本發(fā)明屬于生物提取領(lǐng)域，具體地涉及一種提取益生菌細(xì)胞壁骨架多糖的方法，適用于鼠李糖乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、乳雙歧桿菌等多種乳桿菌和雙歧桿菌。
背景技術(shù)：
：乳桿菌是細(xì)菌的一科，為革蘭氏染色陽(yáng)性、無(wú)芽孢桿菌，分解糖的主要終產(chǎn)物是乳酸，不發(fā)酵乳酸鹽。乳桿菌具有多種益生效果，它腸道黏著率高，定植能力強(qiáng)，并具有高效降膽固醇，促進(jìn)細(xì)胞分裂，可起到調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防和治療腹瀉、排除毒素、預(yù)防齲齒、提高機(jī)體免疫力及抗癌等重要的生理保健功能，是益生菌中重要的一大類。雙歧桿菌是1899年由法國(guó)學(xué)者Tissier從母乳營(yíng)養(yǎng)兒的糞便中分離出的一種厭氧的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，末端常常分叉，故名雙歧桿菌。雙歧桿菌在母乳喂養(yǎng)兒腸道內(nèi)大量存在，對(duì)嬰幼兒有許多好處，如營(yíng)養(yǎng)、免疫及抗感染作用。同時(shí)，雙歧桿菌還具有抗過(guò)敏、抗腫瘤、調(diào)整腸道功能及改善營(yíng)養(yǎng)等作用。腸道功能方面，雙歧桿菌可以預(yù)防腹瀉、減少便秘，即雙向調(diào)節(jié)，這種調(diào)節(jié)能起到預(yù)防和治療各種腸道疾病的效果。目前，關(guān)于益生菌免疫調(diào)節(jié)方面的活性，主要認(rèn)為是由菌株的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)引起的。細(xì)胞壁表面的大分子是益生菌與宿主之間相互作用的關(guān)鍵因子。益生菌細(xì)胞壁骨架結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的主要功能性物質(zhì)是肽聚糖，也稱黏肽，它通過(guò)肽橋聯(lián)接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成囊狀大分子，包圍整個(gè)細(xì)菌，具有免疫增強(qiáng)功能、抗感染、抗腫瘤、抗過(guò)敏等多種益生作用。目前研究證實(shí)，細(xì)胞壁骨架多糖介導(dǎo)了雙歧桿菌多種重要的生理功能，如抗腫瘤及免疫活性等，是機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別細(xì)菌的主要靶分子1985年，Sekine等建立了細(xì)胞壁完整肽聚糖的分離方法，此后，該方法在此類研究中作為唯一的分離方法被廣泛使用，整個(gè)過(guò)程需要15天左右。用該方法得到的細(xì)胞壁骨架多糖純度高、完整性好，但用時(shí)長(zhǎng)、成本高、操作復(fù)雜。若能找到一種細(xì)胞壁骨架多糖的提取方法，在保證純度高、完整性好的同時(shí)，又省時(shí)、低成本、易操作，將有助于今后對(duì)此方面進(jìn)行更深入的研究，也可以推進(jìn)細(xì)胞壁骨架多糖在食品、藥品等方面實(shí)際應(yīng)用上的發(fā)展。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種在保證純度高、完整性好的同時(shí)，省時(shí)、低成本、易操作的提取益生菌細(xì)胞壁骨架多糖的方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種提取益生菌細(xì)胞壁骨架多糖的方法，取益生菌，利用三氯乙酸(TCA)去除益生菌菌體中的磷壁酸，得沉淀；所得沉淀繼續(xù)利用氯仿-甲醇混合溶液去除益生菌菌體中脂類成分，得沉淀；所得沉淀繼續(xù)利用胰蛋白酶-中性蛋白酶混合酶液去除益生菌菌體中的蛋白質(zhì)。上述的提取益生菌細(xì)胞壁骨架多糖的方法，所述的利用三氯乙酸去除益生菌菌體中的磷壁酸，方法如下：將三氯乙酸溶液加入到益生菌菌體中，混合均勻，于65-75℃的水浴中處理1-1.5h，離心，取沉淀，洗滌。優(yōu)選的，每克益生菌菌體加入濃度為5-15％的三氯乙酸溶液5-15ml。上述的提取益生菌細(xì)胞壁骨架多糖的方法，所述的利用氯仿-甲醇混合溶液去除益生菌菌體中脂類成分，方法如下：按固液比1:15-25的比例，取經(jīng)三氯乙酸處理后所剩的沉淀和氯仿-甲醇混合溶液，混勻，靜置，離心棄掉上清液，取沉淀。