相關(guān)申請案的交叉參考本申請案要求2010年3月12日提交的美國臨時(shí)申請案第61/313,516號(hào)的權(quán)益，所述臨時(shí)申請案的內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。序列表本申請案含有序列表，其已經(jīng)由EFS-Web以ASCII格式呈交且因此以全文引用的方式并入本文中。2011年2月11日創(chuàng)建的所述ASCII復(fù)本是命名為237US161.txt且大小為498,294個(gè)字節(jié)。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及CTLA4蛋白、包含CTLA4蛋白的醫(yī)藥組合物、和所述蛋白的治療用途。
背景技術(shù)：
：T細(xì)胞淋巴細(xì)胞通過提供對特定病原體的適應(yīng)性反應(yīng)而在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中起關(guān)鍵作用。T細(xì)胞活化取決于至少兩種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活化，其中一種途徑為抗原特異性，另一種途徑為抗原非特異性。T輔助細(xì)胞抗原性反應(yīng)需要通過T細(xì)胞受體與在抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面上的MHC(主要組織相容性復(fù)合體)所結(jié)合的抗原結(jié)合而活化第一信號(hào)傳導(dǎo)途徑?？乖苑磻?yīng)還需要通過T細(xì)胞表面上的CD28蛋白與APC表面上的CD80(B7-1)及CD86(B7-2)結(jié)合而活化可產(chǎn)生共刺激信號(hào)的第二信號(hào)傳導(dǎo)途徑。因?yàn)榭乖禺愋孕盘?hào)不足以產(chǎn)生完全抗原性反應(yīng)，所以無共刺激的T細(xì)胞受體/抗原-MHC結(jié)合可導(dǎo)致克隆失活或無反應(yīng)性(anergy)。(參看例如堅(jiān)金斯(Jenkins)等人，1993，免疫學(xué)新見(Curr.Opin.Immunol.)5：361)。共刺激途徑不僅在T細(xì)胞活化和分化中起作用，而且在組織遷移和外周耐受性誘導(dǎo)中起作用。(參看薩洛蒙(Salomon)等人，2001，免疫學(xué)年評(píng)(Ann.Rev.Immunol.)19：225)。經(jīng)活化的T細(xì)胞還在其細(xì)胞表面上表達(dá)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA4)，CTLA4為以較高親和力結(jié)合CD80和CD86的CD28同系物。CTLA4表達(dá)引起競爭性結(jié)合CD80和CD86、阻斷CD80/86-CD28相互作用以及終止T細(xì)胞活化。因?yàn)檫@些信號(hào)傳導(dǎo)途徑?jīng)Q定T細(xì)胞對抗原的反應(yīng)以及對抗原的下游反應(yīng)的量值，所以例如通過阻斷CD80/CD86與CD28和/或CTLA4之間的一種或一種以上相互作用而調(diào)節(jié)一種或一種以上共刺激信號(hào)的藥劑可有效治療由細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)異常所引起的病癥。(參看例如穆勒(Mueller)等人，1989，免疫學(xué)年評(píng)(Annu.Rev.Immunol.)7：445)。適合破壞CD80/86-CD28相互作用的藥劑包括抗體和融合蛋白。舉例來說，在實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE)模型中，使用抗CD80和抗CD86抗體阻斷T細(xì)胞。(參看拉克(Racke)等人，1995，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)96：2195)。在另一實(shí)例中，抗CD80和抗CD86抗體用于阻斷2型活體內(nèi)免疫反應(yīng)(即由IgG抗體介導(dǎo)且針對細(xì)胞表面或基質(zhì)抗原的免疫反應(yīng))和IL-4產(chǎn)生。(格里沃爾德(Greenwald)等人，1997，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)158：4088)已證明CD28-Ig融合蛋白與樹突狀細(xì)胞上的CD80和/或CD86相互作用且使其活化，由此導(dǎo)致在活體內(nèi)產(chǎn)生增強(qiáng)的T細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的可溶性CD28的輔助活性。(奧拉博納(Orabona)等人，2004，自然免疫學(xué)(NatureImmunol.)5(11)：1134)?；蛘?，CTLA4-Ig融合蛋白已用于破壞CD80/86-CD28相互作用。(參看例如麥肯泰爾(McIntyre)等人，2005，未來藥物(DrugsoftheFuture)，30：873)。對T細(xì)胞活化和共刺激途徑的新近研究表明CD80和CD86可在免疫反應(yīng)中，尤其在自身免疫性方面起不同作用。因此，已顯示僅阻斷CD80或CD86之一與CD28的結(jié)合會(huì)在活體內(nèi)產(chǎn)生不同影響，其視所研究的疾病和投藥時(shí)序而定(參看薩洛蒙(Salomon)，2001，免疫學(xué)年評(píng)(Annu.Rev.Immunol.)19：225；庫齊羅(Kuchroo)等人，1995，細(xì)胞(Cell)80：707；拉克(Racke)等人，1995，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)96：2195；蘭斯喬(Lenschow)等人，1995，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)181：1145；和格里沃爾德(Greenwald)等人，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)，1997，158：4088)。當(dāng)前正在開發(fā)結(jié)合CTLA4且破壞CTLA4對CD28介導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)的抑制的抗體以用于治療各種癌癥。人類抗CTLA4IgG1抗體易普利姆瑪(Ipilimumab)正處于黑素瘤的III期試驗(yàn)中以及乳癌和前列腺癌的II期試驗(yàn)中。人類抗CTLA4IgG2抗體曲美利姆瑪(Tremelimumab)正處于前列腺癌、膀胱癌和結(jié)腸直腸癌的II期試驗(yàn)中。結(jié)合CD80和/或CD86且破壞與CTLA4和CD28的相互作用的融合蛋白為用于開發(fā)免疫調(diào)節(jié)劑的良好候選者。融合蛋白允許工程改造例如溶解性、穩(wěn)定性、可傳遞性和/或活性改進(jìn)的蛋白質(zhì)。一種此類免疫調(diào)節(jié)劑為可溶性融合蛋白阿巴西普(abatacept)其經(jīng)開發(fā)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎，攻擊關(guān)節(jié)、導(dǎo)致最終會(huì)引起骨侵蝕和關(guān)節(jié)變形的疼痛膨脹的自身免疫病癥。阿巴西普為一種CTLA4-Ig融合蛋白，其由人類CTLA4的細(xì)胞外域以及人類免疫球蛋白G1(IgG1)的包括鉸鏈、CH2和CH3域的經(jīng)修飾Fc部分組成。CTLA4域提供結(jié)合活性且咸信Fc部分提供穩(wěn)定性、溶解性和可傳遞性。阿巴西普抑制T細(xì)胞上的CD28與APC細(xì)胞上的CD80和/或CD86蛋白的相互作用，由此導(dǎo)致T細(xì)胞活化受抑制。(參看例如史瓦茲(Schwartz)，1992，細(xì)胞(Cell)71：1065)。因此，投與阿巴西普可導(dǎo)致T細(xì)胞增殖、活化和信號(hào)傳導(dǎo)的減少，且減弱類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的自身免疫反應(yīng)。稱為貝拉西普(belatacept)的第二代可溶性重組CTLA4-Ig融合蛋白有兩個(gè)氨基酸與阿巴西普不同且對CD80和CD86具有較大結(jié)合親和力。貝拉西普正處于進(jìn)行中的用于腎和其它器官移植的III期試驗(yàn)中。(參看林賽(Linsley)等人，2009，免疫學(xué)評(píng)論(Immunol.Reviews)229：307-321)。第三種融合蛋白MAXY-4，一種來源于阿巴西普但對CTLA4標(biāo)靶的結(jié)合增加的蛋白質(zhì)，當(dāng)前正處于由普塞德治療劑有限責(zé)任公司(PerseidTherapeutics，LLC)和阿斯特拉制藥公司(AstellasPharma，Inc.)進(jìn)行的臨床前開發(fā)中用于治療自身免疫疾病和移植排斥反應(yīng)。使用阿巴西普的療法可能導(dǎo)致成本過高。阿巴西普的具有較高親和力的變體可降低所需的有效治療劑量且因此降低療法成本。此外，由于為達(dá)成有益結(jié)果所需的藥劑較少，所以顯現(xiàn)對藥劑自身的免疫原性反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)也可降低。其它副作用也可減少。