著N/P比的增加，PEI-vitEn/pDNA復(fù)合物的表面電荷也基本上相對(duì)恒定。在相同N/P比下，維生素E修飾的復(fù)合物的表面電勢(shì)明顯高于未修飾PEI25復(fù)合物的表面電勢(shì)。2.6原子力顯微鏡和透射電子顯微鏡表征為了對(duì)PEI25-vitE20/pDNA復(fù)合物(N/P＝20)的微觀形貌有一個(gè)比較直觀的認(rèn)識(shí)，用原子力顯微鏡(AFM,NtegraSolaris)和透射電子顯微鏡(TEM,JEM-1400)對(duì)復(fù)合物的形態(tài)進(jìn)行了表征。對(duì)于原子力顯微鏡樣品的制備，首先在新剝離的平整云母片上滴加10μL復(fù)合物溶液原液，使溶液在云母片是均勻散開(kāi)并置于清潔環(huán)境中自然風(fēng)干2小時(shí)，為了得到較好的樣品，同時(shí)制備多個(gè)樣品進(jìn)行觀察。對(duì)于透射電子顯微鏡樣品的制備，首先向碳膜銅網(wǎng)上滴加15μL復(fù)合物原液，幾分鐘后用吸水紙將過(guò)量溶液吸干。然后向銅網(wǎng)上滴加一滴0.5％磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染，室溫過(guò)夜之后在電鏡下觀察。結(jié)果可見(jiàn)PEI25-vitE20可以將質(zhì)粒DNA凝聚成直徑為約100-200nm左右的球形納米粒。實(shí)驗(yàn)例1PEI衍生物作為基因輸送載體的性能實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)方法1.1PEI-vitEn綴合物緩沖能力的測(cè)定PEI最大的特點(diǎn)之一就是緩沖能力很強(qiáng)，這是因?yàn)樗慕Y(jié)構(gòu)中含有很高比例的伯、仲和叔胺，這些氨基可以在一定的pH下發(fā)生質(zhì)子化而起到緩沖作用。PEI的基因輸送性能也與其緩沖能力有著密切的聯(lián)系。由于對(duì)PEI進(jìn)行修飾都需要通過(guò)氨基來(lái)實(shí)現(xiàn)，所以不可避免的會(huì)對(duì)緩沖能力產(chǎn)生一定影響。因此有必要對(duì)修飾之后的PEI的緩沖能力進(jìn)行考察。PEI-vitEn綴合物和對(duì)照PEI(1.8kDa和25kDa)的緩沖能力是按照先前的文獻(xiàn)(ZhengM,ZhongY,MengF,PengR,ZhongZ.MolPharm.2011；8:2434-43.)使用酸堿滴定法測(cè)定的，所測(cè)pH值在2.0至11.0范圍內(nèi)，本發(fā)明測(cè)定方法與文獻(xiàn)方法相比稍有變化。具體來(lái)講，首先分別在10mLNaCl溶液(150mM)中分別溶解一定量的修飾和未修飾的PEI(0.2mmol氮原子)。正式滴定前用0.1MHCl將PEI溶液調(diào)節(jié)至起始pH2.0，隨后用0.1MNaOH滴定，每次滴加50μL。使用pH計(jì)(MettlerToledoFE20)監(jiān)測(cè)上述溶液pH值的變化并記錄。按同樣方法滴定NaCl(150mM)作為空白對(duì)照。所測(cè)聚合物的緩沖能力按照以下公式計(jì)算：緩沖能力(％)＝100×(ΔVNaOH×0.1M)/Nmol其中ΔVNaOH是將PEI溶液的pH值從5.1調(diào)節(jié)至7.4所需要的NaOH溶液(0.1M)的體積，Nmol是所滴定的聚合物中的可質(zhì)子化胺基的總摩爾數(shù)(0.2mmol)。1.2PEI-vitEn/pDNA復(fù)合物的制備PEI-vitEn/pDNA復(fù)合物的制備是在PBS或20mMHEPES緩沖液中混合一定量的pDNA儲(chǔ)備溶液和不同量的PEI-vitEn綴合物完成的。具體來(lái)講，首先向聚合物溶液中加入一定量的pDNA儲(chǔ)備溶液(300ng/μL)，接著渦旋10秒，在室溫下孵育30min即得復(fù)合物溶液。PEI-vitEn/pDNA的比例是根據(jù)氮/磷(N/P)比計(jì)算的，并且在計(jì)算復(fù)合物中PEI-vitEn綴合物的量時(shí)將連接在PEI骨架上的vitE的分子量計(jì)算在內(nèi)。類似地，還制備了1.8kDa或25kDaPEI/pDNA復(fù)合物作為對(duì)照復(fù)合物。1.3瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳可用于研究PEI-vitEn綴合物的DNA結(jié)合能力。