優(yōu)選的，所述的氯仿-甲醇混合溶液的制備方法如下：按體積比1:1.5-2.5，取氯仿和甲醇，加入適量pH為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，混合均勻，所得溶液即為氯仿-甲醇混合溶液。上述的提取益生菌細(xì)胞壁骨架多糖的方法，所述的利用胰蛋白酶-中性蛋白酶混合酶液去除益生菌菌體中的蛋白質(zhì)，方法如下：按固液比1:4-6的比例，取經(jīng)氯仿-甲醇混合溶液處理后所剩的沉淀和胰蛋白酶-中性蛋白酶混合酶液，混勻，然后置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，在38℃溫度下振蕩培養(yǎng)35-40h，取出后，于12000r/min離心15-20min，棄掉上清液，沉淀分為兩層，保留上層沉淀，用適量甲醇反復(fù)離心清洗，直到上清液無(wú)色澄清透明為止，取沉淀即為益生菌細(xì)胞壁骨架多糖。優(yōu)選的，所述的胰蛋白酶-中性蛋白酶混合酶液的制備方法：按重量比1:4-5，取胰蛋白酶和中性蛋白酶，加入適量pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液，保證每種酶活力不小于250U/ml，攪拌均勻，所得溶液即為所需胰蛋白酶-中性蛋白酶混合酶液。上述的提取益生菌細(xì)胞壁骨架多糖的方法，所述的益生菌為乳桿菌和雙歧桿菌。優(yōu)選的，所述的乳桿菌為鼠李糖乳桿菌、羅伊氏乳桿菌或嗜酸乳桿菌；所述的雙歧桿菌為動(dòng)物雙歧桿菌或乳雙歧桿菌。本發(fā)明的有益效果是：1)本發(fā)明，利用TCA去除乳桿菌或雙歧桿菌菌體中磷壁酸，乳桿菌和雙歧桿菌都是革蘭氏陽(yáng)性菌，而磷壁酸是革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁特殊組份，它是由核糖醇或甘油殘基經(jīng)由磷酸二鍵互相連接而成的多聚物。磷壁酸與細(xì)胞壁的通透性有關(guān)，因此決定首先去除磷壁酸，使細(xì)胞通透性增加，這樣有利于外界物質(zhì)更好的作用于細(xì)胞，細(xì)胞的內(nèi)容物質(zhì)也可以更容易地從細(xì)胞內(nèi)排出。2)本發(fā)明，利用氯仿-甲醇混合溶液去除乳桿菌或雙歧桿菌菌體中脂類，常用的提取油脂的索氏抽提法，只能提取游離態(tài)的脂肪，而對(duì)脂蛋白、磷脂等結(jié)合態(tài)的脂類則不能被完全提取出來(lái)，另一種常用的酸水解法又會(huì)使磷脂水解而損失，而在一定水分存在的條件下，極性的甲醇與非極性的氯仿混合溶液，可以有效地提取結(jié)合態(tài)脂類。乳桿菌細(xì)胞內(nèi)含有大量磷脂、脂蛋白等結(jié)合態(tài)脂類，因此選用氯仿-甲醇混合溶液去除乳桿菌或雙歧桿菌菌體中的脂類。3)本發(fā)明，利用胰蛋白酶-中性蛋白酶混合酶液去除乳桿菌或雙歧桿菌菌體中蛋白質(zhì)，胰蛋白酶是一種蛋白質(zhì)水解酶，能選擇地水解蛋白質(zhì)中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鏈，能消化溶解變性蛋白質(zhì)，中性蛋白酶屬于一種內(nèi)切酶，可用于各種蛋白質(zhì)水解處理。4)本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，易于操作，制備的細(xì)胞壁骨架多糖純度高、完整性好。5天即可得到產(chǎn)品，大大縮短了制備時(shí)間。原料易得，極大地降低了成本。細(xì)胞壁骨架多糖的平均提取率為0.183g/L菌液。附圖說(shuō)明圖1是磷鉬藍(lán)比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2是香草醛法標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種提取益生菌細(xì)胞壁骨架多糖的方法(一)菌體的制備：MRS培養(yǎng)基配方：蛋白胨10g，牛肉粉10g，酵母浸粉5g，K2HPO42g，無(wú)水乙酸鈉5g，葡萄糖20g，MnSO4·7H2O0.58g，MnSO40.25g，檸檬氫二胺2g，蒸餾水1000ml。