需要提供與CD80和CD86蛋白的結(jié)合有差異的改進(jìn)的融合蛋白，例如通過產(chǎn)生對一種同功異型物的相對親和力相對于另一者較高的變體。所述改進(jìn)的變體可提供對特定病況或病變的靶向免疫調(diào)節(jié)。在CTLA4-Ig和抗CTLA4抗體療法的一些情況下觀測到的不良反應(yīng)、或免疫反應(yīng)的惡化也可降低。在章節(jié)2中或在本申請案的任何其它章節(jié)中對任何參考文獻(xiàn)的引用或鑒別不應(yīng)解釋為承認(rèn)所述參考文獻(xiàn)可用作本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及能夠結(jié)合CD80和/或CD86且序列與SEQIDNO：1(圖1A)相關(guān)的包含CTLA4結(jié)合域的蛋白質(zhì)。在某些方面，本發(fā)明CTLA4蛋白另外包含為非CTLA4蛋白的融合搭配物，例如免疫球蛋白域。CTLA4具有3個(gè)CDR樣環(huán)，在本文中稱為(以氨基端至羧基端的順序)CDR樣環(huán)1、CDR樣環(huán)2和CDR樣環(huán)3。CTLA4的CDR樣環(huán)顯示于圖1B中。對CTLA4的CDR樣環(huán)進(jìn)行全面誘變以產(chǎn)生具有單一點(diǎn)突變的變體群體。接著基于群體中變體的行為篩選變體群體以鑒別所產(chǎn)生的對CD80或CD86的結(jié)合親和力類似或增加的點(diǎn)突變體。鑒別在群體中的行為指示相對于野生型CTLA4對CD80或CD86的結(jié)合親和力類似或較高的變體。自群體中分離一些變體且進(jìn)一步表征其生物性質(zhì)，例如與CD80和CD86的結(jié)合(描述于實(shí)例1中)、抑制Jurkat細(xì)胞分泌IL-2(描述于實(shí)例1中)及抑制T細(xì)胞增殖(描述于實(shí)例2中)。這些變體中的氨基酸取代列于表2、3、5、7、9、10和12中。其它變體不自群體中分離且其結(jié)合特征是基于其在群體中的行為。這些變體中稱為“候選”突變的氨基酸取代列于表4、6、8、11、13、14中。因此，本發(fā)明提供包含相較于SEQIDNO：1的CDR樣環(huán)具有至少1個(gè)氨基酸取代的CDR樣環(huán)的CTLA4蛋白。CDR樣環(huán)中的示范性取代見于表2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14中?？?單獨(dú)或組合)并入本發(fā)明CTLA4蛋白中的較佳氨基酸取代包括(但不限于)CDR樣環(huán)1中的氨基酸取代K28H和A29H。在某些方面，本發(fā)明提供相較于SEQIDNO：1在CDR樣環(huán)中具有至少1個(gè)氨基酸取代且相較于野生型CTLA4結(jié)合域以高親和力結(jié)合CD80和CD86的CTLA4蛋白。CDR樣環(huán)中導(dǎo)致與CD80和CD86以高親和力結(jié)合的示范性取代見于表2中以及表15的第1行中。在其它方面，本發(fā)明提供相較于SEQIDNO：1的CDR樣環(huán)在CDR樣環(huán)中具有至少1個(gè)氨基酸取代且相較于野生型CTLA4結(jié)合域以高親和力結(jié)合CD80并以中性親和力(即與阿巴西普相當(dāng))結(jié)合CD86的CTLA4蛋白。CDR樣環(huán)中導(dǎo)致與CD80以高親和力結(jié)合及與CD86以中性親和力結(jié)合的示范性取代見于表3、4中以及表15的第2-5行中。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供相較于SEQIDNO：1的CDR樣環(huán)在CDR樣環(huán)中具有至少1個(gè)氨基酸取代且相較于野生型CTLA4結(jié)合域以高親和力結(jié)合CD80并以低親和力結(jié)合CD86的CTLA4蛋白。導(dǎo)致與CD80以高親和力結(jié)合且與CD86以低親和力結(jié)合的示范性取代見于表5、6中以及表15的第6行中。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供相較于SEQIDNO：1的CDR樣環(huán)在CDR樣環(huán)中具有至少1個(gè)氨基酸取代且相較于野生型CTLA4結(jié)合域以中性親和力結(jié)合CD80并以高親和力結(jié)合CD86的CTLA4蛋白。導(dǎo)致與CD80以中性親和力結(jié)合且與CD86以高親和力結(jié)合的示范性取代見于表7、8、以及表15的第7-8行中。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明提供相較于SEQIDNO：1的CDR樣環(huán)在CDR樣環(huán)中具有至少1個(gè)氨基酸取代且相較于野生型CTLA4結(jié)合域以低親和力結(jié)合CD80并以高親和力結(jié)合CD86的CTLA4蛋白。導(dǎo)致與CD80以低親和力結(jié)合且與CD86以高親和力結(jié)合的示范性取代見于表9中以及表15的第9行中。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供相較于SEQIDNO：1的CDR樣環(huán)在CDR樣環(huán)中具有至少1個(gè)氨基酸取代且相較于野生型CTLA4結(jié)合域以中性親和力結(jié)合CD80和CD86的CTLA4蛋白。導(dǎo)致與CD80和CD86以中性親和力結(jié)合的示范性取代見于表10、11以及表15的第10-22行中。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明提供相較于SEQIDNO：1的CDR樣環(huán)在CDR樣環(huán)中具有至少1個(gè)氨基酸取代且相較于野生型CTLA4結(jié)合域以中性親和力結(jié)合CD80并以低親和力結(jié)合CD86的CTLA4蛋白。以中性親和力結(jié)合CD80且以低親和力結(jié)合CD86的示范性取代見于表12、13以及表15的第23-26行中。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供相較于SEQIDNO：1的CDR樣環(huán)在CDR樣環(huán)中具有至少1個(gè)氨基酸取代且相較于野生型CTLA4結(jié)合域以低親和力結(jié)合CD80并以中性親和力結(jié)合CD86的CTLA4蛋白。以低親和力結(jié)合CD80且以中性親和力結(jié)合CD86的示范性取代見于表14中以及表15的第27-34行中。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQIDNO：1的氨基酸21到112具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQIDNO：1具有至少1個(gè)選自K28H、K28T、A29H、T51Y、M53F、M53Y、L58G、L61H、L61Y、K93M和K93Q的氨基酸取代。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種與SEQIDNO：1的氨基酸21到112具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQIDNO：1具有至少1個(gè)選自L58A、L58N、L58Q、L61A、K93V、L104H和L104Y的氨基酸取代。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種與SEQIDNO：1的氨基酸21到112具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQIDNO：1具有至少1個(gè)選自T30E、M54R、G55P、E57P、L58E、L58P、L58Y、L61F和L104I的氨基酸取代。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種與SEQIDNO：1的氨基酸21到112具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQIDNO：1包括氨基酸取代K93I。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種與SEQIDNO：1的氨基酸21到112具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQIDNO：1具有至少1個(gè)選自L58H、L58K和D62H的氨基酸取代。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種與SEQIDNO：1的氨基酸21到112具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQIDNO：1包括至少1個(gè)選自M54W和M54Y的氨基酸取代。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種與SEQIDNO：1的氨基酸21到112具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQIDNO：1具有至少1個(gè)選自R33D和L61w的氨基酸取代。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種與SEQIDNO：1的氨基酸21到112具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQIDNO：1具有至少1個(gè)選自A29K、T51N、M53W、L96K和L96R的氨基酸取代。