實(shí)驗(yàn)中首先制備N/P比從0.25到3.0(0.25、0.5、1、2、3)并且含有300ngpDNA的PEI-vitEn/pDNA復(fù)合物，最終體積為10μL。渦旋混合10秒，靜置30分鐘之后，將這些復(fù)合物各自與2μL6×DNA上樣緩沖液混合并且加載到預(yù)先制備的含有溴化乙錠(0.5mg/mL)的0.8％瓊脂糖凝膠上，瓊脂糖凝膠在80V下用Tris-醋酸鹽(TAE)跑45min。跑好的凝膠在ChemiDocXRS成像系統(tǒng)(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)中觀察DNA條帶并且拍照。為了研究vitE修飾對(duì)DNA從復(fù)合物中釋放的影響，用肝素進(jìn)行復(fù)合物中DNA的競(jìng)爭(zhēng)性置換。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，按照如上所述的方法制備N/P比為2的PEI-vitEn/pDNA復(fù)合物。向復(fù)合物中加入不同量的肝素(肝素/pDNA＝0、1、2、4、8和16，w/w)。在37℃孵育30min之后，將樣品按照上述條件進(jìn)行電泳并且進(jìn)行成像。同時(shí)制備PEI1.8/pDNA作為對(duì)照。本發(fā)明還對(duì)PEI-vitEn綴合物包載的pDNA的抗血清和核酸酶降解效果做了評(píng)價(jià)。首先在37℃下將N/P比為2的PEI-vitEn/pDNA復(fù)合物與10％血清或6UDNaseI/μgpDNA一起孵育2小時(shí)。同時(shí)用血清或DNaseI處理和未處理的pDNA作為對(duì)照。隨后在65℃下將混合物加熱10min從而使DNaseI失去活性，然后將混合物與肝素(肝素/pDNA＝16,w/w)進(jìn)一步孵育0.5小時(shí)從而置換出pDNA。按照如上所述的相同電泳條件分析樣品。1.4PEI-vitE/pDNA復(fù)合物粒徑和電勢(shì)的測(cè)定復(fù)合物顆粒的粒徑和表面電勢(shì)對(duì)轉(zhuǎn)染效率有重要影響，粒徑的大小可以直接影響復(fù)合物在不同組織和器官中的分布，而電勢(shì)則會(huì)對(duì)復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞的難易程度以及進(jìn)入細(xì)胞之后的行為有重要影響。本實(shí)驗(yàn)中聚合物/pDNA復(fù)合物的粒徑和表面電勢(shì)是使用ZetasizerNanoZS粒度儀(MalvernInstrument)在25℃下測(cè)量得到的。測(cè)量之前，按照如上所述的方法制備N/P比在1.25至25范圍內(nèi)(1.25、5、10、15、20、25)的聚合物/pDNA復(fù)合物溶液，每個(gè)樣品中含pDNA約600ng，最終體積為100μL。將上述復(fù)合物樣品分別在1.0mL的20mMHEPES緩沖液中稀釋、震蕩均勻并且盡快測(cè)量。測(cè)量時(shí)樣品的最終濃度為1-20μg/mL。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)兩次。1.5原子力顯微鏡和透射電子顯微鏡表征為了對(duì)PEI-vitE6/pDNA復(fù)合物(N/P＝20)的微觀形貌有一個(gè)比較直觀的認(rèn)識(shí)，用原子力顯微鏡(AFM,NtegraSolaris)和透射電子顯微鏡(TEM,JEM-1400)對(duì)復(fù)合物的形態(tài)進(jìn)行了表征。對(duì)于原子力顯微鏡樣品的制備，首先在新剝離的平整云母片上滴加10μL復(fù)合物溶液原液，使溶液在云母片是均勻散開(kāi)并置于清潔環(huán)境中自然風(fēng)干2小時(shí)，為了得到較好的樣品，同時(shí)制備多個(gè)樣品進(jìn)行觀察。對(duì)于透射電子顯微鏡樣品的制備，首先向碳膜銅網(wǎng)上滴加15μL復(fù)合物原液，幾分鐘后用吸水紙將過(guò)量溶液吸干。然后向銅網(wǎng)上滴加一滴0.5％磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染，晾干20分鐘之后在電鏡下觀察。