本發(fā)明克隆表達(dá)了一種酯酶，并公開了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用，屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

阿魏酸酯酶(Feruloyl esterases，F(xiàn)AEs)又稱肉桂酸酯酶，它是一種羧酸酯酶，是能水解阿魏酸甲酯、低聚糖酯酶和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，釋放游離阿魏酸的酶。它能切斷細(xì)胞壁中多糖-多糖、多糖-木質(zhì)素間的交聯(lián)，有利于細(xì)胞壁物質(zhì)中多糖的降解和木質(zhì)素的釋放，因此在食品、飼料和造紙工業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。在食品工業(yè)中，利用酯酶來降解植物細(xì)胞壁中的阿魏酸酯鍵，可以得到有藥用價(jià)值和保健功能的游離阿魏酸。而植物性原材料通過酯酶的處理使細(xì)胞壁變得疏松，作為飼料工業(yè)的原料更容易被禽畜消化利用，作為制漿造紙工業(yè)的原料可以減少制漿工序化化學(xué)藥品的使用，減少污染，并有利于后續(xù)工序的進(jìn)行。

1987年，阿魏酸酯酶在Streptomyces olivochromogenes中被第一次發(fā)現(xiàn)。研究表明真菌、細(xì)菌、酵母都能分泌阿魏酸酯酶，目前發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)酶微生物有黑曲霉(Aaspergillus niger)，鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)，梭菌(Clostridium thermocellum)，乳酸桿菌(Lactobacilli sp.)，假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)等，但絕大多數(shù)阿魏酸酯酶是從真菌中分離出來的。研究發(fā)現(xiàn)一些乳酸桿菌有較強(qiáng)的阿酸酯酶活性，并且已經(jīng)從中克隆表達(dá)出阿魏酸酯酶的基因(Wang,X.K., et al.(2004)."Purification and characterization of a feruloyl esterase from the intestinal bacterium Lactobacillus acidophilus."Appl Microbiol Biot 70(4):2367-2372；Biochemical Properties of Two Cinnamoyl Esterases Purified from a Lactobacillus johnsonii Strain Isolated from Stool Samples of Diabetes-Resistant Rats，Appl Microbiol Biot，2009，5(15)，5018–5024；)。之前有報(bào)道芽孢桿菌也有阿魏酸酯酶活性(J.DonaghyáP.F.KellyáA.M.McKay(1998)."Detection of ferulic acid esterase production by Bacillus spp.and lactobacilli."Appl Microbiol Biotechnol 50:257-260)，但未有相關(guān)的基因及蛋白序列報(bào)道。我們在前面的三個(gè)專利(201610158987.9,201610154877.5,201610154846.X)中已經(jīng)公布了解淀粉芽孢桿菌中的相關(guān)基因序列。本專利進(jìn)一步公開了一株芽孢桿菌中的一種新型阿魏酸酯酶。與NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該酯酶與短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)中的假設(shè)的酯酶相似度最高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明從芽孢桿菌中克隆得到了一個(gè)新型的酯酶基因，利用大腸桿菌工程菌異源表達(dá)，公開了其相關(guān)的酶學(xué)特性。并用它進(jìn)行了阿魏酸提取的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

1、菌株

本發(fā)明酯酶基因的來源菌株為：Bacillus sp.SYBC hb4(由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏編號(hào)CCTCC NO:M2015018)。 保藏日期是二零一五年一月七日；保藏地址是中國武漢武漢大學(xué)。

2、酯酶基因的克隆

提取Bacillus sp.SYBC hb4菌體基因組總DNA。設(shè)計(jì)特異性引物，應(yīng)用PCR方法，擴(kuò)增出酯酶基因全長編碼框序列。并構(gòu)建重組質(zhì)粒。

3、酯酶表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)。菌體破碎后得到粗酶液，純化后冷凍干燥備用。

4、酯酶酶學(xué)性質(zhì)

以阿魏酸甲酯為底物研究pH對(duì)本發(fā)明所述酯酶酶活的影響。

以阿魏酸甲酯為底物研究溫度對(duì)本發(fā)明所述酯酶酶活的影響。

以阿魏酸甲酯為底物測定了Ca²⁺、K⁺、Na⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Ni⁺、Co⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺等離子對(duì)酶活的影響。

