本發(fā)明涉及一種人胰島素或其類似物的?；苌锏闹苽浞椒?。

背景技術(shù)：

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一種常見的代謝內(nèi)分泌疾病，是由于體內(nèi)胰島素絕對(duì)或相對(duì)缺乏，或靶組織對(duì)胰島素不敏感而引起的慢性高血糖為特征的伴隨糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂的臨床慢性、全身性代謝綜合癥。它由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起，涉及人體各個(gè)系統(tǒng)，包括心腦血管、腎、眼、神經(jīng)等臟器并發(fā)癥，嚴(yán)重危害人類健康，是一種終生疾病。

糖尿病已成為一種常見病、多發(fā)病，是繼癌癥、心腦血管病之后，第三大威脅人類生命的疾病，是全人類的挑戰(zhàn)，其對(duì)人們生命健康的危害不分種族和國(guó)家。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)的統(tǒng)計(jì)，上個(gè)世紀(jì)八十年代中期至九十年代中期十年間，糖尿病患者總量增長(zhǎng)4倍，達(dá)到1.2億。2007年全球糖尿病患者人數(shù)為2.46億，其中46％為40-59歲勞動(dòng)力人口。預(yù)計(jì)到2025年全世界糖尿病患者將增加到3.8億，占到世界成年人口的7.1％。

使用人胰島素是治療糖尿病的一種主要方法，但是人胰島素作用時(shí)間較短，使得病人必須頻繁注射，極為不便。因此，人們致力于獲得一些能夠更長(zhǎng)時(shí)間作用于人體的胰島素類似物及其衍生物。其中，使用?；鶊F(tuán)修飾人胰島素或其類似物，是一種提高其半衰期的有效方法。WO2005012347和WO2013086927分別公開了兩類不同的人胰島素類似物的?；苌?，此類衍生物是通過將脂肪酸形式的酰化基團(tuán)共價(jià)連接到人胰島素類似物的氨基酸上，經(jīng)過此種修飾后，它們的半衰期相對(duì)于現(xiàn)有的胰島素類似物大大提高。

在WO2005012347和WO2013086927中，還公開了此種人胰島素類似物的?；苌锏闹苽浞椒?，該方法將以帶羧酸保護(hù)基的脂肪酸與人胰島素類似物反應(yīng)，在生成以羧酸保護(hù)形式存在的?；苌锖?，再經(jīng)水解得到?；鶊F(tuán)以脂肪酸的形式存在的?；苌铮丛摲椒ㄔ谛纬勺罱K所需的酰化衍生物時(shí)需要兩步反應(yīng)。由于在人胰島素類似物的?；苌锏闹苽溥^程中，胰島素類似物占據(jù)了大部分成本，其參與反應(yīng)的步驟越多，就可能造成與其相關(guān)的收率下降，導(dǎo)致其最終產(chǎn)物的制備不經(jīng)濟(jì)；該兩步反應(yīng)還帶來(lái)了較多的雜質(zhì)，使得純化變得非常困難。因此，迫切需要提供一種新的制備方法，以更為經(jīng)濟(jì)的條件來(lái)得到人胰島素類似物的?；苌?，且提純更加方便容易。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了提供一種新的人胰島素或其類似物的酰化衍生物的制備方法。

本發(fā)明提供的制備方法是通過將脂肪酸直接與人胰島素或其類似物反應(yīng)，生成所需的人胰島素或其類似物的?；苌铩Ｋ龅闹苯优c人胰島素或其類似物反應(yīng)，指的是該脂肪酸的羧酸基團(tuán)不被保護(hù)基保護(hù)的情況下，直接投入反應(yīng)。

通過本發(fā)明所述的方法制備的人胰島素或其類似物的?；苌锞哂腥缦峦ㄊ饺缡镜慕Y(jié)構(gòu)：

S-W-X-Y-Z

其中S為人胰島素或其類似物；

-W-X-Y-Z為胰島素類似物的?；揎椈鶊F(tuán)，其中W為：

●具有-OC(CH₂)_nCO-的二?；Y(jié)構(gòu)，其中n為2～10之間整數(shù)，該結(jié)構(gòu)以其?；缓湍阁w胰島素或其類似物的A-鏈或B-鏈N-末端氨基酸殘基的α-氨基或B-鏈上存在的Lys殘基的ε-氨基形成酰胺鍵；