制備方法：1)按上述配方比例配制2800mlMRS培養(yǎng)基，置于高壓滅菌鍋內(nèi)，在115℃的溫度下滅菌20min，備用；2)挑取實(shí)驗(yàn)室保藏的鼠李糖乳桿菌于50mlMRS培養(yǎng)基中，然后置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃條件下振蕩培養(yǎng)12h；3)然后將此菌液，按2％的接種量，接種于2750mlMRS培養(yǎng)基中，然后置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃條件下振蕩培養(yǎng)12h；4)將培養(yǎng)好的鼠李糖乳桿菌菌液以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，棄掉上清液，將沉淀用無(wú)菌生理鹽水以同樣的轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間反復(fù)離心清洗，直至上清液無(wú)色，最后一次離心所得沉淀即為鼠李糖乳桿菌菌體；5)經(jīng)稱量，所得鼠李糖乳桿菌菌體濕重為23.3g。(二)益生菌細(xì)胞壁骨架多糖的提取1、利用TCA去除鼠李糖乳桿菌菌體中磷壁酸1.1TCA溶液的制備準(zhǔn)確稱取25gTCA于250ml容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，所得溶液即為濃度為10％的TCA溶液。1.2鼠李糖乳桿菌菌體中磷壁酸的去除準(zhǔn)確量取233ml濃度為10％的TCA溶液，加入到23.3g鼠李糖乳桿菌菌體中，用膠頭滴管反復(fù)吹打直到混勻，再在70℃的水浴條件下處理1h。水浴結(jié)束后，用高速冷凍離心機(jī)以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，棄掉上清液，然后再以同樣的轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間，將沉淀用適量甲醇離心清洗3次。1.3經(jīng)稱量，最后一次離心所得沉淀質(zhì)量為7.2g。2、利用氯仿-甲醇混合溶液去除鼠李糖乳桿菌菌體中脂類等成分2.1乙酸-乙酸鈉緩沖溶液的制備準(zhǔn)確量取0.3ml冰醋酸于100ml容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，所得溶液即為濃度為0.05M的乙酸溶液；準(zhǔn)確稱取0.164g乙酸鈉于100ml容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，所得溶液即為濃度為0.02M的乙酸鈉溶液。分別量取15m濃度為0.05M的乙酸溶液和濃度為0.02M的乙酸鈉溶液，用玻璃棒攪拌均勻，測(cè)量pH值，并用這兩種溶液調(diào)節(jié)混合溶液的pH到4.6，備用。所得溶液即為所需乙酸-乙酸鈉緩沖溶液。2.2氯仿-甲醇混合溶液的制備準(zhǔn)確量取30.3ml配制好的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、37.9ml氯仿和75.8ml甲醇，用玻璃棒攪拌使其三者混合均勻，所得溶液即為所需的氯仿-甲醇混合溶液。2.3鼠李糖乳桿菌菌體中脂類等成分的去除準(zhǔn)確量取144ml配制好的氯仿-甲醇混合溶液，按固液比1:20(w/v)的比例，加入到經(jīng)TCA處理后所剩的7.2g沉淀中，用膠頭滴管反復(fù)吹打直到混勻，靜置24小時(shí)，然后用高速冷凍離心機(jī)以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，棄掉上清液，再將沉淀用適量甲醇以相同的轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間離心清洗兩次。2.4經(jīng)稱量，最后一次離心所得沉淀質(zhì)量為6.917g。3、利用胰蛋白酶-中性蛋白酶混合酶液去除鼠李糖乳桿菌菌體中蛋白質(zhì)3.1磷酸鹽緩沖溶液的配制準(zhǔn)確稱取1.36gKH2PO4于100ml容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，所得溶液即為濃度為0.1M的KH2PO4溶液；準(zhǔn)確稱取0.4gNaOH于100ml容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，所得溶液即為濃度為0.1M的NaOH溶液。分別量取20ml濃度為0.1M的KH2PO4溶液和濃度為0.1M的NaOH溶液，用玻璃棒攪拌均勻，測(cè)量pH值，并用這兩種溶液調(diào)節(jié)混合溶液的pH到7.4，備用。所得溶液即為所需磷酸鹽緩沖溶液。3.2胰蛋白酶-中性蛋白酶混合酶液的配制準(zhǔn)確稱取34.6mg胰蛋白酶和144mg中性蛋白酶，加入到34.6ml磷酸鹽緩沖溶液中，每種酶活力均不小于250U/ml。然后用玻璃棒攪拌均勻，所得溶液即為所需胰蛋白酶-中性蛋白酶混合酶液。