1.6細(xì)胞培養(yǎng)本評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中共涉及到三種細(xì)胞系，分別是HEK-293A細(xì)胞、A375細(xì)胞和HepG2細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中除明確說(shuō)明外，細(xì)胞培養(yǎng)條件均是在37℃，5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行。所用培養(yǎng)基為含10％(v/v)胎牛血清(FBS)和1％抗生素(青霉素-鏈霉素，10,000U/mL)DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基每?jī)商旄鼡Q一次。1.7細(xì)胞毒性的考察在對(duì)所得PEI-vitEn聚合物進(jìn)行一系列必要的表征之后，進(jìn)一步使用HEK-293A細(xì)胞評(píng)價(jià)了聚合物的細(xì)胞毒性。首先，向96孔板中接種HEK-293A細(xì)胞(約6×103個(gè)/孔)。在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)之后，向每個(gè)孔中加入預(yù)定濃度(0～80μg/mL)的PEI-vitEn綴合物和對(duì)照PEI(PEI25)，繼續(xù)孵育48小時(shí)之后除去培養(yǎng)基，向每個(gè)孔中加入100μL冷的10％三氯乙酸，繼續(xù)在4℃下孵育1小時(shí)。之后用去離子水沖洗四次并且晾干，隨后添加100μL的SRB溶液(4mg/mL)并繼續(xù)孵育。30min后除去SRB溶液并且用1％乙酸將板沖洗四到五次。將96孔板晾干并且向每個(gè)孔中加入100μLTris堿(10mM,pH10.5)。處理完畢后用FlexStation3BenchtopMulti-Mode酶標(biāo)儀在540nm下檢測(cè)多孔板的光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)中使用PEI25和PEI1.8在相同條件下處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。1.8細(xì)胞轉(zhuǎn)染及條件篩選在細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中使用編碼綠色熒光蛋白(GFP)的pEGFP-N2質(zhì)粒作為報(bào)告基因。實(shí)驗(yàn)中首先在6孔板中接種HEK-293A細(xì)胞(濃度為3×105細(xì)胞/孔)并且在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)之前孵育24小時(shí)。之后用N/P比不同的PEI-vitEn/pDNA復(fù)合物處理細(xì)胞并且在不含F(xiàn)BS的1mLOpti-MEM(GIBCO)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時(shí)。隨后，將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基換成新鮮的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基并且繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)。同時(shí)按照標(biāo)準(zhǔn)流程用PEI1.8/pDNA、PEI25/pDNA和Lipo2000/pDNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照組。培養(yǎng)結(jié)束后通過(guò)高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)(PerkinElmer,Operetta)觀察細(xì)胞中的GFP表達(dá)效果并拍照。另外通過(guò)流式細(xì)胞儀(BectonDickinsonandCompany)對(duì)GFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行定量并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。1.9不同細(xì)胞系對(duì)復(fù)合物攝取的考察通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析了PEI-vitEn/pDNA復(fù)合物的細(xì)胞攝取和表達(dá)。