本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及植物耐熱相關蛋白TaXPD及其編碼基因與應用。

背景技術：

隨著溫室效應的加劇，高溫脅迫對作物的威脅日趨嚴重。據(jù)估計，在干燥的季節(jié)里，夜間的溫度每升高1℃會使水稻減產10％。溫度升高對小麥、玉米、大麥等主要作物也產生了嚴重的影響，從1981年到2002年這20年間，溫度的升高已使得世界范圍內小麥、玉米、大麥每年減產約4000萬噸，相當于50億美元的經濟損失。2013年夏，我國東部及南部出現(xiàn)了極端的高溫天氣，對包括小麥、玉米、水稻在內的多種作物造成了嚴重影響。

小麥是我國主要的糧食作物，同時小麥也是喜涼的C3作物，且生育期較長，易受到冷害、凍害、高溫等脅迫的影響。小麥灌漿期適宜的溫度為20－24℃，相對濕度為70％左右，但在這一時期經常遇到連續(xù)的高溫(溫度為32℃以上)，且相對濕度小于30％，使小麥提早成熟、產量下降、品質降低，亦稱干熱風危害。因此，培育抗高溫(即耐熱)的小麥品種具有重要意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是如何提高植物的耐熱性。

為解決上述技術問題，本發(fā)明首先提供了一種蛋白質。

本發(fā)明所提供的蛋白質，可為如下a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質；

a2)在序列表中序列2所示的蛋白質的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質；

a3)將a1)或a2)所示的蛋白質經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與植物耐熱性相關的蛋白質。

其中，序列表中序列2可由758個氨基酸殘基組成。

為了使a1)中的蛋白質便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。

表1標簽的序列

上述a3)中的蛋白質，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。

上述a3)中的蛋白質的編碼基因可通過將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。

所述植物可為如下c1)至c5)中的任一種：c1)雙子葉植物；c2)單子葉植物；c3)十字花科植物；c4)擬南芥；c5)擬南芥突變體uvh6-1。

所述耐熱性可為耐32℃以上的溫度，具體可為40℃或45℃。

編碼所述蛋白質的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。

編碼所述蛋白質的核酸分子，具體可為如下(b1)或(b2)或(b3)所示的DNA分子：

(b1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

(b2)與(b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述蛋白質的DNA分子；

(b3)在嚴格條件下與(b1)或(b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白質的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

序列表中序列1由2277個核苷酸組成，序列表中序列1的核苷酸編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列。

本領域普通技術人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發(fā)明的編碼所述蛋白質的核苷酸序列進行突變。那些經過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的所述蛋白質的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼所述蛋白質，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

這里使用的術語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列表的序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。

含有所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉基因細胞系也屬于本發(fā)明的保護范圍。

所述重組載體為向載體插入所述核酸分子得到的重組質粒。

所述載體具體可為pEASY-Blunt Cloning Vector或pB2GW7vector。pEASY-Blunt Cloning Vector為北京全式金生物技術有限公司的產品。pB2GW7vector為Invitrogen公司的產品。

所述重組載體具體可為重組質粒甲。所述重組質粒甲可為向pEASY-Blunt Cloning Vector插入序列表中序列1所示的DNA分子。

所述重組載體具體可為重組質粒pB2GW7-TaXPD。所述重組質粒pB2GW7-TaXPD中含有序列表中序列1所示的DNA分子，表達序列表中序列2所示的蛋白質。

所述重組微生物為將所述重組載體導入出發(fā)微生物得到的重組菌。

所述重組微生物具體可為將所述重組質粒pB2GW7-TaXPD導入出發(fā)微生物得到的重組菌。

所述出發(fā)微生物可為根癌農桿菌。

所述根癌農桿菌具體可為根癌農桿菌GV3101。

所述轉基因細胞系均不包括繁殖材料。

d1)或d2)的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍：

d1)所述蛋白質，或，所述核酸分子，或，含有所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉基因細胞系，在調控植物耐熱性中的應用；

d2)所述蛋白質，或，所述核酸分子，或，含有所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉基因細胞系，在培育耐熱性改變的轉基因植物中的應用。