酯酶的底物特性分析：所用的底物有乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、葵酸乙酯、乙酸乙烯酯、三甲基乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、甲基丙烯酸乙烯酯、正丁酸乙烯酯、巴豆酸乙烯酯、乙烯葵酸酯、月桂酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯、乙酸異丙烯酯、乙酸異丁酯、乙酸丁酯、乙酸香葉酯、乙酸苯酯、乙酸-1-萘酯、乙酸-2-萘酯、三-O-乙酰基-D葡萄烯糖、α-D(+)五乙酰葡萄糖、乳酸甲酯、己酸甲酯、辛酸甲酯、二氫茉莉酮酸甲酯、溴乙酸甲酯、2-溴丙酸甲酯、溴苯乙酸甲酯、甲基扁桃酸酯、(R)-(-)-扁桃酸甲酯、2，6-二羥基-4-甲基苯甲酸甲酯、4-硝基-苯基乙酸、4-硝基苯丁酸酯、4-硝基苯基辛酸酯、阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯、咖啡酸乙酯、咖啡酸苯乙酯、對(duì)香豆酸甲酯、綠原酸、肉桂酸卞酯。

酶活測定方法為：20mM磷酸緩沖液，20ug/ml冷凍干燥的純酶，1mM底物，水浴控溫反應(yīng)30min，沸水浴100℃加熱3分鐘終止反應(yīng)。用高效液相色譜檢測底物減少量，高效液相色譜檢測條件為：0-15min 10-100％乙腈、90-0％水(0.1％甲酸)；15-20min 100％乙腈、0水；20-30min 10％乙腈、90％水(0.1％甲酸)，檢測器為Alltech 3300型蒸發(fā)光散射檢測器。溫度、pH、離子、底物的影響均采用該體系。

5.研究該脂酶對(duì)自然底物去淀粉麩皮的活性。

去淀粉麩皮按照文獻(xiàn)的方法制備(Xylan-hydrolysing enzymes from Streptomyces spp.Enzyme Microb Tech，1988，10(7):403–409.)。麩皮中阿魏酸的總量以堿法提取得到的阿魏酸計(jì)算(Preparation of ferμlic acid from agricμltural wastes:Its improved extraction and purification.Journal of Agricμltural and Food Chemistry，2008，56(17):7644–7648.)。阿魏酸釋放率為阿魏酸的酶解釋放量占?jí)A提取的阿魏酸總量的百分率

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

本實(shí)施例為本發(fā)明所述酯酶基因的克隆與大腸桿菌工程菌構(gòu)建。

1、Bacillus sp.SYBC hb4DNA的提取

將Bacillus sp.SYBC hb4菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)，12,000rmp/min離心10分鐘得到菌體，應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(TaKaRa公司)按照其操作提取Bacillus sp.SYBC hb4菌體基因組總DNA，放冰箱備用。

2、大腸桿菌感受態(tài)制備

(1)接種E.coli DH5α和BL21(DE3)分別于含有20mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37℃、200rpm/min培養(yǎng)過夜。

(2)按1％接種量接種于50mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600約0.6(約2～3h)。

(3)將菌液轉(zhuǎn)移到50mL預(yù)冷的離心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃離心5min。

(4)棄上清，加入5mL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液，使菌體懸浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃離心5min。重復(fù)2次。

(5)棄上清，加入1.5mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液，含有15％的甘油，輕輕懸浮菌體，然后100μL分裝到1.5mL離心管中，-70℃冰箱保藏備用。

3、酯酶基因的克隆

(1)引物設(shè)計(jì)

分析Bacillus sp.SYBC hb4的全基因組DNA，與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知的約氏乳酸桿菌酯酶對(duì)比，設(shè)計(jì)引物序列為：

引物1：5'GCCGGGATCC ATGAACTTAGACGAACAAATC 3'

引物2：5'GCCGTCTAGA TTATTCAAACGCCTTCTTAAG 3'

(2)PCR擴(kuò)增

用以上合成的兩條引物，以Bacillus sp.SYBC hb4的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

本步驟中擴(kuò)增體系為：

擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>

94℃，10min

94℃，30sec；55℃，30sec；72℃1min反應(yīng)30個(gè)循環(huán)