具體來(lái)講，首先將細(xì)胞接種到6孔板(3×105細(xì)胞/孔)中并且繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。隨后在1mL不含F(xiàn)BS的Opti-MEM(GIBCO)培養(yǎng)基中用FITC標(biāo)記的PEI-vitE6/pDNA(N/P＝20)處理細(xì)胞4小時(shí)，相同條件下用FITC標(biāo)記的PEI25/pDNA復(fù)合物(N/P＝10)處理細(xì)胞作為對(duì)照組。隨后，將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基換成新鮮的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基。孵育1小時(shí)之后，用1×PBS沖洗細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶/EDTA收集細(xì)胞并且再懸浮在1×PBS中。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量，分析細(xì)胞攝取和表達(dá)。相同條件下使用未處理的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。選擇了三種不同的細(xì)胞系HEK-293A、A375和HepG2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。1.10體內(nèi)分布考察所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均使用雌性Balb/c小鼠(6-8周,18±3g)完成并且在SPF條件下飼養(yǎng)小鼠。為了研究PEI-vitE6/pDNA復(fù)合物進(jìn)入體內(nèi)后在不同器官中的分布，在250μL無(wú)菌PBS中制備了TRITC-PEI-vitE6/pDNA、TRITC-PEI25/pDNA和裸pDNA溶液，分別對(duì)三組小鼠(n＝9，每組3只)進(jìn)行尾靜脈注射，劑量都是60μgTRITC-聚合物/小鼠。注射一小時(shí)后，將小鼠處死，切除主要器官(心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟)并且用冷的生理鹽水沖洗。將取下的器官立即在小動(dòng)物活體內(nèi)成像系統(tǒng)(CRIMaestro)中觀察并拍攝器官的熒光圖像。1.11體內(nèi)轉(zhuǎn)染和表達(dá)效果考察在250μL無(wú)菌PBS中制備PEI-vitE6/pDNA、PEI25/pDNA和裸pDNA的溶液，分別對(duì)三組雌性Balb/c小鼠(n＝9，每組3只)通過(guò)尾靜脈注射，劑量都是30μgpDNA/小鼠。每隔兩天注射一次，一共注射三次。最后一次注射之后第三天，將小鼠處死，切除主要器官(心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟)并且用冷的生理鹽水沖洗。按照如上所述的方法拍攝這些器官的熒光圖像以便觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。隨后進(jìn)一步將肝臟置于包埋劑中冷凍并用冷凍切片機(jī)切成12μm的組織切片，使用倒置熒光顯微鏡(OlympusIX83)觀察并拍攝照片。1.12體內(nèi)毒性的考察將9只Balb/c小鼠隨機(jī)分成三組，每組3只。對(duì)其中兩組分別通過(guò)尾靜脈注射溶于250μL無(wú)菌PBS的PEI25和PEI-vitE6溶液，劑量為4mg/kg體重。另外一組尾靜脈注射250μL無(wú)菌PBS溶液作為陰性對(duì)照。注射完畢后每隔幾天監(jiān)測(cè)并記錄每只小鼠的體重變化，整個(gè)過(guò)程持續(xù)40天左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后計(jì)算體重平均值并且以注射天數(shù)為橫坐標(biāo)，以平均體重為縱坐標(biāo)繪制體重變化曲線作為活體內(nèi)毒性的指標(biāo)。