上述應用中，所述植物可為如下c1)至c5)中的任一種：c1)雙子葉植物；c2)單子葉植物；c3)十字花科植物；c4)擬南芥；c5)擬南芥突變體uvh6-1。

上述應用中，所述耐熱性可為耐32℃以上的溫度，具體可為40℃或45℃。

為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了培育轉基因植物的方法。

本發(fā)明所提供的培育轉基因植物的方法，包括如下步驟：將編碼所述蛋白質的核酸分子導入出發(fā)植物，得到耐熱性高于所述出發(fā)植物的轉基因植物。

所述編碼所述蛋白質的核酸分子，具體可為如下b1)或b2)或b3)所示的DNA分子：

(b1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

(b2)與(b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述蛋白質的DNA分子；

(b3)在嚴格條件下與(b1)或(b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白質的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

序列表中序列1由2277個核苷酸組成，序列表中序列1的核苷酸編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列。

所述“將編碼所述蛋白質的核酸分子導入出發(fā)植物”可通過向出發(fā)植物中導入重組載體實現(xiàn)；所述重組載體可為向載體插入編碼所述蛋白質的核酸分子得到的重組質粒。所述重組載體具體可為重組質粒pB2GW7-TaXPD。所述重組質粒pB2GW7-TaXPD中含有序列表中序列1所示的DNA分子，表達序列表中序列2所示的蛋白質。

為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了一種植物育種方法。

本發(fā)明所提供的植物育種方法，可包括如下步驟：增加植物中所述蛋白質的含量或活性，從而增加植物的耐熱性。

上述方法中，所述植物可為如下c1)至c5)中的任一種：c1)雙子葉植物；c2)單子葉植物；c3)十字花科植物；c4)擬南芥；c5)擬南芥突變體uvh6-1。

上述方法中，所述耐熱性可為耐32℃以上的溫度，具體可為40℃或45℃。

所述蛋白質，或，編碼所述蛋白質的核酸分子，或，上述任一所述方法，在植物育種中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

上文中，所述轉基因植物理解為不僅包含將所述核酸分子轉化受體植物得到的第一代轉基因植物，也包括其子代。對于轉基因植物，可以在該物種中繁殖所述核酸分子，也可用常規(guī)育種技術將所述核酸分子轉移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。

上問中，所述耐熱性的增加具體可體現(xiàn)為：存活率增加和/或下胚軸伸長長度增加和/或離子滲漏率降低。

實驗證明，利用本發(fā)明提供的蛋白質及其編碼基因能調控植物的耐熱性：向擬南芥突變體uvh6-1中導入蛋白質的編碼基因，得到存活率增加和/或下胚軸伸長長度增加和/或離子滲漏率降低的轉基因植物，進一步表現(xiàn)為耐熱性增加。因此，本發(fā)明提供的蛋白質對培育耐熱性增加的植物，即抗高溫的植物，具有重要的理論意義和實用價值。

附圖說明

圖1為實施例2的實驗結果。

圖2為轉基因擬南芥的Basta篩選和分子鑒定。

圖3為轉基因擬南芥高溫脅迫下的存活率。

圖4為轉基因擬南芥高溫脅迫下的下胚軸伸長長度。

圖5為轉基因擬南芥高溫脅迫下的離子滲漏率。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。

根癌農桿菌GV3101為BioVector中國質粒載體菌株細胞基因保藏中心的產品，貨號為Biovector-375。

小麥品種中國春記載于如下文獻中：Sears，E.R.，and T.E.Miller.The history of Chinese Spring wheat.Cereal Research Communication(1985)：261-263.在下文中，小麥品種中國春簡稱為小麥。

TRNzol總RNA提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司的產品。M-MLV反轉錄酶為Promega公司的產品。pEASY-Blunt Cloning Vector為北京全式金生物技術有限公司的產品。SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒為TaKaRa公司的產品。pEMTR^TM Directional TOPO Cloning Kits為Invitogen公司的產品。Basta為BBI Life Sciences公司的產品，產品目錄號為B714229-100ml。pB2GW7vector為Invitrogen公司的產品。