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種變體CTLA4多肽，其包含與SEQIDNO：1的氨基酸21到112具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，其中所述變體多肽相較于SEQIDNO：1具有至少1個(gè)選自G27A、Y52F、N56T和L104M的氨基酸取代。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種與SEQIDNO：1的氨基酸21到112具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQIDNO：1具有至少1個(gè)選自以下的氨基酸取代：P26I、P26L、P26M、P26Q、P26T、P26V、K28R、A29P、A29S、T30H、T30M、T30S、V32E、R33P、T51A、Y52H、Y52M、Y52W、M53D、M54D、M54G、M54H、M54L、G55D、G55H、G55T、N56A、N56F、N56G、N56H、N56I、N56K、N56L、N56M、N56Q、N56R、N56S、N56V、N56Y、E57A、E57D、E57H、E57K、E57M、E57N、E57Q、E57R、E57S、E57T、E57V、L58I、L58R、L58T、T59I、T59M、T59N、T59Q、T59R、T59S、T59V、L61E、L61I、L61M、L61T、L61V、D62R、D63E、D63G、D63H、D63T、K93G、V94G、V94I、E95W、P99H、P99T、P99L和Y102T。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種與SEQIDNO：1的氨基酸21到112具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQIDNO：1包括氨基酸取代K28Y。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種與SEQIDNO：1的氨基酸21到112具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQIDNO：1具有至少1個(gè)選自以下的氨基酸取代：P26N、G27I、G27Q、G27W、K28E、K28I、K28M、K28P、K28Q、K28V、T30I、T30L、M53E、M53L、M53N、M54A、M54Q、M54S、L58D、L58V、T59H、T59K、T59L、T59P、L61D、L61G、L61Q、L61R、D62A、D62E、D62S、D63Q、D63S和K93R。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種與SEQIDNO：1的氨基酸21到112具有至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的變體CTLA4多肽，其中所述變體多肽相較于SEQIDNO：1具有至少1個(gè)選自以下的氨基酸取代：P26R、G27D、G27P、A29N、T30K、E31D、E31G、E31P、E31R、E31T、V32G、V32H、V32T、R33E、R33G、R33I、R33M、R33N、R33Q、R33W、R33Y、T51E、T51G、T51I、T51V、Y52A、Y52D、Y52I、Y52K、Y52L、Y52Q、Y52R、Y52S、Y52T、M53H、M53P、M53S、G55A、G55I、G55L、G55N、G55Q、G55R、G55Y、E57G、E57I、E57W、E57Y、T59D、T59G、T59Y、F60D、F60G、F60H、F60L、D62G、D62I、D62W、D63A、D63Y、K93D、K93H、K93N、K93P、K93W、V94A、V94D、V94H、V94N、V94P、V94R、V94T、V94W、E95G、E95I、E95K、E95P、E95Q、E95R、E95S、E95T、E95V、E95Y、L96A、L96G、L96H、L96M、L96P、L96Q、M97D、M97G、M97I、M97N、M97S、M97V、P99I、P99M、P99W、P99Y、P100H、P100L、P100T、P100V、P100W、P101L、Y102H、Y103H、Y103L、Y103P、Y103T和L104P。本發(fā)明的變體CTLA4蛋白可包含選自表2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15以及16-1到16-6中的一者或一者以上的一個(gè)或一個(gè)以上其它突變或突變的組合。在某些方面，相較于阿巴西普(SEQIDNO：6)，本發(fā)明的變體CTLA4多肽的CDR樣環(huán)中的突變不包含(a)A29K；(b)M53E；(c)L61Y；(d)L104M；(e)R33P；(f)T59I；(g)L61F。在其它方面，相較于阿巴西普(SEQIDNO：6)，本發(fā)明的變體CTLA4多肽的CDR樣環(huán)中的突變不由以下組成：(a)A29K；(b)M53E；(c)L61Y；(d)L104M；(e)R33P；(f)T59I；(g)L61F；(h)A29K、M53E、L61Y、L104M、R33P、T59I和L61F中的兩者或兩者以上的組合；或(i)A29K、M53E、L61Y、L104M、R33P、T59I和L61F中的三者或三者以上的組合。舉例來說且不加以限制，在特定實(shí)施例中，相較于阿巴西普(SEQIDNO：6)，本發(fā)明的變體CTLA4多肽的CDR樣環(huán)中的突變不包含以下或不由以下組成：(1)A29K和任選的1個(gè)、2個(gè)或2個(gè)以上取代，這些取代獨(dú)立地選自M53E、L61Y、L104M、R33P、T59I和L61F；(2)M53E和任選的1個(gè)、2個(gè)或2個(gè)以上取代，這些取代獨(dú)立地選自A29K、L61Y、L104M、R33P、T59I和L61F；(3)L61Y和任選的1個(gè)、2個(gè)或2個(gè)以上取代，這些取代獨(dú)立地選自A29K、M53E、L104M、R33P、T59I和L61F；(4)L104M和任選的1個(gè)、2個(gè)或2個(gè)以上取代，這些取代獨(dú)立地選自A29K、M53E、L61Y、R33P、T59I和L61F；(5)R33P和任選的1個(gè)、2個(gè)或2個(gè)以上取代，這些取代獨(dú)立地選自A29K、M53E、L61Y、L104M、T59I和L61F；(6)T59I和任選的1個(gè)、2個(gè)或2個(gè)以上取代，這些取代獨(dú)立地選自A29K、M53E、L61Y、L104M、R33P和L61F；或(7)L61F和任選的1個(gè)、2個(gè)或2個(gè)以上取代，這些取代獨(dú)立地選自A29K、M53E、L61Y、L104M、R33P和T59I。在某些方面，變體CTLA4多肽為融合蛋白。在某些實(shí)施例中，融合搭配物為免疫球蛋白恒定域，例如IgG1。在各種方面，本發(fā)明CTLA4蛋白具有與野生型CTLA4結(jié)合域的氨基酸序列(SEQIDNO：1的氨基酸21到112)或與野生型CTLA4細(xì)胞外域(SEQIDNO：1)具有至少75％序列一致性、至少80％序列一致性、至少85％序列一致性、至少90％序列一致性、至少91％序列一致性、至少92％序列一致性、至少93％序列一致性、至少94％序列一致性、至少95％序列一致性、至少96％序列一致性、至少97％序列一致性、至少98％序列一致性或至少99％序列一致性的序列。在各種方面，相較于SEQIDNO：l的CDR樣環(huán)，本發(fā)明CTLA4蛋白在CDR樣環(huán)中具有多達(dá)2個(gè)、多達(dá)3個(gè)、多達(dá)4個(gè)、多達(dá)5個(gè)、多達(dá)6個(gè)、多達(dá)7個(gè)、多達(dá)8個(gè)、多達(dá)9個(gè)、或多達(dá)10個(gè)氨基酸取代。本文提供包含編碼本發(fā)明CTLA4蛋白的核苷酸序列的核酸，還提供包含核酸的載體。另外，本文提供經(jīng)包含編碼CTLA4蛋白的核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化的原核和真核宿主細(xì)胞，以及經(jīng)工程改造以表達(dá)所述核苷酸序列的真核(例如哺乳動(dòng)物)宿主細(xì)胞。還提供通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞來產(chǎn)生CTLA4蛋白的方法。本發(fā)明CTLA4蛋白適用于治療癌癥、自身免疫疾病和細(xì)胞、器官或組織移植物的排斥反應(yīng)。在某些方面，CTLA4蛋白適用于治療選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的自身免疫疾病。應(yīng)注意，除非本文另外明確規(guī)定，否則在本申請案中按照專利申請案中通常所見來使用不定冠詞“一個(gè)(種)(a)”和“一個(gè)(種)(an)”以及定冠詞“所述(the)”，意思是一個(gè)(種)或一個(gè)(種)以上。另外，在本申請案中按照專利申請案中通常所見來使用術(shù)語“或(or)”，意思是分離性的“或”或連接性的“和”。本說明書中提及的所有公開案都以引用的方式并入本文中。本說明書中已包括的對文件、法案、材料、裝置、物品等的任何論述僅出于為本發(fā)明提供內(nèi)容的目的。