3.3乳桿菌菌體中蛋白質(zhì)的去除準(zhǔn)確量取34.6ml配制好的胰蛋白酶-中性蛋白酶混合酶液，按固液比1:5(w/v)的比例，加入到經(jīng)氯仿-甲醇混合溶液處理后所剩的6.917g沉淀中，用膠頭滴管反復(fù)吹打直到混勻，然后置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，在38℃溫度下振蕩培養(yǎng)36h。取出后，用高速冷凍離心機(jī)以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，棄掉上清液，此時(shí)可觀察到沉淀分為兩層，上層為乳白色的細(xì)胞壁骨架多糖，下層為淺棕色的未溶解的中性蛋白酶，棄掉下層的中性蛋白酶，保留上層的細(xì)胞壁骨架多糖部分，用適量甲醇仍以12000r/min、15min的轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間反復(fù)離心清洗，直到上清液無(wú)色澄清透明為止。將最后一次離心所得沉淀用真空冷凍干燥機(jī)凍干，即可得到干燥的鼠李糖乳桿菌細(xì)胞壁骨架多糖粉末。3.4經(jīng)稱量，凍干后，所得鼠李糖乳桿菌細(xì)胞壁骨架多糖質(zhì)量為0.478g，產(chǎn)率為0.177g/L菌液。(三)益生菌細(xì)胞壁骨架多糖純度檢測(cè)1、溶菌酶溶液的配制1.1磷酸鹽緩沖溶液的配制準(zhǔn)確稱取1.36gKH2PO4于100ml容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，所得溶液即為濃度為0.1M的KH2PO4溶液；準(zhǔn)確稱取0.4gNaOH于100ml容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，所得溶液即為濃度為0.1M的NaOH溶液。分別量取20ml濃度為0.1M的KH2PO4溶液和濃度為0.1M的NaOH溶液，用玻璃棒攪拌均勻，測(cè)量pH值，并用這兩種溶液調(diào)節(jié)混合溶液的pH到6.2，備用。所得溶液即為所需磷酸鹽緩沖溶液。1.2溶菌酶溶液的配制準(zhǔn)確稱取20mg溶菌酶于100ml容量瓶中，加入上述配制好的磷酸鹽緩沖溶液至刻度線，混勻，所得溶液即為所需的濃度為200μg/ml的溶菌酶溶液。2、樣品純度檢測(cè)準(zhǔn)確稱取適量樣品于溶菌酶溶液中，使樣品濃度為1mg/ml，隨后放入溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為120r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，12h后取出，用高速冷凍離心機(jī)，以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，棄上清，沉淀用蒸餾水反復(fù)清洗，然后烘干、稱量。另外，準(zhǔn)確量取等體積的、不加樣品的溶菌酶溶液，作與上述相同的處理，作為空白對(duì)照。按下式計(jì)算樣品純度：計(jì)算公式：A＝[1-(m1-m0)/m]×100％＝[1-(4-0)/20]×100％＝80％式中：A-樣品純度m1-樣品最終不溶物質(zhì)量(mg)m0-空白對(duì)照組最終不溶物質(zhì)量(mg)m-初始樣品質(zhì)量(mg)獲得的產(chǎn)品在溶菌酶溶液中可溶，說(shuō)明獲得的就是鼠李糖乳桿菌細(xì)胞壁骨架多糖。實(shí)施例2一種提取益生菌細(xì)胞壁骨架多糖的方法(一)菌體的制備：MRS培養(yǎng)基配方：蛋白胨10g，牛肉粉10g，酵母浸粉5g，K2HPO42g，無(wú)水乙酸鈉5g，葡萄糖20g，MnSO4·7H2O0.58g，MnSO40.25g，檸檬氫二胺2g，蒸餾水1L。制備方法：1)按上述配方比例配制MRS培養(yǎng)基，置于高壓滅菌鍋內(nèi)，在115℃的溫度下滅菌20min，備用；2)挑取實(shí)驗(yàn)室保藏的鼠李糖乳桿菌于10mlMRS培養(yǎng)基中，然后置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃條件下振蕩培養(yǎng)12h；3)將此菌液，按2％的接種量，接種于100mlMRS培養(yǎng)基中，然后置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃條件下振蕩培養(yǎng)12h；4)再將此菌液，按2％的接種量，接種于3LMRS培養(yǎng)基中，然后置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃條件下振蕩培養(yǎng)12h；5)將培養(yǎng)好的鼠李糖乳桿菌菌液以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，棄掉上清液，將沉淀用無(wú)菌生理鹽水以同樣的轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間反復(fù)離心清洗，直至上清液無(wú)色，最后一次離心所得沉淀即為鼠李糖乳桿菌菌體。