30％PEG8000/30mM MgCl₂Solution為 BP Clonase^TM Ⅱ Enzyme Mix中的組件。 BP Clonase^TM Ⅱ Enzyme Mix為Invitogen公司的產品，產品目錄號為11789-020。

哥倫比亞生態(tài)型擬南芥為Arabidopsis Biological Resource Center的產品，詳細網(wǎng)址為http://abrc.osu.edu/。在下文中，哥倫比亞生態(tài)型擬南芥簡稱為野生型擬南芥或WT。

擬南芥突變體uvh6-1記載于如下文獻中：Jenkins M E，Harlow G R，Liu Z，et al..Radiation-sensitive mutants of Arabidopsis thaliana.Genetics，1995，140(2)：725-732.在下文中，擬南芥突變體uvh6-1簡稱擬南芥突變體或uvh6。

下述實施例中所述高溫是指溫度為32℃以上。

實施例1、蛋白TaXPD的編碼基因的克隆

從小麥中克隆出蛋白TaXPD的編碼基因，即TaXPD基因。具體步驟如下：

1、采用TRNzol總RNA提取試劑盒提取小麥新鮮葉片的總RNA，然后利用M-MLV反轉錄酶反轉錄出第一鏈cDNA。

2、人工合成引物F：5'-ATGAAGTTCGATCTTGAAGG-3'和R：5'-TCACATCTCCATGGCGTCCC-3'。

3、完成步驟1和2后，以步驟1提取的cDNA為模板，以F和R為引物進行PCR擴增，得到約2300bp的雙鏈DNA分子。

4、將雙鏈DNA分子和pEASY-Blunt Cloning Vector連接，得到重組質粒甲。

根據(jù)測序結果，重組質粒甲中含有序列表中序列1所示的DNA分子(以下簡稱TaXPD基因)，表達序列表中序列2所示的蛋白質(以下簡稱蛋白質TaXPD或蛋白TaXPD)。

實施例2、實時定量檢測高溫處理不同時間的條件下小麥樣本中TaXPD基因的相對表達量

進行三次重復試驗，每次重復試驗的步驟均如下：

(1)獲得樣本

將生長至10天的小麥幼苗置于22℃條件下處理3h，然后取葉片，放入液氮中保存，得到樣本1(作為對照)。

將生長至10天的小麥幼苗置于40℃條件下處理1h，然后取葉片，放入液氮中保存，得到樣本2。

按照上述方法，將1h分別替換為2h、3h、6h和12h，其它步驟均不變，依次獲得樣本3、樣本4、樣本5和樣本6。

(2)實時定量檢測高溫條件下處理不同時間的小麥樣本中TaXPD基因的相對表達量

采用TRNzol總RNA提取試劑盒提取步驟(1)中樣本(樣本1、樣本2、樣本3、樣本4、樣本5或樣本6)的總RNA，將該總RNA用M-MLV反轉錄酶反轉錄為cDNA，獲得cDNA溶液，cDNA溶液中DNA的濃度為1000ng/μL。

以該cDNA溶液為模板，采用Bio-Rad C1000Cycler real time PCR system實時定量檢測樣本中TaXPD基因的相對表達量(以TaActin基因作為內參基因)。反應條件：95℃預變性3min；95℃15s，58℃15sec，72℃15s，40個循環(huán)；65-95℃繪制溶解曲線。

鑒定TaXPD基因的引物為5’-TGATCCTGGTGTTGTGAGGA-3’和5’-GTCAAGGGCCAATGTTGTTT-3’。鑒定TaActin基因的引物為actin-F：5’-ACTCATCATACTCGCCCTTCG-3’和actin-R：5’-CAAGCAGCATGAAGATCAAGGT-3’。

