本發(fā)明克隆表達了一種酯酶，并公開了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用，屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

阿魏酸酯酶(Feruloyl esterases，F(xiàn)AEs)又稱肉桂酸酯酶，它是一種羧酸酯酶，是能水解阿魏酸甲酯、低聚糖酯酶和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，釋放游離阿魏酸的酶。它能切斷細胞壁中多糖-多糖、多糖-木質(zhì)素間的交聯(lián)，有利于細胞壁物質(zhì)中多糖的降解和木質(zhì)素的釋放，因此在食品、飼料和造紙工業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。在食品工業(yè)中，利用酯酶來降解植物細胞壁中的阿魏酸酯鍵，可以得到有藥用價值和保健功能的游離阿魏酸。而植物性原材料通過酯酶的處理使細胞壁變得疏松，作為飼料工業(yè)的原料更容易被禽畜消化利用，作為制漿造紙工業(yè)的原料可以減少制漿工序化化學(xué)藥品的使用，減少污染，并有利于后續(xù)工序的進行。

1987年，阿魏酸酯酶在Streptomyces olivochromogenes中被第一次發(fā)現(xiàn)。研究表明真菌、細菌、酵母都能分泌阿魏酸酯酶，目前發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)酶微生物有黑曲霉(Aaspergillus niger)，鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)，梭菌(Clostridium thermocellum)，乳酸桿菌(Lactobacilli sp.)，假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)等，但絕大多數(shù)阿魏酸酯酶是從真菌中分離出來的。研究發(fā)現(xiàn)一些乳酸桿菌有較強的阿酸酯酶活性，并且已經(jīng)從中克隆表達出阿魏酸酯酶的基因(Wang,X.K., et al.(2004)."Purification and characterization of a feruloyl esterase from the intestinal bacterium Lactobacillus acidophilus."Appl Microbiol Biot 70(4):2367-2372；Biochemical Properties of Two Cinnamoyl Esterases Purified from a Lactobacillus johnsonii Strain Isolated from Stool Samples of Diabetes-Resistant Rats，Appl Microbiol Biot，2009，5(15)，5018–5024；)。之前有報道芽孢桿菌也有阿魏酸酯酶活性(J.Donaghy á P.F.Kelly á A.M.McKay(1998)."Detection of ferulic acid esterase production by Bacillus spp.and lactobacilli."Appl Microbiol Biotechnol 50:257-260)，但未有相關(guān)的基因及蛋白序列報道。我們在前面的三個專利(201610158987.9,201610154877.5,201610154846.X)中已經(jīng)公布了解淀粉芽孢桿菌中的相關(guān)基因序列。本專利進一步公開了一株芽孢桿菌中的一種新型阿魏酸酯酶。與NCBI數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，該酯酶與短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)中的假設(shè)的酯酶相似度最高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明從芽孢桿菌中克隆得到了一個新型的酯酶基因，利用大腸桿菌工程菌異源表達，公開了其相關(guān)的酶學(xué)特性。并用它進行了阿魏酸提取的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

1、菌株

本發(fā)明酯酶基因的來源菌株為：Bacillus sp.SYBC hb4(由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏編號CCTCC NO:M2015018)。保藏日期是2015年1月7日；保藏地址是中國武漢，武漢大學(xué)。

2、酯酶基因的克隆

提取Bacillus sp.SYBC hb4菌體基因組總DNA。設(shè)計特異性引物，應(yīng)用PCR方法，擴增出酯酶基因全長編碼框序列。并構(gòu)建重組質(zhì)粒。

3、酯酶表達與純化

將重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)中，誘導(dǎo)表達。菌體破碎后得到粗酶液，純化后冷凍干燥備用。

4、酯酶酶學(xué)性質(zhì)

以阿魏酸甲酯為底物研究pH對本發(fā)明所述酯酶酶活的影響。

以阿魏酸甲酯為底物研究溫度對本發(fā)明所述酯酶酶活的影響。

以阿魏酸甲酯為底物測定了Ca²⁺、K⁺、Na⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Ni⁺、Co⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺等離子對酶活的影響。