●側(cè)鏈上帶有羧基的α-氨基酸殘基或含有側(cè)鏈上帶有羧基的α-氨基酸組成的2-4肽，其中該殘基或肽與母體胰島素或其類似物的A-鏈或B-鏈N-末端氨基酸殘基的α-氨基或B-鏈上存在的Lys殘基的ε-氨基形成酰胺鍵連接；

X為：

●-CO-；

●含羧酸基團(tuán)的二氨基化合物，該化合物以其氨基之一與W中的羧基形成酰胺鍵連接；

a)當(dāng)W為氨基酸殘基或2-4肽時(shí)，上述X基團(tuán)通過-CO-與W上的氨基形成酰胺鍵，或

b)當(dāng)W為二?；Y(jié)構(gòu)時(shí)，上述X基團(tuán)以其氨基基團(tuán)之一與二酰基結(jié)構(gòu)連接；

Y為：

●-A(CH₂)_m-，其中m為6-32的整數(shù)，A為不存在或CO-；

●?；r(jià)烴鏈，其中含有1、2或3個(gè)-CH＝CH-基團(tuán)和足以在鏈上獲得10-32個(gè)碳原子總數(shù)的-CH₂-基團(tuán)；

●通式-B(CH₂)_vC₆H₄(CH₂)_w-的二價(jià)烴鏈，其中v和w為整數(shù)或其中一為0，使得v與w之后在6-30的范圍，B為不存在或CO-；

a)當(dāng)X為CO-時(shí)A或B為不存在，或

b)當(dāng)X為二氨基化合物時(shí)A或B為CO-；

Z為-COOH。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的S-W-X-Y-Z中，W為在側(cè)鏈上帶有羧酸基團(tuán)的α-氨基酸殘基，該氨基酸為γ-Glu，該殘基以其羧酸基團(tuán)之一和人胰島素或其類似物的B鏈N-末端氨基酸殘基的α-氨基或者人胰島素或其類似物B鏈上存在的Lys殘基的ε-氨基一起形成酰胺鍵；X為-CO-；Y為-(CH2)_m-，其中m為6-16的整數(shù)；且Z為-COOH。

在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的S-W-X-Y-Z中，W為具有-OC(CH2)_nCO-的二?；Y(jié)構(gòu)，其中n為2～10之間整數(shù)，該結(jié)構(gòu)以其?；缓湍阁w胰島素或其類似物的A-鏈或B-鏈N-末端氨基酸殘基的α-氨基或B-鏈上存在的Lys殘基的ε-氨基形成酰胺鍵；X為含羧酸基團(tuán)的二氨基化合物，該化合物以其氨基之一與W的一個(gè)酰基相連接；Y為-CO(CH₂)_m-，其中m為6-32的整數(shù)，Z為-COOH。當(dāng)X為含羧酸基團(tuán)的二氨基化合物時(shí)，其結(jié)構(gòu)可以是-HN(COOH)C(CH₂)pNH-，其中p為2-10的整數(shù)，優(yōu)選2-6的整數(shù)，特別優(yōu)選2-4的整數(shù)。

在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的S-W-X-Y-Z中，-W-X-Y-Z具有選自如下的式(I)或式(II)所示的結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明所述的制備通式為S-W-X-Y-Z的人胰島素或其類似物的酰化衍生物的方法，包括如下所示的式(III)所示的化合物和S代表的人胰島素或其類似物反應(yīng)的步驟，其中S、W、X、Y、Z的定義如前所述，

R-W-X-Y-Z

(III)

其中R為離去基團(tuán)，優(yōu)選活化酯基團(tuán)，更優(yōu)選選自

本發(fā)明所述的制備方法，除前述式(III)化合物與S反應(yīng)的步驟外，還可包括式(III’)化合物脫除羧基保護(hù)基得到式(III)化合物的步驟，

其中，W’、X’、Z’分別代表W、X、Z中所有的羧基被保護(hù)基保護(hù)的形式，所述的保護(hù)基優(yōu)選C₁-C₆的烷基，優(yōu)選C₁-C₄的烷基，特別優(yōu)選甲基或特丁基；R如式(III)化合物中定義。