其中熒光定量PCR上樣體系按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒的說明書上樣，反應體系為共10μl，包括5μL SYBR Premix Ex Taq(2×)；1μL正向引物(正向引物的濃度為2μM)、1μL反向引物(反向引物的濃度為2μM)、0.2μL ROX Reference Dye Ⅱ(50×)，0.7μL cDNA溶液和2.1μL ddH₂O。SYBR Premix Ex Taq(2×)和ROX Reference Dye Ⅱ(50×)均為SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒中的組件。

采用比較閾值法對實驗結果進行分析，設置熒光閾值，確定在該熒光閾值下的循環(huán)數(shù)Ct值，根據(jù)Ct平均值計算基因的相對表達量。實驗結果見圖1(CK為樣本1，1h為樣本2，2h為樣本3，3h為樣本4，6h為樣本5，12h為樣本6)，結果表明，隨著脅迫時間的增加，TaXPD基因逐步上調表達，40℃脅迫3h時表達量達到最高，之后下調表達。因此，TaXPD基因的表達受高溫脅迫的誘導。

實施例3、轉基因擬南芥的獲得及鑒定

一、重組質粒pB2GW7-TaXPD和GV3101/pB2GW7-TaXPD的獲得

1、重組質粒pB2GW7-TaXPD的獲得

利用Gateway技術構建過表達載體，具體步驟如下：

(1)目標基因的獲得

根據(jù)TaXPD基因的開放閱讀框序列設計引物如下：

TaXPD-TOPOF：5’-CACCATGAAGTTCGATCTTGAAGG-3’

TaXPD-TOPOR：5’-TCACATCTCCATGGCGTCCC-3’。

采用TRNzol總RNA提取試劑盒提取小麥新鮮葉片的總RNA，然后利用M-MLV反轉錄酶反轉錄出第一鏈cDNA，獲得cDNA溶液，cDNA溶液中DNA的濃度為1000ng/μL。

以該cDNA溶液為模板，以TaXPD-TOPOF和TaXPD-TOPOR為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。

(2)純化的PCR擴增產物的獲得

①將步驟(1)獲得的PCR擴增產物用ddH₂O稀釋至4倍體積，得到PCR擴增產物稀釋液。

②向PCR擴增產物稀釋液中加入1/2倍體積的30％PEG8000/30mM MgCl₂Solution，渦旋混勻，然后10000rpm離心15min。

③完成步驟②后，棄上清，晾干后加入30μL ddH₂O溶解，得到去除引物二聚體的PCR擴增產物，即純化的PCR擴增產物。

(3)BP反應

按pEMTR^TM Directional TOPO Cloning Kits說明書自帶操作步驟，將步驟(2)得到的純化的PCR擴增產物和TOPO vector(pEMTR^TM Directional TOPO Cloning Kits中的組件)進行BP重組反應，得到BP反應產物。

(4)轉化

將步驟(3)得到的BP反應產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，得到的克隆即為入門克隆，該入門克隆中的質粒為入門質粒，將該入門質粒命名為TOPO-TaXPD，將入門質粒送測序，測序結果表明該入門質粒含有序列表中序列1所示的DNA分子。

(5)LR反應

將步驟(4)得到的TOPO-TaXPD和pB2GW7vector進行LR重組反應，得到LR反應產物。

(6)轉化

將步驟(5)得到的LR反應產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，得到的克隆即為目標克隆，該目標克隆中的質粒為目標質粒，將該目標質粒命名為重組質粒pB2GW7-TaXPD，測序結果表明，重組質粒pB2GW7-TaXPD中含有序列表中序列1所示的DNA分子，表達序列表中序列2所示的蛋白質TaXPD。

2、GV3101/pB2GW7-TaXPD的獲得

將重組質粒pB2GW7-TaXPD導入根癌農桿菌GV3101，得到重組農桿菌，命名為GV3101/pB2GW7-TaXPD。

3、GV3101/pB2GW7的獲得

將pB2GW7vector導入根癌農桿菌GV3101，得到重組農桿菌，命名為GV3101/pB2GW7。

二、轉基因擬南芥的獲得

1、采用擬南芥花序浸花轉化法(記載于如下文獻中Clough，S.J.，andBent，A.F..Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofA rabidopsisthaliana.PlantJ.(1998)16，735-743.)，將步驟一中1制備的GV3101/pB2GW7-TaXPD轉至野生型擬南芥中，獲得T₁代轉TaXPD基因的野生型擬南芥的種子。