(二)去除磷壁酸方法的選擇將上述離心所得菌體按重量平均分為4份，分別用以下方法處理。最后，用終樣品中的磷含量來(lái)確定磷壁酸的去除程度。1、冷TCA法1.1TCA溶液的配制準(zhǔn)確稱取25gTCA于250ml容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，所得溶液即為濃度10％的TCA溶液。1.2樣品處理方法取一份上述樣品，按固液比1:10加入預(yù)冷至4℃、濃度為10％的TCA溶液，4℃攪拌處理24h，然后以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，棄掉上清液。剩余的沉淀用無(wú)菌水以同樣的轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間離心清洗5次，再依次用乙醇、丙酮、乙醚連續(xù)離心清洗，然后檢測(cè)樣品中磷含量。2、熱TCA法2.1TCA溶液的配制準(zhǔn)確稱取25gTCA于250ml容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，所得溶液即為濃度為10％的TCA溶液。2.2樣品處理方法取一份上述樣品，按固液比1:10加入預(yù)熱至70℃、濃度為10％的TCA溶液，70℃水浴攪拌處理1h，然后以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，棄掉上清液。剩余的沉淀用無(wú)菌水以同樣的轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間離心清洗5次，再依次用乙醇、丙酮、乙醚連續(xù)離心清洗，然后檢測(cè)樣品中磷含量。3、冷酚法3.1苯酚溶液的配制準(zhǔn)確稱取80g苯酚于100ml容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，所得溶液即為濃度為80％的苯酚溶液。3.2樣品處理方法取一份上述樣品，加入等體積預(yù)冷至4℃、濃度為80％的苯酚，4℃攪拌處理24h，然后以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心20分鐘。上清液分層，移出上層水相，酚相及不溶性殘?jiān)尤氲润w積濃度為0.02mol/L的碳酸鈉溶液。剩余的沉淀用無(wú)菌水以同樣的轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間離心清洗5次，再依次用乙醇、丙酮、乙醚連續(xù)離心清洗，然后檢測(cè)樣品中磷含量。4、熱酚法4.1苯酚溶液的配制準(zhǔn)確稱取80g苯酚于100ml容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，所得溶液即為濃度為80％的苯酚溶液。4.2樣品處理方法取一份上述樣品，加入等體積預(yù)熱至65℃、濃度為80％的苯酚，65℃攪拌處理1h，然后以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心20分鐘。上清液分層，移出上層水相，酚相及不溶性殘?jiān)尤氲润w積濃度為0.02mol/L的碳酸鈉溶液。剩余的沉淀用無(wú)菌水以同樣的轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間離心清洗5次，再依次用乙醇、丙酮、乙醚連續(xù)離心清洗，然后檢測(cè)樣品中磷含量。