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1PEI-vitEn綴合物緩沖能力的測(cè)定根據(jù)“質(zhì)子海綿”假設(shè)，PEI較高的緩沖能力有助于內(nèi)涵體的滲透膨脹和破裂，從而促進(jìn)核酸復(fù)合物從內(nèi)涵體中逃脫并且隨后將包載的核酸釋放到細(xì)胞液中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為表3和圖8所示，在生理pH范圍內(nèi)(pH5.1到7.4)，PEI1.8的緩沖能力為17.0，PEI-vitE2、PEI-vitE4、PEI-vitE6的緩沖能力分別為17.8、19.5和15.5。PEI-vitEn的緩沖能力與PEI1.8相當(dāng)，表明用vitE對(duì)PEI進(jìn)行的疏水性修飾沒(méi)有明顯地影響PEI的質(zhì)子化能力。表3PEI-vitEn綴合物的表征數(shù)據(jù)[a]Calculatedbyelementalanalysisdata.[b]CalculatedbyHNMRdata.[c]Calculatedbytitrationresults.2.2瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)為了考察PEI-vitEn綴合物與DNA的結(jié)合特性，進(jìn)行了瓊脂糖凝膠電泳、粒徑和表面電勢(shì)測(cè)量。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的N/P比為0.25、0.5、1.0、2.0和3.0。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為圖9(A)所示，vitE綴合對(duì)PEI1.8的DNA結(jié)合能力有輕微地削弱，其中PEI-vitE2、PEI-vitE4和PEI-vitE6分別在N/P比為1、1和2時(shí)完全抑制DNA遷移，而未修飾的1.8kDaPEI完全抑制DNA遷移的N/P比是0.5。PEI-vitEn/DNA結(jié)合能力的降低可能是由于PEI-vitEn的電荷密度降低，因?yàn)関itE很可能通過(guò)伯胺基團(tuán)與1.8kDaPEI連接。為了研究vitE修飾對(duì)DNA釋放的影響，用肝素進(jìn)行復(fù)合物中包載的DNA的競(jìng)爭(zhēng)性置換實(shí)驗(yàn)。肝素是一種富含陰離子的聚合物，它可以將DNA從復(fù)合物中置換出來(lái)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為圖9(B)所示，含有PEI-vitE6的復(fù)合物在肝素/pDNA比例為1時(shí)開(kāi)始解離并釋放出來(lái)，而含有PEI-vitE2或PEI-vitE4的復(fù)合物在肝素/pDNA比例為4時(shí)開(kāi)始解離并釋放，表明更多的vitE修飾有助于DNA的釋放。為了研究PEI-vitE是否能夠使DNA避免在核酸酶環(huán)境中被降解，進(jìn)行了DNaseI或10％血清對(duì)DNA的保護(hù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為圖10所示，在用DNaseI或10％血清處理2小時(shí)之后，通道3中的裸pDNA發(fā)生降解，而與PEI-vitE6以N/P比為2復(fù)合的pDNA完整無(wú)損，因?yàn)樘砑痈嗡刂罂梢允拱d的pDNA幾乎完整的釋放。在血清中可以使DNA避免降解可能是由于聚合物與DNA強(qiáng)烈的相互作用，這在DNA結(jié)合和肝素置換實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)檢測(cè)到了。2.3PEI-vitE/pDNA復(fù)合物粒徑和電勢(shì)的測(cè)定PEI-vitEn/pDNA復(fù)合物的尺寸和表面電荷是兩個(gè)重要因素，他們可以顯著地影響復(fù)合物在不同細(xì)胞和組織中的攝取和分布，以及細(xì)胞毒性、生物相容性和被動(dòng)靶向作用。基于之前的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，在N/P為1.25、5、10、15、20和25時(shí)測(cè)量了PEI-vitEn/pDNA復(fù)合物的粒徑和表面電勢(shì)。DLS測(cè)量結(jié)果顯示，在N/P比為5及以上的N/P比下，所有PEI-vitEn綴合物都可以有效地將DNA凝聚成納米粒。而隨著N/P比的增加，PEI-vitEn復(fù)合物的尺寸基本上相對(duì)恒定(圖11a)。在相同的N/P比下，復(fù)合物尺寸隨n的增加而增加。