2、將步驟1獲得的T₁代轉TaXPD基因野生型擬南芥的種子播種于含有50mg/L Basta的MS培養(yǎng)基上，能夠正常生長的擬南芥(抗性苗)即為T₁代轉TaXPD基因陽性苗，T₁代轉TaXPD基因陽性苗收到的種子即為T₂代轉TaXPD基因的野生型擬南芥的種子。

3、將步驟2篩選出的不同株系的T₂代轉TaXPD基因的野生型擬南芥的種子播種于含有50mg/L Basta的MS培養(yǎng)基上進行篩選，如果某株系中能夠正常生長的擬南芥(抗性苗)的數(shù)目與不能夠正常生長的擬南芥(非抗性苗)的數(shù)目比例為3：1，則該株系為TaXPD基因插入一個拷貝的株系，該株系中的抗性苗收到的種子即為T₃代轉TaXPD基因的野生型擬南芥的種子。

4、將步驟3篩選出的T₃代轉TaXPD基因的野生型擬南芥的種子再次播種于含有50mg/L Basta的MS培養(yǎng)基上進行篩選，均為抗性苗的即為T₃代純合轉TaXPD基因的野生型擬南芥。將其中12個T₃代純合轉TaXPD基因的野生型擬南芥的株系依次命名為p35S:TaXPD/WT－1至p35S:TaXPD/WT－12，并進行后續(xù)實驗。

按照上述方法，將GV3101/pB2GW7-TaXPD替換為GV3101/pB2GW7，其它步驟均相同，得到T₃代純合轉空載體的野生型擬南芥的植株，簡稱轉空載體的野生型擬南芥。

按照上述方法，將野生型擬南芥替換為uvh6，其它步驟均相同，得到T₃代純合轉TaXPD基因的uvh6，將其中6個T₃代純合轉TaXPD基因的uvh6的株系依次命名為p35S:TaXPD/uvh6－1至p35S:TaXPD/uvh6－6，并進行后續(xù)實驗。

按照上述方法，將GV3101/pB2GW7-TaXPD替換為GV3101/pB2GW7，野生型擬南芥替換為uvh6，其它步驟均相同，得到T₃代純合轉空載體的擬南芥突變體的植株，簡稱轉空載體的擬南芥突變體。

T₃代純合轉TaXPD基因的野生型擬南芥的Basta篩選具體見圖2中A(箭頭所指為野生型擬南芥，作為對照)。T₃代純合轉TaXPD基因的uvh6的Basta篩選具體見圖2中B(箭頭所指為uvh6，作為對照)。

三、轉基因擬南芥的分子鑒定

1、分別取p35S:TaXPD/WT－1至p35S:TaXPD/WT－12的T₃代種子和p35S:TaXPD/uvh6－1至p35S:TaXPD/uvh6－6的T₃代種子，種植于營養(yǎng)土中，25℃培養(yǎng)4周，依次得到p35S:TaXPD/WT－1至p35S:TaXPD/WT－12的幼苗和p35S:TaXPD/uvh6－1至p35S:TaXPD/uvh6－6的幼苗。

2、分別提取步驟1獲得的幼苗的葉片的基因組DNA并以其作為模板，以5’-ATGAAGTTCGATCTTGAAGG-3’和5’-TCACATCTCCATGGCGTCCC-3’為引物進行PCR擴增，然后進行電泳。