在此之前，式(III’)化合物的制備方法可參考WO2005012347和WO2013086927中的公開的方法。

本發(fā)明所需制備的人胰島素或其類似物的?；苌镏?，所述的人胰島素類似物種類沒有特別限制。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的人胰島素類似物，具有如下所示的氨基酸序列的人胰島素類似物：

其中，A₀可以是R，也可以缺失；A₂₁可以是N或G；

B₃可以是K、D或N；

B₂₇可以是E、T、D或K；

B₂₈可以是E、D、P或K；

B₂₉可以是E、K或P；

B₃₀可以是K、R、E、T或者缺失；

B₃₁、B₃₂可以是R或者單個(gè)缺失或兩者缺失，

其中當(dāng)所述的A₀缺失，A₂₁是N，B₃是N時(shí)：B₃₁B₃₂缺失，B₂₇B₂₈B₂₉B₃₀不是TPKT、TKPT或TDKT；

又或者當(dāng)A₀缺失，A₂₁是N，B₃是K，B₃₁B₃₂缺失時(shí)，B₂₇B₂₈B₂₉B₃₀不是TEKT；

又或者當(dāng)A₀缺失，A₂₁是G，B₃是N時(shí)，B₂₇B₂₈B₂₉B₃₀B₃₁B₃₂不是TPKTRR。

優(yōu)選地，其中B29是賴氨酸(K)殘基。

當(dāng)A鏈的A₀缺失，B鏈的B₃是N時(shí)：優(yōu)選的B₂₈是E或D，B₂₉是E、K或P，B₃₀是R、E或者缺失，B₃₁、B₃₂缺失；更優(yōu)選的當(dāng)B₃₀B₃₁B₃₂缺失時(shí)，B₂₈B₂₉是KE。

當(dāng)B鏈的B₃是D時(shí)：優(yōu)選的B₂₈、B₂₉是P或K，B₃₀是T或者缺失，B₃₁、B₃₂是R或者缺失；更優(yōu)選的B₂₈B₂₉是PK。

當(dāng)A鏈的A₀缺失，B鏈的B₃是K時(shí)：優(yōu)選的B₂₈、B₂₉是P或E，B₃₀是E或R，B₃₁是R或者缺失，B₃₂缺失；更優(yōu)選的B₂₈B₂₉是PE。

本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述人胰島素類似物具有選自，但不限于如下所述的序列：

在本發(fā)明特別優(yōu)選的人胰島素類似物的?；苌镏?，所述人胰島素類似物選自B(1-27)-D-K-E,A(1-21)人胰島素或B(1-29)，A(1-21)人胰島素，B(1-29)，A(1-21)人胰島素即為WO2005012347中所指的DES(B30)人胰島素。

本發(fā)明人胰島素類似物的?；苌镉忠粌?yōu)選例，其中?；揎椈鶊F(tuán)-W-X-Y-Z與母體胰島素B3、B27-B30的賴氨酸(K)殘基的ε-氨基連接。

本發(fā)明人胰島素類似物的?；苌镉忠粌?yōu)選例，其中?；揎椈鶊F(tuán)-W-X-Y-Z與母體胰島素A和B-鏈N-末端α-氨基連接。

本發(fā)明中最為優(yōu)選的人胰島素類似物的?；苌镞x自以下任意一種：B28D-N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B30E人胰島素；N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)des(B30)人胰島素。

其中，B28D-N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B30E人胰島素的結(jié)構(gòu)式如下式的式IV，根據(jù)式IV的結(jié)構(gòu)可以很容易地理解N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)des(B30)所代表的結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明另一方面還提供了一種式(III)所示的化合物，其中W、X、Y、Z的定義如前所述，

R-W-X-Y-Z

(III)

其中R為離去基團(tuán)，優(yōu)選活化酯基團(tuán)，更優(yōu)選選自

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的式(III)化合物可選自(IIIa)所示的化合物：

本發(fā)明再一方面還提供了式(III)所示的化合物的制備方法，包括式(III’)化合物脫除羧基保護(hù)基得到式(III)化合物的步驟，

其中，W’、X’、Z’分別代表W、X、Z中所有的羧基被保護(hù)基保護(hù)的形式，所述的保護(hù)基優(yōu)選C₁-C₆的烷基，優(yōu)選C₁-C₄的烷基，特別優(yōu)選甲基或特丁基；R如式(III)化合物中定義。