例如，在N/P比為20形成的PEI-vitE2、PEI-vitE4和PEI-vitE6的復(fù)合物平均尺寸分別是大約200、212和283nm，他們都比未修飾的1.8kDa和25kDaPEI復(fù)合物大得多(分別是125nm和152nm)。表面電勢(shì)測(cè)量結(jié)果顯示，隨著N/P比的增加，PEI-vitEn/pDNA復(fù)合物的表面電荷也基本上相對(duì)恒定(圖11b)。對(duì)于PEI-vitE2和PEI-vitE4的復(fù)合物來(lái)說(shuō)，在相同的N/P比下，表面電荷隨著n的增加表面電荷略微增加(分別是29.0mV和30.2mV)，而PEI-vitE6與其他PEI綴合物相比有明顯差別，在相同N/P比下，PEI-vitE6復(fù)合物的表面電勢(shì)(40.7mV)比PEI-vitE2和PEI-vitE4復(fù)合物的表面電勢(shì)大得多(圖11b)。PEI-vitE6具備的這些獨(dú)特性質(zhì)與其在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中突出的表現(xiàn)有很大關(guān)系。2.4原子力顯微鏡和透射電子顯微鏡表征本發(fā)明進(jìn)一步使用AFM和TEM對(duì)PEI-vitE6形成的復(fù)合物形態(tài)大小進(jìn)行了表征，制備的復(fù)合物N/P比為20。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示，PEI-vitE6可以將質(zhì)粒DNA凝聚成直徑為約200nm左右的球形納米粒。使用AFM和TEM測(cè)量的復(fù)合物粒子尺寸比通過(guò)DLS測(cè)量的尺寸稍小。這可能是因?yàn)橥ㄟ^(guò)DLS測(cè)量的顆粒尺寸是在溶液中的水化狀態(tài)下獲得的，復(fù)合物顆粒在該狀態(tài)下自由舒展，而通過(guò)AMF和TEM獲得的顆粒尺寸是在支持基材上干燥之后獲得的，復(fù)合物顆粒可能會(huì)由于干燥而收縮變小。2.5細(xì)胞毒性的考察在對(duì)PEI衍生物和復(fù)合物的性質(zhì)進(jìn)行了充分的表征之后，評(píng)價(jià)了PEI25和PEI-vitEn綴合物在細(xì)胞和小鼠體內(nèi)的毒性。實(shí)驗(yàn)中使用PEI25作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為圖13所示，PEI25在HEK-293A細(xì)胞中顯示較高的毒性。在濃度為60μg/mL時(shí)幾乎所有的細(xì)胞都被毒死。與PEI25相比，PEI-vitEn綴合物顯示低得多的細(xì)胞毒性。隨著每個(gè)PEI上標(biāo)記的vitE數(shù)目的增加，毒性進(jìn)一步下降，即使?jié)舛仍黾拥?0μg/mL，PEI-vitE6組的細(xì)胞存活率仍然高達(dá)90％。顯然維生素E的修飾降低了PEI的毒性。2.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果評(píng)價(jià)及最佳條件篩選為了優(yōu)化PEI-vitE綴合物介導(dǎo)的基因輸送和GFP表達(dá)的N/P比例，首先使用FACS分析考察了不同N/P(5至25)的PEI-vitE6/DNA的轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果為圖14所示，轉(zhuǎn)染效率隨N/P比的升高而增加，并且在N/P＝20時(shí)達(dá)到了最高水平。N/P進(jìn)一步升高到25對(duì)GFP表達(dá)沒(méi)有明顯增強(qiáng)。隨后研究了不同PEI-vitEn綴合物在N/P＝20時(shí)向細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNA的效果。由于毒性較高，PEI25的N/P選用10。結(jié)果為圖15所示，用PEI1.8/pDNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞幾乎沒(méi)有觀察到GFP表達(dá)，這是符合預(yù)期的。隨著PEI1.8上標(biāo)記的vitE數(shù)目增加，GFP表達(dá)水平明顯增強(qiáng)。PEI-vitE6綴合物的pDNA輸送效果最好，基因表達(dá)水平與Lipo2000相當(dāng)，并且達(dá)到PEI25/pDNA復(fù)合物的GFP表達(dá)水平的3.2倍。