按照上述方法，將步驟1獲得的幼苗的葉片的基因組DNA替換為水，其它步驟均相同，作為陰性對照。

按照上述方法，將步驟1獲得的幼苗葉片的基因組DNA替換為重組質粒pB2GW7-TaXPD，其它步驟均相同，作為陽性對照。

按照上述方法，將步驟1獲得的幼苗葉片的基因組DNA去掉(即PCR反應體系中沒有模板)，其它步驟均相同，作為空白對照。

實驗結果如圖2中C(泳道1-12為p35S:TaXPD/WT－1至p35S:TaXPD/WT－12，泳道13-17為p35S:TaXPD/uvh6－1至p35S:TaXPD/uvh6－5，M為Marker，泳道18為陰性對照，泳道19為陽性對照，泳道20-23為空白對照)。結果表明，p35S:TaXPD/WT－1、p35S:TaXPD/WT－2、p35S:TaXPD/WT－4至p35S:TaXPD/WT－12和p35S:TaXPD/uvh6－1至p35S:TaXPD/uvh6－5均可擴增得到2300bp的條帶。結果表明，p35S:TaXPD/WT－1、p35S:TaXPD/WT－2、p35S:TaXPD/WT－4至p35S:TaXPD/WT－12均為轉TaXPD基因陽性的野生型擬南芥，p35S:TaXPD/uvh6－1至p35S:TaXPD/uvh6－5均為轉TaXPD基因陽性的擬南芥突變體。

四、轉基因擬南芥的耐熱性鑒定

1、存活率鑒定

實驗重復三次取平均值，每次重復的步驟如下：

(1)將p35S:TaXPD/WT－1的T₃代種子、WT的種子、擬南芥突變體的種子、轉空載體的野生型擬南芥、轉空載體的擬南芥突變體或p35S:TaXPD/uvh6－1的T₃代種子播種于1/2MS培養(yǎng)基，置于溫室中培養(yǎng)5天(溫度為20±2℃，濕度為55-65％，光照周期為16h光照和8h黑暗)。

(2)完成步驟(1)后，置于黑暗條件下，45℃處理2h。

(3)完成步驟(2)后，置于溫室中培養(yǎng)2天(溫度為20±2℃，濕度為55-65％，光照周期為16h光照和8h黑暗)，統(tǒng)計擬南芥幼苗的存活率。擬南芥幼苗的存活率＝存活的擬南芥幼苗株數(shù)/種植的擬南芥種子個數(shù)×100％。

將p35S:TaXPD/WT－1的T₃代種子、WT的種子、擬南芥突變體的種子、轉空載體的野生型擬南芥、轉空載體的擬南芥突變體或p35S:TaXPD/uvh6－1的T₃代種子播種于1/2MS培養(yǎng)基，置于溫室中培養(yǎng)7天(溫度為22℃，濕度為55-65％)，統(tǒng)計擬南芥幼苗的存活率，作為對照。

實驗結果見圖3(A為對照的表型，B為45℃脅迫后的表型，C為擬南芥幼苗的存活率，p35S:TaXPD/uvh6為p35S:TaXPD/uvh6－1，p35S:TaXPD/WT為p35S:TaXPD/WT－1)。結果表明，經高溫脅迫處理后，擬南芥突變體的存活率最低，而p35S:TaXPD/uvh6－1的存活率有所提高，p35S:TaXPD/uvh6－1和野生型擬南芥的存活率無顯著差異，轉空載體的擬南芥突變體和擬南芥突變體的存活率無顯著差異，轉空載體的野生型擬南芥和野生型擬南芥的存活率無顯著差異。因此，TaXPD基因在耐熱調控中發(fā)揮著重要的作用。但是與野生型擬南芥相比，p35S:TaXPD/WT－1的存活率無顯著提高，推測可能是由于植物耐熱調控網(wǎng)絡復雜，盡管TaXPD基因在耐熱性上發(fā)揮著重要作用，但在高溫脅迫下只增加一個基因的表達量不足以抵抗高溫對植物體造成的損傷，因此僅僅通過提高野生型擬南芥中TaXPD的表達量不能顯著的提高其耐熱性。

2、下胚軸伸長長度的測量

下胚軸伸長長度是衡量耐熱性的一個重要指標，為了進一步驗證TaXPD基因是否參與可耐熱性調控，對下胚軸伸長長度進行了測量。實驗重復三次取平均值，每次重復的步驟如下：