5、磷含量的測(cè)定采用鉬藍(lán)比色法分別對(duì)上述4組處理過(guò)的菌體進(jìn)行磷含量的測(cè)定，具體方法如下：5.1各種溶液的配制準(zhǔn)確稱取0.143gKH2PO4于1L容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，即得濃度為100μg/ml的磷酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液；準(zhǔn)確量取30ml硝酸和70ml水，混勻，即得濃度為30％的硝酸溶液；精確稱取0.5g偏釩酸銨于100ml容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，即得濃度為0.5％的偏釩酸銨溶液；精確稱取10g鉬酸銨于100ml容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，即得濃度為10％的鉬酸銨溶液；準(zhǔn)確稱取1.5g抗壞血酸于100ml容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，即得濃度為1.5％的抗壞血酸溶液。5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制在50ml比色管中分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml的磷酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后依次加入硝酸溶液10ml、偏釩酸銨溶液5ml、鉬酸銨溶液5ml、抗壞血酸溶液5ml，加水定容至50ml，搖勻，水平放置10min后，用紫外分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)660nm的條件下，測(cè)定各管吸光值，并根據(jù)此值繪制磷酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線。5.3樣品預(yù)處理將樣品放入蒸發(fā)皿中，小火微熱以除去水分后，再將此樣品置于馬福爐中，600℃灰化處理12h，最后將灰分定容至10ml的容量瓶中。5.4樣品中磷含量的測(cè)定取1ml上述制備好的樣液，加入到50ml比色管中，然后依次加入硝酸溶液10ml、偏釩酸銨溶液5ml、鉬酸銨溶液5ml、抗壞血酸溶液5ml，加水定容至50ml，搖勻，水平放置10min后，用紫外分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)660nm的條件下，測(cè)定吸光值，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中磷含量。經(jīng)檢測(cè)，結(jié)果如表1：表1處理方法冷TCA法熱TCA法冷酚法熱酚法磷含量(μg)92.3282.73150154.7由表1可知，經(jīng)熱TCA法處理后的樣品，磷含量最低，因此選擇熱TCA法作為去除磷壁酸的方法。(三)脫脂方法的選擇1、樣品的處理各取5g鼠李糖乳桿菌菌泥，經(jīng)上述熱TCA法處理后，分別按固液比1:20加入氯仿-甲醇混合溶液、乙醚、己烷和丙酮，靜置24h，然后以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，棄上清，再以相同的轉(zhuǎn)速用甲醇離心清洗2次。沉淀?yè)]發(fā)有機(jī)溶劑后，烘干。2、香草醛法測(cè)樣品中脂肪含量2.1各溶液的配制準(zhǔn)確稱取1g膽固醇于100ml容量瓶中，加冰乙酸定容至刻度線，搖勻，所得即濃度為10mg/ml的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液；準(zhǔn)確稱取15g香草醛，加入250ml乙醇和2.5ml濃硫酸，混勻，所得即為香草醛硫酸顯色劑。2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按下表加入各溶液：編號(hào)1234膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液(ml)00.10.20.3無(wú)水乙醇(ml)10.90.80.7膽固醇濃度(mg/ml)0123將上述膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液與乙醇搖勻后，分別取0.02ml，加入1ml濃硫酸，混勻，然后100℃水浴10min，冷卻至室溫后加入4ml顯色劑，室溫下靜置20min，用紫外分光光度計(jì)，于525nm處測(cè)吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.3樣品中脂肪含量的測(cè)定準(zhǔn)確稱取100mg樣品，用1ml冰乙酸溶解，取0.02ml，加入1ml濃硫酸，混勻，然后100℃水浴10min，冷卻至室溫后加入4ml顯色劑，室溫靜置20min，用紫外分光光度計(jì)，于525nm處測(cè)吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算脂肪含量。