其不應(yīng)視為承認(rèn)任何或所有這些要素形成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或?yàn)榕c本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域中的普通常識(shí)，就如同其在本申請案的優(yōu)先權(quán)日期之前已普遍存在一般。本發(fā)明的特征及優(yōu)點(diǎn)經(jīng)由其實(shí)施例的以下具體實(shí)施方式將變得更明顯。表格和附圖說明表1顯示野生型CTLA4-Ig的CDR樣環(huán)中的氨基酸的編號(hào)。表2顯示野生型CTLA4CDR樣環(huán)中的突變，結(jié)合研究指示可增加對CD80和CD86的親和力。表3顯示野生型CTLA4CDR樣環(huán)中的突變，結(jié)合研究指示可增加對CD80的親和力但不實(shí)質(zhì)上影響CD86結(jié)合。表4顯示可并入野生型CTLA4CDR樣環(huán)中以增加對CD80的親和力，同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響CD86結(jié)合的候選突變。表5顯示野生型CTLA4CDR樣環(huán)中的突變，結(jié)合研究指示可增加對CD80的親和力且減小對CD86的親和力。表6顯示可并入野生型CTLA4CDR樣環(huán)中以增加對CD80的親和力且減小對CD86的親和力的候選突變。表7顯示野生型CTLA4CDR樣環(huán)中的突變，結(jié)合研究指示可增加對CD86的親和力，同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響CD80結(jié)合。表8顯示可并入野生型CTLA4CDR樣環(huán)中以增加對CD86的親和力，同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響CD80結(jié)合的候選突變。表9顯示野生型CTLA4CDR樣環(huán)中的突變，結(jié)合研究指示可減小對CD80的親和力且增加對CD86的親和力。表10顯示野生型CTLA4CDR樣環(huán)中的突變，結(jié)合研究指示不實(shí)質(zhì)上影響與CD80或CD86結(jié)合。表11顯示可并入野生型CTLA4CDR樣環(huán)中且不實(shí)質(zhì)上影響與CD80或CD86結(jié)合的候選突變。表12顯示野生型CTLA4CDR樣環(huán)中的突變，結(jié)合研究指示可減小對CD86的親和力，同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響與CD80結(jié)合。表13顯示可并入野生型CTLA4CDR樣環(huán)中以減小對CD86的親和力，同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響CD80結(jié)合的候選突變。表14顯示可并入野生型CTLA4CDR樣環(huán)中以減小對CD80的親和力，同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響CD86結(jié)合的候選突變。表15顯示野生型CTLA4CDR樣環(huán)中可并入本發(fā)明CTLA4蛋白中的已知突變。第1行顯示可并入野生型CTLA4CDR樣環(huán)中以增加對CD80和CD86的親和力的已知突變。第2-5行顯示可并入野生型CTLA4CDR樣環(huán)中以增加對CD80的親和力，同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響CD86結(jié)合的已知突變。第6行顯示可并入野生型CTLA4CDR樣環(huán)中以增加對CD80的親和力，同時(shí)減小對CD86的親和力的已知突變。第7-8行顯示可并入野生型CTLA4CDR樣環(huán)中以增加對CD86的親和力，同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響CD80結(jié)合的已知突變。第9行顯示可并入野生型CTLA4CDR樣環(huán)中以增加對CD86的親和力，同時(shí)減小對CD80的親和力的已知突變。第10-22行顯示可并入野生型CTLA4CDR樣環(huán)中且不實(shí)質(zhì)上影響CD80或CD86結(jié)合的已知突變。第23-26行顯示可并入野生型CTLA4CDR樣環(huán)中以減小對CD86的親和力，同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響對CD80的親和力的已知突變。第27-34行顯示可并入野生型CTLA4CDR樣環(huán)中以減小對CD80的親和力，同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響對CD86的親和力的已知突變。表16-1到16-6顯示野生型CTLA4CDR樣環(huán)中可并入本發(fā)明CTLA4蛋白中的已知突變。圖1A-1C。圖1A顯示人類CTLA4細(xì)胞外域的氨基酸序列(SEQIDNO：1)。通過目視檢查報(bào)導(dǎo)的CTLA4共晶體結(jié)構(gòu)鑒別CDR樣環(huán)中的氨基酸(加下劃線)。(史瓦茲(Schwartz)等人，2001，自然(Nature)410：604；斯塔皮爾(Stamper)等人，2001，自然(Nature)410：608)。圖1B顯示野生型CTLA4的CDR樣環(huán)的序列以及相應(yīng)序列標(biāo)識(shí)符。圖1C顯示以下的比對：(i)全長人類CTLA4細(xì)胞外域且含有跨膜域(基因庫登錄號(hào)NM_005214；SEQIDNO：5)，(ii)如美國專利第5,434,131號(hào)中所述的阿巴西普(SEQIDNO：6)；和(iii)人類Fcγ1(SEQIDNO：7)。野生型CTLA4-Ig的細(xì)胞外域包含hCTLA4的氨基酸1-124，其對應(yīng)于CTLA4細(xì)胞外域。CTLA4經(jīng)由位置120處的半胱氨酸殘基二聚化。阿巴西普在位置125處具有谷氨酰胺殘基，所述谷氨酰胺殘基在hCTLA4細(xì)胞外域與人類Fcγ1的接點(diǎn)處。hFcγ1的CH1區(qū)在相等位置處含有纈氨酸。具有IgG1m(a)異型的人類Fcγ1區(qū)在位置126處起始且為斜體。存在于Fcγ1中且牽涉于二硫橋鍵中的在位置130、136和139處的半胱氨酸殘基在阿巴西普中已突變成絲氨酸。Fcγ1的CH2區(qū)中的位置148在阿巴西普中從脯氨酸突變成絲氨酸。(戴維斯(Davis)等人，2007，風(fēng)濕病學(xué)雜志(J.Rheumatol.)34(11)：2204)。圖2A-2B顯示如通過競爭所測量的新穎CTLA4-Ig變體與CD80和CD86的結(jié)合。顯示對CD80和CD86中至少一者的結(jié)合改進(jìn)的變體的相對結(jié)合活性顯示于圖2A中。顯示對CD80和CD86中至少一者的結(jié)合相等的變體的相對結(jié)合活性顯示于圖2B中?？招暮蛯?shí)心條分別指示關(guān)于CD80和CD86的結(jié)合數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用獲自野生型CTLA4-Ig的IC50值校正，且顯示為來自兩組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均改進(jìn)倍數(shù)。證實(shí)在CH2域中含有突變P148S突變的阿巴西普的結(jié)合活性對配體結(jié)合的影響可忽略。稀釋曲線的各數(shù)據(jù)點(diǎn)在分析板中一式兩份重復(fù)。野生型CTLA4-Ig對CD80和CD86的平均IC50值分別測定為0.89nM±0.26和4.26nM±0.76。誤差棒表示獲自一式兩份重復(fù)實(shí)驗(yàn)的值的范圍。圖3顯示如通過競爭所測量的已知CTLA4-Ig變體與CD80和CD86的結(jié)合活性。圖4A-4C顯示野生型和CTLA4-Ig變體抑制JurkatT細(xì)胞在經(jīng)受刺激時(shí)產(chǎn)生IL-2的能力。圖4A顯示在野生型CTLA4-Ig或?qū)φ湛贵w存在下，JurkatT細(xì)胞在用表達(dá)CD80或CD86的CHO-K1細(xì)胞刺激時(shí)產(chǎn)生的IL-2。圖4B顯示用滴定量的商業(yè)阿巴西普或野生型CTLA4-Ig或自行制得的貝拉西普獲得的完全抑制曲線。圖4C顯示所選本發(fā)明CTLA-Ig變體抑制IL-2產(chǎn)生的相對效能，其用獲自野生型CTLA4-Ig的IC50值校正。誤差棒表示得自一式兩份重復(fù)實(shí)驗(yàn)的值的范圍。圖5A-5E顯示野生型和CTLA4-Ig變體抑制初級(jí)同種異體刺激的T細(xì)胞增殖的能力。符號(hào)表示一式三份重復(fù)測定的平均值。數(shù)據(jù)代表至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。圖6A-6D顯示野生型和CTLA4-Ig變體抑制二級(jí)同種異體刺激的T細(xì)胞增殖的能力。符號(hào)表示一式三份重復(fù)測定的平均值。數(shù)據(jù)代表至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供抑制或遏制免疫反應(yīng)的新穎多肽，其包含CTLA4的變異型CD80-和/或CD86結(jié)合片段(“CTLA4結(jié)合域”)。