(1)將p35S:TaXPD/WT－1的T₃代種子、WT的種子、擬南芥突變體的種子、轉空載體的野生型擬南芥、轉空載體的擬南芥突變體或p35S:TaXPD/uvh6－1的T₃代種子播種于MS培養(yǎng)基，用錫箔紙保住培養(yǎng)基，在溫室中豎直放置培養(yǎng)2.5天(溫度為22℃，濕度為55-65％)。

(2)完成步驟(1)后，45℃處理2h。

(3)完成步驟(2)后，置于溫室中豎直放置培養(yǎng)2.5天(溫度為22℃，濕度為55-65％)，測量下胚軸伸長長度。

將p35S:TaXPD/WT－1的T₃代種子、WT的種子、擬南芥突變體的種子、轉空載體的野生型擬南芥、轉空載體的擬南芥突變體或p35S:TaXPD/uvh6－1的T₃代種子播種于MS培養(yǎng)基，置于溫室中豎直放置培養(yǎng)5天(溫度為22℃，濕度為55-65％，光照周期為16h光照和8h黑暗)，測量下胚軸伸長長度，作為對照。

實驗結果見圖4(A中左圖為對照的表型，A中右圖為45℃脅迫后的表型，B為下胚軸伸長長度，p35S:TaXPD/uvh6為p35S:TaXPD/uvh6－1，p35S:TaXPD/WT為p35S:TaXPD/WT－1)。結果表明，無論在正常生長條件下(22℃)還是在高溫脅迫條件下(45℃)，擬南芥突變體和轉空載體的擬南芥突變體的下胚軸伸長長度無顯著差異，但均均顯著低于其它材料，且其它材料間的下胚軸伸長長度均無顯著差異。因此，喪失了TaXPD基因的擬南芥突變體的耐熱性降低，TaXPD基因可恢復擬南芥突變體的耐熱性。

3、離子滲漏率的測定

離子滲漏率是衡量耐熱性的一個重要指標，為了進一步驗證TaXPD基因是否參與可耐熱性調控，對離子滲漏率進行了測定。實驗重復三次取平均值，每次重復的步驟如下：

(1)將p35S:TaXPD/WT－1的T₃代種子、p35S:TaXPD/WT－2的T₃代種子、p35S:TaXPD/WT－3的T₃代種子、WT的種子、擬南芥突變體的種子、轉空載體的野生型擬南芥、轉空載體的擬南芥突變體、p35S:TaXPD/uvh6－1的T₃代種子、p35S:TaXPD/uvh6－2的T₃代種子或p35S:TaXPD/uvh6－3的T₃代種子播種于MS培養(yǎng)基，置于溫室中培養(yǎng)4周(溫度為22℃，濕度為55-65％，光照周期為16h光照和8h黑暗)。

(2)完成步驟(1)后，用打孔器(直徑為1cm)從蓮座葉上取樣(取樣時需盡量避開主葉脈)，然后用蒸餾水沖洗3次并晾干，得到樣品。

(3)完成步驟(2)后，隨機選取6個樣品置于50mL試管中，加入12mL蒸餾水，然后42℃水浴1h，室溫放置24h后測定電導率值，記為T1。

(4)完成步驟(3)后，取所述試管，121℃滅菌15min，室溫放置24h后測定電導率值，記為T2。

根據(jù)步驟(3)和(4)測定的電導率值，計算離子滲漏率。

離子滲漏率(％)＝T1/T2×100％。

實驗結果見圖5。結果表明，擬南芥突變體和轉空載體的擬南芥突變體的離子滲漏率均達到90％以上，對高溫脅迫極其敏感；野生型擬南芥和轉空載體的野生型擬南芥的離子滲漏率無顯著差異；p35S:TaXPD/uvh6－1的離子滲漏率雖未完全降低到野生型擬南芥的水平，但較擬南芥突變體降低明顯，達到了顯著水平。離子滲漏率的測定結果與上述結果一致，進一步說明了TaXPD基因在耐熱調控中發(fā)揮著重要作用。