酯酶的底物特性分析：所用的底物有乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、葵酸乙酯、乙酸乙烯酯、三甲基乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、甲基丙烯酸乙烯酯、正丁酸乙烯酯、巴豆酸乙烯酯、乙烯葵酸酯、月桂酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯、乙酸異丙烯酯、乙酸異丁酯、乙酸丁酯、乙酸香葉酯、乙酸苯酯、乙酸-1-萘酯、乙酸-2-萘酯、三-O-乙?；?D葡萄烯糖、α-D(+)五乙酰葡萄糖、乳酸甲酯、己酸甲酯、辛酸甲酯、二氫茉莉酮酸甲酯、溴乙酸甲酯、2-溴丙酸甲酯、溴苯乙酸甲酯、甲基扁桃酸酯、(R)-(-)-扁桃酸甲酯、2，6-二羥基-4-甲基苯甲酸甲酯、4-硝基-苯基乙酸、4-硝基苯丁酸酯、4-硝基苯基辛酸酯、阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯、咖啡酸乙酯、咖啡酸苯乙酯、對香豆酸甲酯、綠原酸、肉桂酸卞酯。

酶活測定方法為：20mM磷酸緩沖液，20ug/ml冷凍干燥的純酶，1mM底物，水浴控溫反應(yīng)30min，沸水浴100℃加熱3分鐘終止反應(yīng)。用高效液相色譜檢測底物減少量，高效液相色譜檢測條件為：0-15min 10-100％乙腈、90-0％水(0.1％甲酸)；15-20min 100％乙腈、0水；20-30min 10％乙腈、90％水(0.1％甲酸)，檢測器為Alltech 3300型蒸發(fā)光散射檢測器。溫度、pH、離子、底物的影響均采用該體系。

5.研究該脂酶對自然底物去淀粉麩皮的活性。

去淀粉麩皮按照文獻的方法制備(Xylan-hydrolysing enzymes from Streptomyces spp.Enzyme Microb Tech，1988，10(7):403–409.)。麩皮中阿魏酸的總量以堿法提取得到的阿魏酸計算(Preparation of ferμlic acid from agricμltural wastes:Its improved extraction and purification.Journal of Agricμltural and Food Chemistry，2008，56(17):7644–7648.)。阿魏酸釋放率為阿魏酸的酶解釋放量占堿提取的阿魏酸總量的百分率

具體實施方式

實施例1

本實施例為本發(fā)明所述酯酶基因的克隆與大腸桿菌工程菌構(gòu)建。

1、Bacillus sp.SYBC hb4DNA的提取

將Bacillus sp.SYBC hb4菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時，12,000rmp/min離心10分鐘得到菌體，應(yīng)用細菌基因組DNA抽提試劑盒(TaKaRa公司)按照其操作提取Bacillus sp.SYBC hb4菌體基因組總DNA，放冰箱備用。

2、大腸桿菌感受態(tài)制備

(1)接種E.coli DH5α和BL21(DE3)分別于含有20mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37℃、200rpm/min培養(yǎng)過夜。

(2)按1％接種量接種于50mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600約0.6(約2～3h)。

(3)將菌液轉(zhuǎn)移到50mL預(yù)冷的離心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃離心5min。

(4)棄上清，加入5mL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液，使菌體懸浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃離心5min。重復(fù)2次。

(5)棄上清，加入1.5mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液，含有15％的甘油，輕輕懸浮菌體，然后100μL分裝到1.5mL離心管中，-70℃冰箱保藏備用。

3、酯酶基因的克隆

(1)引物設(shè)計

分析Bacillus sp.SYBC hb4的全基因組DNA，與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知的約氏乳酸桿菌酯酶對比，設(shè)計引物序列為：

引物1：5'GCCGGGATCC ATGGTGAAGAAAACAGGCATC 3'

引物2：5'GCCGTCTAGA TCAGTTGATTAACGAATATGGG 3'

(2)PCR擴增

用以上合成的兩條引物，以Bacillus sp.SYBC hb4的基因組DNA為模板進行PCR擴增。

本步驟中擴增體系為：

擴增程序為：

94℃，10min

94℃，30sec；55℃，30sec；72℃1min反應(yīng)30個循環(huán)