本發(fā)明多肽包含至少1個(gè)具有一個(gè)或一個(gè)以上維持或改變CTLA4與CD80和/或CD86的結(jié)合性質(zhì)的氨基酸取代的CTLA4結(jié)合域。任選地，變異型CTLA4結(jié)合域融合至不同(非CTLA4)氨基酸序列，例如免疫球蛋白恒定區(qū)的氨基酸序列。這些新穎多肽在本文中統(tǒng)稱為“CTLA4蛋白”或“CTLA4多肽”。1.CTLA4細(xì)胞外域本發(fā)明的變體多肽包含序列與CTLA4細(xì)胞外域(SEQIDNO：1)相關(guān)的氨基酸序列。CTLA4細(xì)胞外域?yàn)椴捎镁哂?個(gè)CDR樣環(huán)的免疫球蛋白可變折疊的單鏈多肽。相較于CTLA4，本發(fā)明的變體多肽在至少1個(gè)CDR樣環(huán)中含有至少1個(gè)維持或改變蛋白質(zhì)與CD80和/或CD86的結(jié)合性質(zhì)的氨基酸取代。在某些方面，本發(fā)明的變體CTLA4多肽結(jié)合CD80和/或CD86且阻斷其與其各別配體(例如CTLA4或CD28)的相互作用，由此抑制一種或一種以上免疫細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。本發(fā)明的變體CTLA4多肽亦可在CTLA4細(xì)胞外域的非CDR樣環(huán)部分中具有氨基酸突變(例如缺失、插入、添加或取代)。CTLA4細(xì)胞外域的非CDR樣區(qū)中的適合突變包括(但不限于)揭示于例如美國專利第5,977,318號(hào)；第6,107,056號(hào)；第6,750,334號(hào)；第7,034,121號(hào)；第7,229,962號(hào)；第7,432,344號(hào)；第7,504,554號(hào)；第7,385,045號(hào)；第7,105,166號(hào)；第6,090,914號(hào)；第5,770,197號(hào)；和美國專利公開案第2009/0258031號(hào)中的突變，以上專利中的每一者均以全文引用的方式并入本文中。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的變體CTLA4多肽具有與CTLA4結(jié)合域的氨基酸序列(例如SEQIDNO：1的氨基酸21-112)至少75％一致的氨基酸序列。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的變體CTLA4多肽具有與CTLA4細(xì)胞外域的氨基酸序列(例如SEQIDNO：1的氨基酸1-124)至少75％一致的氨基酸序列。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的變體CTLA4多肽具有與CTLA4結(jié)合域的氨基酸序列或與CTLA4細(xì)胞外域的氨基酸序列至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少91％一致、至少92％一致、至少93％一致、至少94％一致、至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，相較于野生型CTLA4細(xì)胞外域，本發(fā)明的變體CTLA4多肽包含至少1個(gè)突變。在其它實(shí)施例中，相較于野生型CTLA4結(jié)合域，本發(fā)明的變體CTLA4多肽包含至少1個(gè)突變。在其它實(shí)施例中，相較于野生型CTLA4細(xì)胞外域或相較于野生型CTLA4結(jié)合域，本發(fā)明的變體CTLA4多肽包含多達(dá)2個(gè)、多達(dá)3個(gè)、多達(dá)4個(gè)、多達(dá)5個(gè)、多達(dá)6個(gè)、多達(dá)7個(gè)、多達(dá)8個(gè)、多達(dá)9個(gè)、多達(dá)10個(gè)、多達(dá)11個(gè)、多達(dá)12個(gè)、多達(dá)13個(gè)、多達(dá)14個(gè)、多達(dá)15個(gè)、多達(dá)16個(gè)、多達(dá)17個(gè)、多達(dá)18個(gè)、多達(dá)19個(gè)、或多達(dá)20個(gè)氨基酸取代。在某些實(shí)施例中，CTLA4細(xì)胞外域包括人類CTLA4蛋白(SEQIDNO：1)的氨基酸殘基1-124。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4多肽為CTLA4細(xì)胞外域的CD80-和/或CD86結(jié)合片段，其包含與CTLA4的CDR樣序列相關(guān)的CDR樣序列。在某些實(shí)施例中，結(jié)合片段包含CTLA4細(xì)胞外域的一部分，其起始于SEQIDNO：1的氨基酸1到12之間的任何位置且終止于SEQIDNO：1的氨基酸112到124之間的任何位置。在某些實(shí)施例中，結(jié)合片段是來自SEQIDNO：1的氨基酸12到氨基酸112，來自SEQIDNO：1的氨基酸10到氨基酸112，來自SEQIDNO：1的氨基酸8到氨基酸112，來自SEQIDNO：1的氨基酸6到氨基酸112，來自SEQIDNO：1的氨基酸4到氨基酸112，來自SEQIDNO：1的氨基酸1到氨基酸112、氨基酸113、氨基酸114、氨基酸115、氨基酸116、氨基酸117、氨基酸118、氨基酸119、氨基酸120、氨基酸121、氨基酸122或氨基酸123。在其它實(shí)施例中，結(jié)合部分是來自SEQIDNO：1的氨基酸12到氨基酸114，來自SEQIDNO：1的氨基酸12到氨基酸116，來自SEQIDNO：1的氨基酸12到氨基酸118，來自SEQIDNO：1的氨基酸12到氨基酸120，來自SEQIDNO：1的氨基酸12到氨基酸122，或來自SEQIDNO：1的氨基酸12、氨基酸11、氨基酸10、氨基酸9、氨基酸8、氨基酸7、氨基酸6、氨基酸5、氨基酸4、氨基酸3或氨基酸2到氨基酸124。在某些實(shí)施例中，CTLA4的CDR樣環(huán)是移植于非CTLA4蛋白骨架上。非CTLA4蛋白骨架可為所屬領(lǐng)域中已知允許CDR樣環(huán)維持結(jié)合CD80和/或CD86的三維結(jié)構(gòu)的任何蛋白質(zhì)骨架。在某些實(shí)施例中，非CTLA4蛋白骨架為駱駝科重鏈抗體的可變域(VHH)或鯊新抗原受體的可變域(VNAR)(“納米抗體(nanobody)”)。在其它實(shí)施例中，骨架可來自于除免疫球蛋白以外的蛋白質(zhì)。用于本發(fā)明的CTLA4變體蛋白中的所述骨架包括(但不限于)纖維連接蛋白III(fibronectinIII)(AdNectin)、β夾心式蛋白(iMAB)、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(lipocalin)(抗運(yùn)載蛋白(Anticalin))、EETI-II/AGRP(微體(Microbody))、BPTI/LACI-D1/ITI-D2(Kunitz域)、硫氧還蛋白(thioredoxin)(肽適體)、蛋白A(親和體(Affibody))、錨蛋白重復(fù)序列(ankyrinrepeat)(DARPin)、γB-晶狀體球蛋白(γB-crystallin)/泛素(ubiquitin)(親和素(Affilin))、CTLD3(四連接素(Tetranectin))和(LDLR-A模組)3(高親和性多聚體(Avimer))。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的變體CTLA4多肽為單體。在其它實(shí)施例中，CTLA4多肽為二聚體。在某些實(shí)施例中，CTLA4二聚體為共價(jià)二聚體，例如經(jīng)二硫鍵連接的二聚體。在其它實(shí)施例中，CTLA4二聚體為非共價(jià)二聚體。在其它實(shí)施例中，CTLA4多肽為多聚體，例如四聚體。本發(fā)明的變體CTLA4多肽對CTLA4配體具有結(jié)合親和力。在某些實(shí)施例中，CTLA4多肽對人類CD80的細(xì)胞外域或其一部分具有結(jié)合親和力。在各種實(shí)施例中，CTLA4多肽對人類CD86的細(xì)胞外域或其一部分具有結(jié)合親和力。在一些實(shí)施例中，相較于野生型CTLA4細(xì)胞外域(例如在阿巴西普的情形下)的結(jié)合親和力，本發(fā)明的變體CTLA4多肽對CD80和/或CD86的結(jié)合親和力增加。如本文所用，對CD80和/或CD86具有“增加的親和力”的變體(“高親和力”變體)是指結(jié)合親和力為CTLA4細(xì)胞外域?qū)D80和/或CD86的結(jié)合親和力的至少1.5倍、至少1.75倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少20倍或20倍以上的本發(fā)明多肽。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的變體CTLA4多肽對CD80和/或CD86的結(jié)合親和力約等于野生型CTLA4細(xì)胞外域(例如在阿巴西普的情形下)對CD80和/或CD86的結(jié)合親和力(“中性親和力”變體)。如本文所用，“中性親和力”變體對CD80和/或CD86的結(jié)合親和力介于CTLA4細(xì)胞外域?qū)ε潴w的結(jié)合親和力的約0.5倍到約1.5倍之間，例如為CTLA4細(xì)胞外域的結(jié)合親和力的約0.6倍、約0.7倍、約0.8倍、約0.9倍、約1倍、約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍或約1.5倍。在某些實(shí)施例中，相較于CTLA4細(xì)胞外域，本發(fā)明的變體多肽對CD80和/或CD86的結(jié)合親和力減小(“低親和力”變體)。