72℃，10min

PCR產(chǎn)物送華大基因測序后得到該酯酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根據(jù)該基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

(3)雙酶切和連接

將pCold-Ⅱ質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切體系為：10×cut buffer3μl，DNA 4μl，酶Bam H I和Xba I各0.5μl，無菌水2μl共30μl。37℃水浴中切1h。將DNA片段克隆到pCold-ⅡVector上，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。連接體系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，載體DNA 2μl，T4DNA ligase 1μl，無菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下連接12h-16h。

(4)轉(zhuǎn)化

步驟：

1在連接體系中加入100μl DH5α感受態(tài)細(xì)菌，輕混勻，冰浴30min。

2放入預(yù)熱的42℃水浴中，放置90s進(jìn)行熱休克處理。

3立即冰浴2min。

4加入1ml不含抗生素的LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)1h使菌復(fù)蘇。

5均勻的涂布在含抗生素的LB培養(yǎng)基上。

6培養(yǎng)24h長勢良好。挑單菌落進(jìn)行菌落PCR，核酸電泳驗(yàn)證，提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL21大腸桿菌感受態(tài)中，保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2

本實(shí)施例為本發(fā)明所述酯酶的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化。

1、加500μl重組菌液到50ml搖瓶。37℃培養(yǎng)2.5h，15℃下靜置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷誘導(dǎo)培養(yǎng)24h。將發(fā)酵液進(jìn)行離心(8,000rmp/min，10min)得到菌體，用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(20mmol/L，pH7.0)復(fù)溶菌體，超聲破碎儀破碎，離心(8,000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。

2、將步驟1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白純化系統(tǒng)操作進(jìn)行鎳柱純化，洗脫方法為：將A1、A2、B1、B2四根管路都放進(jìn)水里，設(shè)置system flow 20ml/min流速，進(jìn)行排氣。然后設(shè)置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均勻流出后裝柱子，平衡十分鐘之后把A1放進(jìn)結(jié)合液中，B1放進(jìn)洗脫液中，再進(jìn)行排氣一次，平衡二十分鐘，然后上樣粗酶液，用500mM的高濃度咪唑緩沖液B1梯度洗脫目的蛋白，將吸附在離子柱上的蛋白洗脫下來，收集有酶活的洗脫液用超濾管(30-kDa)進(jìn)行濃縮，得到純化的酶。純化后的酶經(jīng)冷凍干燥備用。

實(shí)施例3

本實(shí)施例為本發(fā)明所述酯酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性。以阿魏酸甲酯為底物，將底物與pH為7.0的磷酸緩沖液在25-70℃不同的溫度條件下水浴1h測定酯酶的酶活，確定酶的最適反應(yīng)溫度為45℃。

實(shí)施例4

本實(shí)施例為本發(fā)明所述酯酶的最適pH值及pH穩(wěn)定性。以阿魏酸甲酯為底物，將底物在pH3-9，35℃水浴1h測定酯酶的酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH7條件下測得的酯酶酶活最高。

實(shí)施例5

本實(shí)施例為不同金屬離子對(duì)酯酶酶活的影響。將實(shí)施例中純化得到的酶置于濃度為1mM的不同金屬離子的2ml溶液中30分鐘后測定其剩余酶活發(fā)現(xiàn) Fe²⁺，Zn²⁺和Cu²⁺作用1h后，酶活損失較大；Ca²⁺、Mg²⁺促進(jìn)酶活上升；其他離子影響不大。結(jié)果如表1所示。

表1 金屬離子對(duì)BpFae12酶活性的影響

實(shí)施例6

本實(shí)施例為酯酶與不同底物的反應(yīng)特性，列于表2中。由表2可以看出，該酯酶具有廣泛的底物，對(duì)于羥基肉桂酸脂類表現(xiàn)出了很強(qiáng)的活力，屬于阿魏酸酯酶。

表2 BpFae12酯酶對(duì)不同底物的活性

實(shí)施例7

本實(shí)施例為酯酶水解去淀粉麩皮產(chǎn)阿魏酸的應(yīng)用。200g麩皮，加入純化并冷凍干燥后的酯酶40mg，加水1000ml，pH自然，40℃保溫12小時(shí)，測定 得阿魏酸的釋放率為68.3％。