結(jié)果如表2：表2脫脂試劑氯仿-甲醇混合溶液乙醚己烷丙酮樣品脂肪含量(mg/g)34.146.354.844.1由表2可知，經(jīng)氯仿-甲醇混合溶液處理后的樣品中脂肪含量最少，因此選擇氯仿-甲醇溶液來(lái)脫脂。(四)除蛋白方法的選擇1、4種混合酶液的配制1.1磷酸鹽緩沖溶液的配制準(zhǔn)確稱取1.36gKH2PO4于100ml容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，所得溶液即為濃度為0.1M的KH2PO4溶液；準(zhǔn)確稱取0.4gNaOH于100ml容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，所得溶液即為濃度為0.1M的NaOH溶液。分別量取20m濃度為0.1M的KH2PO4溶液和濃度為0.1M的NaOH溶液，用玻璃棒攪拌均勻，測(cè)量pH值，并用這兩種溶液調(diào)節(jié)混合溶液的pH到7.4，備用。所得溶液即為所需磷酸鹽緩沖溶液。1.24種混合酶液的配制準(zhǔn)確稱取適量胰蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，分別溶于適量磷酸鹽緩沖溶液中，保證每種酶活力均不小于250U/ml，攪拌均勻后，所得溶液即分別為所需的胰蛋白酶液、胰蛋白酶-中性蛋白酶混合酶液、胰蛋白酶-堿性蛋白酶混合酶液、胰蛋白酶-木瓜蛋白酶混合酶液。2、樣品的處理將鼠李糖乳桿菌菌泥，經(jīng)上述熱TCA法和氯仿-甲醇混合溶液處理后，平均分為4份，分別按固液比1:5加入4種酶液，同時(shí)放進(jìn)恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，38℃水解處理36h，然后以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，保留上清液。3、甲醛電位滴定法測(cè)上清液中游離氨基氮含量3.1各種溶液的配制準(zhǔn)確稱取0.4gNaOH于100ml容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，所得溶液即濃度為0.1mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液；向60-80℃熱水中，不斷加入草酸鉀，直至飽和為止，用0.1mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.4，所得即所需的飽和草酸鉀溶液；將濃度為37％的甲醛溶液，用0.1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.4，所得即所需的甲醛溶液。3.2氨基氮的檢測(cè)將樣品上清液用蒸餾水稀釋至100ml，加入2ml飽和草酸鉀溶液，攪勻，靜置2min，用0.1mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)pH至8.4，然后加入10ml甲醛溶液，攪勻，靜置2min，用0.1mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH8.4，記錄消耗NaOH溶液體積V1ml。用100ml蒸餾水重復(fù)上述步驟，作為空白對(duì)照，最后消耗NaOH溶液體積為V0ml。計(jì)算公式：C＝(V1-V0)×1.4/(V樣×1000)式中：C-游離氨基氮含量(mg/L)V1-樣品上清液消耗NaOH溶液體積(ml)V0-空白對(duì)照消耗NaOH溶液體積(ml)V樣-樣品上清液體積(ml)結(jié)果如表3所示。表3酶種類上清液氨基氮含量(mg/L)胰蛋白酶508胰蛋白酶-堿性蛋白酶683胰蛋白酶-中性蛋白酶726胰蛋白酶-木瓜蛋白酶635由表3可知，胰蛋白酶-中性蛋白酶混合溶液水解后的游離氨基氮含量最高，說(shuō)明其蛋白質(zhì)水解程度最好，因此選擇胰蛋白酶-中性蛋白酶混合酶液來(lái)去除蛋白質(zhì)。實(shí)施例3一種提取益生菌細(xì)胞壁骨架多糖的方法方法同實(shí)施例1，只是將鼠李糖乳桿菌分別替換為羅伊氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌和乳雙歧桿菌，分別得到干燥的四種益生菌細(xì)胞壁骨架多糖粉末。經(jīng)稱量，凍干后，所得各菌體純度與產(chǎn)率如表4所示。表4當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3