如本文所用，本發(fā)明的“低親和力”變體的結(jié)合親和力小于CTLA4細(xì)胞外域的結(jié)合親和力的0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍、0.01倍或0.01倍以下。在特定實(shí)施例中，本發(fā)明的變體CTLA4蛋白關(guān)于CD80結(jié)合與CD86結(jié)合兩者均為高親和力變體。在一些實(shí)施例中，變體多肽關(guān)于CD80為高親和力變體且關(guān)于CD86為中性親和力變體。在其它實(shí)施例中，變體CTLA4多肽關(guān)于CD86結(jié)合為高親和力變體且關(guān)于CD80結(jié)合為中性親和力變體。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的變體CTLA4蛋白關(guān)于CD80結(jié)合為高親和力變體且關(guān)于CD86結(jié)合為低親和力變體。在其它實(shí)施例中，變體蛋白關(guān)于CD86結(jié)合為高親和力變體且關(guān)于CD80結(jié)合為低親和力變體。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的變體多肽關(guān)于CD80結(jié)合與CD86結(jié)合兩者均為中性親和力變體。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明的變體CTLA4多肽關(guān)于CD86結(jié)合為低親和力變體且關(guān)于CD80結(jié)合為中性親和力變體。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的變體CTLA4多肽關(guān)于CD86結(jié)合為中性親和力變體且關(guān)于CD80結(jié)合為低親和力變體。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的CTLA4多肽包含在全長CTLA4(基因庫登錄號(hào)AAL07473.1，其以引用的方式并入本文中)的情形下的變體CTLA4結(jié)合域。2.CTLA4融合搭配物在某些方面，本發(fā)明CTLA4多肽可為融合蛋白，其中變體CTLA4結(jié)合域與另一多肽(在本文中稱為“融合搭配物”)的氨基酸序列可操作地連接。如本文所用，術(shù)語“融合搭配物”是指直接或經(jīng)由連接子序列與CTLA4多肽變體共價(jià)連接的非CTLA4多肽。在各種實(shí)施例中，CTLA4結(jié)合域的C末端與融合搭配物的N末端連接。在一些實(shí)施例中，融合搭配物可包含跨膜域和/或細(xì)胞質(zhì)域。在所述實(shí)施例中，CTLA4融合蛋白在細(xì)胞表面上表達(dá)。在特定實(shí)施例中，融合搭配物包含促進(jìn)CTLA4多肽分泌、表達(dá)和/或溶解的多肽。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的CTLA4融合蛋白為單體。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的CTLA4融合蛋白由于兩個(gè)單體的CTLA4部分之間和/或融合搭配物多肽之間的共價(jià)連接(例如由雙硫鍵)或由于單體的CTLA4和/或融合搭配物部分的非共價(jià)締合而為二聚體。在一些實(shí)施例中，融合搭配物為二聚化的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)域，例如λ抑制體、上游結(jié)合因子及白氨酸拉鏈域(例如fos/jun)。在特定實(shí)施例中，融合搭配物為免疫球蛋白(Ig)Fc多肽，即Ig多肽的Fc域或其片段。在某些實(shí)施例中，F(xiàn)c多肽或片段可源于各種物種，包括例如人類、小鼠、靈長類動(dòng)物等，且可源于與其所連接的CTLA4結(jié)合域不同的物種。因此，舉例來說，在一些實(shí)施例中，CTLA4結(jié)合域來源于人類蛋白質(zhì)且融合搭配物來源于小鼠蛋白質(zhì)。在特定實(shí)施例中，CTLA4多肽與融合搭配物均來源于人類蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施例中，IgFc多肽包含第一恒定區(qū)(CH1)、鉸鏈區(qū)、第二恒定區(qū)(CH2)以及第三恒定區(qū)(CH3)，順序?yàn)?從N末端至C末端)CH1-鉸鏈-CH2-CH3。在一些實(shí)施例中，融合搭配物任選包含第四恒定區(qū)(CH4)。在一些實(shí)施例中，融合搭配物為包含Ig多肽的鉸鏈區(qū)、CH2域和CH3域的免疫球蛋白Fc片段。在其它實(shí)施例中，IgFc片段包含單一恒定域，例如鉸鏈區(qū)以及CH1、CH2或CH3域。在某些方面，IgFc不具有鉸鏈，例如IgM。在一些實(shí)施例中，IgFc多肽包含野生型IgFc多肽。示范性Fc多肽包括(但不限于)IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgD和IgM。在特定實(shí)施例中，F(xiàn)c多肽為IgG。或者，免疫球蛋白Fc融合搭配物為經(jīng)修飾的Ig多肽。在某些實(shí)施例中，F(xiàn)c多肽相較于野生型具有一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸取代。舉例來說，在某些實(shí)施例中，F(xiàn)c多肽為一個(gè)或一個(gè)以上半胱氨酸殘基已經(jīng)另一氨基酸(例如絲氨酸殘基)取代以消除在兩個(gè)Ig鏈之間形成的一個(gè)或一個(gè)以上雙硫鍵的突變IgG。在其它實(shí)施例中，F(xiàn)c多肽為一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸殘基經(jīng)另一氨基酸(例如脯氨酸)取代以降低效應(yīng)功能(Fc受體結(jié)合降低)的IgG多肽。參看美國專利公開案第2009/0258031號(hào)。在一些實(shí)施例中，F(xiàn)c融合搭配物或其片段可經(jīng)修飾以相對于相應(yīng)野生型序列改變至少一種恒定區(qū)介導(dǎo)的生物效應(yīng)功能。舉例來說，在一些實(shí)施例中，F(xiàn)c多肽可經(jīng)修飾以相對于未經(jīng)修飾的Fc區(qū)降低至少一種恒定區(qū)介導(dǎo)的生物效應(yīng)功能，例如降低與Fc受體(FcγR)結(jié)合。FcγR結(jié)合可通過使免疫球蛋白恒定區(qū)區(qū)段在FcγR相互作用所必需的特定區(qū)域處突變而降低(參看例如坎費(fèi)爾德(Canfield)和莫里森(Morrison)，1991，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)173：1483-1491；和蘭德(Lund)等人，1991，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)147：2657-2662)。Fc區(qū)的FcγR結(jié)合能力的降低也可降低依賴于FcγR相互作用的其它效應(yīng)功能，例如調(diào)理作用(opsonization)、吞噬作用(phagocytosis)和抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒性(“ADCC”)。在其它實(shí)施例中，F(xiàn)c多肽可經(jīng)修飾以相對于未經(jīng)修飾的Fc區(qū)獲得或改進(jìn)至少一種恒定區(qū)介導(dǎo)的生物效應(yīng)功能，例如增強(qiáng)FcγR相互作用(參看例如US2006/0134709)。舉例來說，F(xiàn)c區(qū)可經(jīng)修飾以便以大于相應(yīng)野生型恒定區(qū)的親和力結(jié)合FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA。因此，相較于具有相應(yīng)野生型Fc區(qū)的融合蛋白，本發(fā)明的Fc融合蛋白可發(fā)生生物活性改變，由此導(dǎo)致調(diào)理作用、吞噬作用、或ADCC增加或減小。所述改變在所屬領(lǐng)域中為已知的。舉例來說，可如修飾抗體一般修飾Fc多肽以降低ADCC活性，例如如美國專利第5,834,597號(hào)和第7,083,784號(hào)；以及美國專利公開案第2006/0198840號(hào)和第2007/0122403號(hào)中所述。示范性ADCC降低變體對應(yīng)于美國專利第5,834,597號(hào)的圖4中所示的“突變體3”，其中殘基236缺失且殘基234、235及237(使用EU編號(hào))經(jīng)丙氨酸取代。在一些實(shí)施例中，用于本發(fā)明CTLA4蛋白中的Fc多肽具有低含量巖藻糖或缺乏巖藻糖。Fc區(qū)中缺乏巖藻糖的抗體與ADCC活性增強(qiáng)相關(guān)，尤其在低劑量抗體的情況下。參看謝爾茲(Shields)等人，2002，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)277：26733-26740；新川(Shinkawa)等人，2003，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)278：3466-73。