在此之前，式(III’)化合物的制備方法可參考WO2005012347和WO2013086927中的公開的方法。

本發(fā)明所用氨基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

“人胰島素類似物”是指人胰島素中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已被刪除和/或被其他氨基酸殘基替換的人胰島素，或包含附加氨基酸殘基，即51個(gè)氨基酸殘基以上的人胰島素。

“胰島素衍生物”，在本發(fā)明中指在胰島素A和B-鏈N-末端的α-氨基或者在B3、B27-B30的賴氨酸殘基的ε-氨基處連接了?；揎椈鶊F(tuán)，形成了?；葝u素，該?；葝u素具有如下通式：S-W-X-Y-Z；其中各代碼定義如說(shuō)明書中所定義。

本發(fā)明的序列設(shè)計(jì)基于天然人胰島素的蛋白質(zhì)氨基酸序列。全長(zhǎng)由A和B鏈兩條鏈組成。A和B鏈以二硫鍵連接，A鏈內(nèi)還有一個(gè)二硫鍵，共3個(gè)二硫鍵，均以連線標(biāo)出。每條鏈上的氨基酸序號(hào)按如下規(guī)則命名：如A鏈1-21位氨基酸分別標(biāo)為A1，A2，A3……。B鏈1-30位氨基酸分別標(biāo)為B1，B2，B3……。此外，如果在A和B鏈的N端添加氨基酸的話，其標(biāo)記分別為A0，A(-1)，A(-2)……，B(0)，B(-1)，B(-2)……等。如果在A和B鏈的C端添加氨基酸的話，其標(biāo)記分別為A22，A23，……，B31，B32……等。在具體表示人胰島素衍生物通式時(shí)，確定的氨基酸用氨基酸代碼表示，有不確定替代或刪除的位置用該位的氨基酸序號(hào)表示，如本發(fā)明的人胰島素類似物通式所示。

本發(fā)明中，所用的B(1-29)是指人胰島素B1到B29縮短的B鏈，B(1-30)是指人胰島素B1到B30的B鏈，B(1-31)是指人胰島素B1到B31的B鏈，B(1-32)是指人胰島素B1到B32的B鏈；A(1-21)是指人胰島素的A鏈，A(0-21)是指在A0位加一個(gè)氨基酸殘基的人胰島素A鏈。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，在人胰島素分子中的取代殘基是用參照于人胰島素的氨基酸序號(hào)表示的。例如，B(1-2)-D-B(4-30)，A(1-21)人胰島素指一個(gè)在B鏈3位上N被D所取代的人胰島素類似物。序列簡(jiǎn)寫B(tài)(1-30)，A(1-21)指天然人胰島素；B(1-29)，A(1-21)是指B30位缺失的人胰島素；B(1-2)-K-B(4-28)-E-E，A(1-21)是指B3位為K所取代，B29B30為EE所取代的重組人胰島素，除非另外加以說(shuō)明。如果涉及某一位點(diǎn)氨基酸缺失的，也可以用DES的形式表示，例如DES(B30)人胰島素，表示B30位氨基酸缺失的人胰島素類似物。此外，與人胰島素一樣，B鏈和A鏈?zhǔn)怯葾(7)Cys和B(7)Cys之間的二硫鍵，A(20)Cys和B(19)Cys之間的二硫鍵聯(lián)結(jié)起來(lái)的。同時(shí)A鏈含有A(6)Cys和A(11)Cys間的內(nèi)二硫鍵。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步描述解釋本發(fā)明，但這些實(shí)施例并非意味著限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：B28D-N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B30E人胰島素的制備

1、甲基十六烷二?；?Glu(OSu)-OMe的制備

合成路線：

取X01(150g，524.5mmol)，室溫下加入干燥的THF(2.5L)，隨后加入催化量的DMF(1.0mL)，將草酰氯(49mL)加入到100mL的恒壓滴液漏斗中，將草酰氯緩慢滴加到反應(yīng)瓶中，期間有氣體生成，需不斷放氣，約滴加兩小時(shí)。滴加完畢后，室溫?cái)嚢?.5h，隨后減壓旋干THF，向反應(yīng)瓶中加入DCM(800mL)和叔丁醇(500mL)，室溫下攪拌過夜。旋干叔丁醇和二氯甲烷，加入二氯甲烷(1L)，過濾，除去不溶固體。濾液旋干過柱。收集所需成分，旋干，石油醚重結(jié)晶，得54g產(chǎn)品X02，同時(shí)回收二叔丁酯產(chǎn)物X03。