72℃，10min

PCR產(chǎn)物送華大基因測序后得到該酯酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根據(jù)該基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

(3)雙酶切和連接

將pCold-Ⅱ質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進行雙酶切，酶切體系為：10×cut buffer 3μl，DNA 4μl，酶Bam H I和Xba I各0.5μl，無菌水2μl共30μl。37℃水浴中切1h。將DNA片段克隆到pCold-ⅡVector上，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞中。連接體系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，載體DNA 2μl，T4DNA ligase 1μl，無菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下連接12h-16h。

(4)轉(zhuǎn)化

步驟：

1在連接體系中加入100μl DH5α感受態(tài)細菌，輕混勻，冰浴30min。

2放入預(yù)熱的42℃水浴中，放置90s進行熱休克處理。

3立即冰浴2min。

4加入1ml不含抗生素的LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)1h使菌復(fù)蘇。

5均勻的涂布在含抗生素的LB培養(yǎng)基上。

6培養(yǎng)24h長勢良好。挑單菌落進行菌落PCR，核酸電泳驗證，提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL21大腸桿菌感受態(tài)中，保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2

本實施例為本發(fā)明所述酯酶的誘導(dǎo)表達及分離純化。

1、加500μl重組菌液到50ml搖瓶。37℃培養(yǎng)2.5h，15℃下靜置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷誘導(dǎo)培養(yǎng)24h。將發(fā)酵液進行離心(8,000rmp/min，10min)得到菌體，用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(20mmol/L，pH7.0)復(fù)溶菌體，超聲破碎儀破碎，離心(8,000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。

2、將步驟1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白純化系統(tǒng)操作進行鎳柱純化，洗脫方法為：將A1、A2、B1、B2四根管路都放進水里，設(shè)置system flow 20ml/min流速，進行排氣。然后設(shè)置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均勻流出后裝柱子，平衡十分鐘之后把A1放進結(jié)合液中，B1放進洗脫液中，再進行排氣一次，平衡二十分鐘，然后上樣粗酶液，用500mM的高濃度咪唑緩沖液B1梯度洗脫目的蛋白，將吸附在離子柱上的蛋白洗脫下來，收集有酶活的洗脫液用超濾管(30-kDa)進行濃縮，得到純化的酶。純化后的酶經(jīng)冷凍干燥備用。

實施例3

本實施例為本發(fā)明所述酯酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性。以阿魏酸甲酯為底物，將底物與pH為7.0的磷酸緩沖液在25-70℃不同的溫度條件下水浴1h測定酯酶的酶活，確定酶的最適反應(yīng)溫度為35℃。

實施例4

本實施例為本發(fā)明所述酯酶的最適pH值及pH穩(wěn)定性。以阿魏酸甲酯為底物，將底物在pH3-9，35℃水浴1h測定酯酶的酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH 6.5條件下測得的酯酶酶活最高。

實施例5

本實施例為不同金屬離子對酯酶酶活的影響。將實施例中純化得到的酶置于濃度為1mM的不同金屬離子的2ml溶液中30分鐘后測定其剩余酶活發(fā)現(xiàn) Ca²⁺、Fe²⁺，Zn²⁺和Cu²⁺作用1h后，酶活損失較大；Mn²⁺、Mg²⁺、Co⁺促進酶活上升；其他金屬離子對酶活沒有明顯的影響。結(jié)果如表1所示。

表1金屬離子對BpFae15酶活性的影響

實施例6

本實施例為酯酶與不同底物的反應(yīng)特性，列于表2中。由表2可以看出，該酯酶具有廣泛的底物，對于羥基肉桂酸脂類表現(xiàn)出了很強的活力，屬于阿魏酸酯酶。

表2 BpFae15酯酶對不同底物的活性

實施例7

本實施例為酯酶水解去淀粉麩皮產(chǎn)阿魏酸的應(yīng)用。200g麩皮，加入純化并冷凍干燥后的酯酶40mg，加水1000ml，pH自然，40℃保溫12小時，測定 得阿魏酸的釋放率為64.2％。