制備巖藻糖較少的蛋白質(zhì)的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0細(xì)胞(ATCCCRL1662)中生長。YB2/0細(xì)胞表達(dá)低含量的FUT8mRNA，其編碼α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，一種為多肽的巖藻糖基化所必需的酶。另一方面，本發(fā)明蛋白質(zhì)或其片段可包括已經(jīng)修飾以增加或降低對胎兒Fc受體FcRn的結(jié)合親和力的Fc區(qū)，其中所述修飾例如通過使免疫球蛋白恒定區(qū)區(qū)段在FcRn相互作用所涉及的特定區(qū)域處突變而達(dá)成(參看例如WO2005/123780)。在特定實(shí)施例中，IgG種類的IgFc融合搭配物經(jīng)突變以使重鏈恒定區(qū)的氨基酸殘基250、314和428中的至少一者單獨(dú)或以其任何組合，例如在位置250和428處、或在位置250和314處、或在位置314和428處、或在位置250、314和428處經(jīng)取代，其中位置250和428為特定組合。對于位置250，取代氨基酸殘基可為除蘇氨酸以外的任何氨基酸殘基，包括(但不限于)丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異白氨酸、賴氨酸、白氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、纈氨酸、色氨酸或酪氨酸。對于位置314，取代氨基酸殘基可為除白氨酸以外的任何氨基酸殘基，包括(但不限于)丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異白氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸或酪氨酸。對于位置428，取代氨基酸殘基可為除甲硫氨酸以外的任何氨基酸殘基，包括(但不限于)丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異白氨酸、賴氨酸、白氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸或酪氨酸。適合氨基酸取代的特定組合鑒別于美國專利第7,217,797號(hào)的表1中，表1以全文引用的方式并入本文中。所述突變增加Fc多肽與FcRn的結(jié)合，由此保護(hù)蛋白質(zhì)免遭降解且增加其半衰期。在某些實(shí)施例中，用于本發(fā)明的CTLA4融合蛋白中的Fc多肽具有與人類Fcγ1的氨基酸序列(SEQIDNO：7)至少75％一致的氨基酸序列。在各種實(shí)施例中，F(xiàn)c多肽具有與人類Fcγ1的氨基酸序列(SEQIDNO：7)至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少91％一致、至少92％一致、至少93％一致、至少94％一致、至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，相較于人類Fcγ1(SEQIDNO：7)，用于本發(fā)明的CTLA4融合蛋白中的Fc多肽包含至少1個(gè)突變。在其它實(shí)施例中，相較于野生型人類Fcγ1，本發(fā)明的變體CTLA4多肽包含多達(dá)2個(gè)、多達(dá)3個(gè)、多達(dá)4個(gè)、多達(dá)5個(gè)、多達(dá)6個(gè)、多達(dá)7個(gè)、多達(dá)8個(gè)、多達(dá)9個(gè)、多達(dá)10個(gè)、多達(dá)11個(gè)、多達(dá)12個(gè)、多達(dá)13個(gè)、多達(dá)14個(gè)、多達(dá)15個(gè)、多達(dá)16個(gè)、多達(dá)17個(gè)、多達(dá)18個(gè)、多達(dá)19個(gè)、或多達(dá)20個(gè)或20個(gè)以上氨基酸取代。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的變體CTLA4蛋白為融合蛋白，其包含有含約124個(gè)氨基酸且在C末端與含有約231個(gè)氨基酸的IgGFc融合搭配物(Fc的鉸鏈、CH2和CH3區(qū))共價(jià)連接(直接或間接)的CTLA4結(jié)合區(qū)。在某些實(shí)施例中，CTLA4細(xì)胞外域和IgFc域經(jīng)由連接子連接，其中所述連接子包含約1到約10個(gè)氨基酸。在特定實(shí)施例中，連接子包含1個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施例中，相較于野生型阿巴西普(SEQIDNO：5)，本發(fā)明的變體融合蛋白包含至少1個(gè)氨基酸取代。在某些實(shí)施例中，氨基酸取代位于CTLA4細(xì)胞外域中，例如位于CTLA4的CDR樣環(huán)中。在其它實(shí)施例中，相較于野生型阿巴西普(SEQIDNO：5)，本發(fā)明的變體融合蛋白包含CTLA4細(xì)胞外域中的至少1個(gè)氨基酸取代以及Fc域中的至少1個(gè)氨基酸取代。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的CTLA4融合蛋白具有與野生型阿巴西普的氨基酸序列(SEQIDNO：6)至少75％一致的氨基酸序列。在各種實(shí)施例中，融合蛋白具有與野生型阿巴西普的氨基酸序列(SEQIDNO：6)至少80％一致、至少85％一致、至少90％一致、至少91％一致、至少92％一致、至少93％一致、至少94％一致、至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，相較于野生型阿巴西普(SEQIDNO：6)，本發(fā)明的CTLA4融合蛋白包含至少1個(gè)突變。在其它實(shí)施例中，相較于野生型阿巴西普，本發(fā)明的變體CTLA4多肽包含多達(dá)2個(gè)、多達(dá)3個(gè)、多達(dá)4個(gè)、多達(dá)5個(gè)、多達(dá)6個(gè)、多達(dá)7個(gè)、多達(dá)8個(gè)、多達(dá)9個(gè)、多達(dá)10個(gè)、多達(dá)11個(gè)、多達(dá)12個(gè)、多達(dá)13個(gè)、多達(dá)14個(gè)、多達(dá)15個(gè)、多達(dá)16個(gè)、多達(dá)17個(gè)、多達(dá)18個(gè)、多達(dá)19個(gè)、或多達(dá)20個(gè)或20個(gè)以上氨基酸取代。除上述修飾之外，本發(fā)明CTLA4蛋白也可在CTLA4部分和/或融合搭配物部分中進(jìn)行修飾以包括用于從宿主細(xì)胞進(jìn)行分泌的信號(hào)序列、或肽純化序列，例如抗原決定基標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、聚組氨酸序列、或GST融合物。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白包含一個(gè)或一個(gè)以上經(jīng)修飾的氨基酸，例如糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法呢基化(farnesylated)氨基酸、乙?；被帷⒔?jīng)生物素標(biāo)記的氨基酸、與脂質(zhì)部分結(jié)合的氨基酸、和/或與有機(jī)衍生化試劑結(jié)合的氨基酸。在某些實(shí)施例中，存在經(jīng)修飾的氨基酸在例如以下方面有利：(a)增加多肽血清半衰期和/或功能性活體內(nèi)半衰期，(b)降低多肽抗原性或免疫原性，(c)增加多肽儲(chǔ)存穩(wěn)定性，(d)增加生物可用性，(e)減小效應(yīng)功能，和/或(f)減小或抑制本發(fā)明的兩個(gè)或兩個(gè)以上CTLA4蛋白之間不合需要的自締合(self-association)(例如形成聚集體)。氨基酸可在重組產(chǎn)生期間經(jīng)例如共翻譯或翻譯后修飾(例如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)期間在N-X-S/T基元處的N連接糖基化)或通過合成手段修飾。另一方面，本發(fā)明CTLA4蛋白可通過在CTLA4部分和/或融合搭配物部分中的一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸的側(cè)鏈添加保護(hù)基來加以修飾。所述保護(hù)基可例如通過降低多肽的親水性以及增加多肽的親脂性來促進(jìn)本發(fā)明多肽穿過膜或穿過某些組織進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。適合保護(hù)基的實(shí)例包括所屬領(lǐng)域中已知的酯保護(hù)基、胺保護(hù)基、?；Ｗo(hù)基和羧酸保護(hù)基(參看例如美國專利第6,121,236號(hào))。以下章節(jié)5.6和5.7中論述本發(fā)明CTLA4蛋白的其它修飾，例如通過添加聚乙二醇或可檢測標(biāo)記。3.CTLA4多肽的穩(wěn)定性增加在某些方面，本發(fā)明提供相較于野生型CTLA4Ig，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性增加的CTLA4多肽。本發(fā)明提供的CTLA4多肽相較于野生型CTLA4細(xì)胞外域的CDR樣環(huán)在其CDR樣環(huán)區(qū)中，和/或在CTLA4細(xì)胞外域中在CDR樣環(huán)外部的區(qū)域中和/或(如果存在)在融合搭配物多肽中具有單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，其中至少1個(gè)取代使CTLA4多肽的穩(wěn)定性相較于野生型CTLA4Ig得以增加。