將X02(28.5g，83.3mmol)溶于DCM(200mL)中，室溫下加入N-羥基丁二酰亞胺(5.54g，48.1mmol)和二異丙基碳二酰亞胺(7.6mL)，室溫?cái)嚢?天，TLC顯示基本反應(yīng)完全。過濾，除去不溶固體，減壓旋干溶劑，柱層析純化，得28.5g X04。

取化合物X04(26g,59.2mmol)和L-1-叔丁基谷氨酸(13.2g,65mmol)溶于四氫呋喃(500mL)中，加三乙胺(9.4mL)，室溫?cái)嚢?天，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全，直接減壓旋去溶劑，溶于二氯甲烷(500mL)中，加N-羥基丁二酰亞胺(8.17g,71mmol)和二異丙基碳二酰亞胺(14mL)，室溫?cái)嚢?天，過濾除去不溶固體，濾液旋干，粗略柱層析，用二氯甲烷溶解上柱，硅膠200-300目，洗脫劑：PE/EA＝8/1→3/1→1/1(開始出)，得化合物X06(29.8g,81％)。

取化合物X06(1g，1.6mmol)溶于三氟乙酸(5mL)中，室溫?cái)嚢?小時(shí)反應(yīng)完全，減壓旋三氟乙酸過程中加入無(wú)水乙醚，白色固體析出，過濾得到化合物X07(0.6g)。

2、B28D-N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B30E人胰島素前體的制備

取重組B(1-27)-D-K-E,A(1-21)人胰島素(按照WO2013086927公開的方法制備得到)50ml(3mg/ml,50mM Tris HCl緩沖液體系)，用1.5M Na₂CO₃調(diào)節(jié)pH至約10.75。將甲基十六烷二?；?Glu(OSu)-OMe(108.5mg，211.5mmol)溶于50mL乙腈后，每隔5min加10mL本溶液到上述上述B(1-27)-D-K-E,A(1-21)重組人胰島素溶液中開始反應(yīng)，分5次加完，加完后開始計(jì)時(shí)，采用RP-HPLC對(duì)反應(yīng)過程進(jìn)行中控。2h后用三氟乙酸將溶液pH調(diào)節(jié)至約7.0終止反應(yīng)得粗品溶液。

3、B28D-N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B30E人胰島素(HS061)的純化

將上述前體粗品溶液加入水稀釋使有機(jī)相含量約15％(v:v)，用0.45μm濾膜過濾后采用RP-HPLC對(duì)其進(jìn)行純化，其中反相柱為Kromasil C8-100-10，250×4.6mm，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1M乙酸銨，以0min-5min-55min，A相為15％-24％-29％的梯度變化，1mL/min的流速洗脫產(chǎn)物并收集目標(biāo)產(chǎn)物得純化液。

4、B28D-N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B30E人胰島素的超濾及凍干

將上述純化溶液用注射水稀釋一倍，使其乙腈含量降低到20％以下。用膜包將該溶液用注射水洗滌置換7倍體積，膜包通量5L/m²/min、透過端通量8L/m²/H，其中膜包為3K PLBC 0.1SQM，樣品不能透過膜包。將超濾后的樣品凍干獲得凍干產(chǎn)物27.5mg。所得分子結(jié)構(gòu)式如下。

5、B28D-N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B30E人胰島素結(jié)構(gòu)確證

B28D-N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B30E人胰島素采用ESI-MS測(cè)定分子量為6251.65，和理論分子量6251.16一致。

B28D-N^εB29-(N^α-(HOOC(CH₂)₁₄CO)-γ-Glu)-B30E人胰島素用胰蛋白酶解，酶解產(chǎn)物進(jìn)行LC-MS分析，結(jié)果顯示兩個(gè)片段F1和F2的分子量分別為4865和1403，與理論酶解片段分子量相符，其中片段F2對(duì)應(yīng)被修飾的B-鏈片段。證明修飾位點(diǎn)和預(yù)期一致。