另外，對(duì)A375、HepG2和HEK-293A三種細(xì)胞系進(jìn)行攝取效率考察發(fā)現(xiàn)，維生素E修飾后的細(xì)胞攝取率均顯著高于PEI25對(duì)照組。2.7動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖16所示，進(jìn)一步研究了PEI-vitE6在活體內(nèi)的基因輸送。與注射PBS的對(duì)照小鼠相似，在40天時(shí)間的觀察期間，靜脈注射PEI-vitE6(80μg/小鼠)對(duì)小鼠體重沒(méi)有明顯影響，表明vitE修飾的PEI沒(méi)有引起明顯的全身性毒性。然而，用PEI25(80μg/小鼠)注射的小鼠在注射后24小時(shí)之內(nèi)全部死亡，表明PEI25具有較高的全身性毒性。為了證明維生素E修飾的PEI衍生物在活體內(nèi)的基因輸送作用，進(jìn)一步研究了PEI/pDNA復(fù)合物在小鼠中的組織分布。首先分別對(duì)三組小鼠通過(guò)尾靜脈注射pDNA、TRITC-PEI25/pDNA復(fù)合物和TRITC-PEI-vitE6/pDNA復(fù)合物。隨后在注射一小時(shí)后處死小鼠。將其主要器官切除并且在CRIMaestro成像系統(tǒng)中觀察并拍攝照片。如圖17a&17b所示，只注射pDNA的對(duì)照組小鼠的所有器官都沒(méi)有檢測(cè)到熒光，而注射TRITC-PEI25/pDNA復(fù)合物的小鼠僅在肝臟、肺臟和腎臟中檢測(cè)到微弱的熒光。相比之下，在注射TRITC-PEI-vitE6/pDNA復(fù)合物的小鼠的肝臟和肺臟中觀察到很強(qiáng)的熒光(圖17c)。然而，在腎臟中沒(méi)有觀察到熒光。這些結(jié)果表明，與PEI25相比，PEI的vitE修飾不僅大大增強(qiáng)了pDNA在小鼠肝臟和肺臟中的分布，還降低了pDNA在腎臟中的分布。隨后評(píng)價(jià)了綠色熒光蛋白基因在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)染和表達(dá)情況，以進(jìn)一步探索PEI-vitE6/DNA復(fù)合物在體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染中的潛在應(yīng)用。首先分別對(duì)三組小鼠靜脈注射pDNA、PEI25/pDNA和PEI-vitE6/pDNA，一共在9天內(nèi)注射三次，每次注射相同質(zhì)量的pDNA(30μg)。最后一次注射結(jié)束后第三天將小鼠處死。將小鼠的器官(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟)切除。隨后在CRIMaestro成像系統(tǒng)中觀察這些器官的熒光強(qiáng)度。如圖18所示，在注射pDNA的陰性對(duì)照組小鼠器官中基本未觀察到熒光，表明沒(méi)有綠色熒光蛋白表達(dá)。在注射PEI25/pDNA的陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的肝臟、肺臟和腎臟中觀察到微弱的熒光，而在注射PEI-vitE6/DNA的實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝臟和肺臟中觀察到非常強(qiáng)烈的熒光，表明PEI-vitE6/DNA將綠色熒光蛋白基因有效輸送到肝細(xì)胞和肺細(xì)胞中并且成功表達(dá)。將小鼠的肝臟包埋在OCT包埋劑中，在冷凍切片機(jī)中切出12μm的組織切片進(jìn)行熒光成像。從圖19中的結(jié)果可以看出，陰性對(duì)照組小鼠組織細(xì)胞沒(méi)有攝取pDNA質(zhì)粒，只觀察到微弱的背景熒光。與pDNA輸送結(jié)果相似，注射PEI25/pDNA的陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肝臟組織中僅僅觀察到非常少的熒光點(diǎn)。而在注射PEI-vitE6/pDNA復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟組織中檢測(cè)到強(qiáng)得多的綠色熒光。在小鼠中觀察到的pDNA分布和基因表達(dá)結(jié)果表明PEI-vitE6能夠?qū)DNA有效輸送到肝臟和肺臟細(xì)胞中并且進(jìn)一步釋放包載的pDNA進(jìn)行基因表達(dá)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3