在某些實(shí)施例中，CTLA4多肽在儲(chǔ)存時(shí)的穩(wěn)定性增加。在其它實(shí)施例中，穩(wěn)定性增加是由于抵抗由蛋白酶等引起的降解。在各種實(shí)施例中，穩(wěn)定性增加是由于構(gòu)象穩(wěn)定性增加。在一些實(shí)施例中，穩(wěn)定性增加是由于聚集減少。在某些實(shí)施例中，穩(wěn)定性增加不影響本發(fā)明的變體CTLA4多肽對CD80和/或CD86的結(jié)合親和力。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白的穩(wěn)定性可為野生型CTLA4Ig的穩(wěn)定性的至少0.1倍、至少0.2倍、至少0.3倍、至少0.4倍、至少0.5倍、至少0.6倍、至少0.7倍、至少0.8倍、至少0.9倍、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、或至少10倍。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白的穩(wěn)定性相對于野生型CTLA4Ig的穩(wěn)定性增加任何上述值之間的范圍，例如0.1倍到2倍、5倍到10倍、0.9倍到6倍等。在某些方面，樣品中本發(fā)明CTLA4多肽的穩(wěn)定性大于樣品中野生型CTLA4Ig的穩(wěn)定性，其中所述樣品實(shí)質(zhì)上相同(例如均呈含有相同成分的醫(yī)藥組合物形式)和/或以實(shí)質(zhì)上相同的方式加工或處理(例如在相同的溫度和濕度條件下儲(chǔ)存相同時(shí)期)。在某些方面，本發(fā)明CTLA4多肽的穩(wěn)定性增加為保存期增加。保存期增加可由于氨基酸氧化減少所致(例如因?yàn)橄鄬τ谝吧虲TLA4-Ig，CDR樣環(huán)中或CTLA4細(xì)胞外域的CDR樣環(huán)外部的區(qū)域中易氧化的氨基酸殘基，例如甲硫氨酸、半胱氨酸或色氨酸已經(jīng)取代)。保存期增加也可由于氨基酸環(huán)化減少所致(例如因?yàn)橄鄬τ谝吧虲TLA4-Ig，CDR樣環(huán)中或CTLA4細(xì)胞外域的CDR樣環(huán)外部的區(qū)域中易環(huán)化的氨基酸殘基(例如天冬酰胺或谷氨酸)已經(jīng)取代)。保存期增加也可由于消除由可能以殘余含量存在于蛋白質(zhì)純化過程中的蛋白酶識(shí)別的氨基酸基元所致。保存期增加還可由于消除會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集的氨基酸基元所致。保存期增加還可由于構(gòu)象穩(wěn)定性增加所致。相對于野生型CTLA4Ig，保存期或構(gòu)象穩(wěn)定性的增加或氧化、環(huán)化、蛋白水解或聚集程度的減小可為至少0.1倍、至少0.2倍、至少0.3倍、至少0.4倍、至少0.5倍、至少0.6倍、至少0.7倍、至少0.8倍、至少0.9倍、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、或至少10倍。在某些實(shí)施例中，相對于野生型CTLA4Ig，保存期或構(gòu)象穩(wěn)定性的增加或氧化、環(huán)化、蛋白水解或聚集程度的減小是在任何上述值之間的范圍內(nèi)，例如0.1倍到2倍、5倍到10倍、0.9倍到6倍等。本發(fā)明另外提供篩選相對于野生型CTLA4Ig穩(wěn)定性增加的CTLA4多肽的方法。在特定實(shí)施例中，所述方法包含以下步驟：(a)測定第一樣品中全長CTLA4多肽的量；和(b)比較第一樣品中全長CTLA4多肽的量與第二樣品中全長野生型CTLA4Ig的量。分析蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法在所屬領(lǐng)域中為已知的。4.CTLA4多肽的免疫原性降低在某些方面，本發(fā)明提供相較于貝拉西普或MAXY-4(Maxygen)免疫原性降低的CTLA4多肽。本發(fā)明提供的CTLA4多肽相較于貝拉西普或MAXY-4細(xì)胞外域的CDR樣環(huán)在其CDR樣環(huán)區(qū)中，和/或在CTLA4細(xì)胞外域中在CDR樣環(huán)外部的區(qū)域中和/或(如果存在)在融合搭配物多肽中具有單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，其中至少1個(gè)取代使CTLA4多肽的免疫原性相較于貝拉西普或MAXY-4得以降低。在某些實(shí)施例中，免疫原性降低是由導(dǎo)致一個(gè)或一個(gè)以上T細(xì)胞抗原決定基消除或減少的一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸取代所致。在某些方面，免疫原性降低的本發(fā)明CTLA4蛋白相較于貝拉西普或MAXY-4具有類似或改變的生物活性，例如對CD80和/或CD86的親和力。在某些實(shí)施例中，相對于貝拉西普或MAXY-4，本發(fā)明CTLA4多肽的免疫原性降低。所述多肽通常具有相對于CTLA4細(xì)胞外域和/或(如果存在)融合搭配物的變體序列。在某些實(shí)施例中，CTLA4多肽通常將在CTLA4細(xì)胞外域序列和(如果存在)融合搭配物序列的一或兩者中具有1、2或3個(gè)氨基酸取代。在其它實(shí)施例中，CTLA4多肽可在CTLA4細(xì)胞外域序列和(如果存在)融合搭配物序列的一或兩者中具有4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸取代。在其它實(shí)施例中，CTLA4多肽可在CTLA4細(xì)胞外域序列和(如果存在)融合搭配物序列的一或兩者中具有11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)氨基酸取代。如本發(fā)明中所用，具有“降低的免疫原性”的變體是指相較于貝拉西普或MAXY-4CTLA4，包含變體序列的CTLA4多肽，其相較于貝拉西普或MAXY-4，引發(fā)的外周血液單核細(xì)胞中的增殖反應(yīng)降低?？捎糜谠u(píng)估增殖反應(yīng)的示范性增殖分析闡述于以下章節(jié)5.6中。增殖反應(yīng)降低可以反應(yīng)者的百分比、刺激指數(shù)或兩者反映。在其它實(shí)施例中，相較于貝拉西普或MAXY-4中的相應(yīng)肽，具有變體序列的肽導(dǎo)致反應(yīng)者減少至少25％、反應(yīng)者減少至少30％、反應(yīng)者減少至少35％、反應(yīng)者減少至少40％、反應(yīng)者減少至少45％、反應(yīng)者減少至少50％、反應(yīng)者減少至少60％、反應(yīng)者減少至少65％、反應(yīng)者減少至少70％、反應(yīng)者減少至少75％、反應(yīng)者減少至少80％、反應(yīng)者減少至少85％、反應(yīng)者減少至少90％、反應(yīng)者減少至少95％、反應(yīng)者減少至少100％，或?qū)е路磻?yīng)者減少任何上述值之間的范圍，例如反應(yīng)者減少25％-75％、反應(yīng)者減少50％-90％、反應(yīng)者減少60％-100％、反應(yīng)者減少70％-90％等。在某些方面，通過以下章節(jié)5.6中闡述的分析測定貝拉西普或MAXY-4的變體肽分別相較于貝拉西普或MAXY-4的相應(yīng)野生型肽引發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)的能力。在其它實(shí)施例中，相較于貝拉西普或MAXY-4中的相應(yīng)肽，具有變體序列的肽導(dǎo)致刺激指數(shù)比由野生型CTLA4Ig中的相應(yīng)肽引發(fā)的刺激指數(shù)減小至少5％、減小至少10％、減小至少15％、減小至少20％、減小至少25％、減小至少30％、減小至少35％、或減小至少40％，或相較于野生型CTLA4Ig，導(dǎo)致刺激減小任何上述值之間的范圍，例如減小5％-20％、減小10％-30％、減小30％-40％等。在某些實(shí)施例中，通過以下章節(jié)5.6中闡述的分析測定刺激指數(shù)。5.核酸和表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明涵蓋編碼本發(fā)明CTLA4多肽的核酸分子以及經(jīng)工程改造以重組表達(dá)多肽的宿主細(xì)胞。本發(fā)明CTLA4蛋白可通過在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)編碼CTLA4結(jié)合部分的核酸或編碼CTLA4融合蛋白的核酸制備。為了重組表達(dá)CTLA4蛋白，用一種或一種以上攜帶編碼CTLA4蛋白的核酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞以使蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中表達(dá)且任選分泌到培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中，蛋白質(zhì)可從所述培養(yǎng)基回收。使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA方法獲得編碼CTLA4蛋白的核酸，將這些核酸并入重組表達(dá)載體中且將載體引入宿主細(xì)胞中，所述方法例如以下文獻(xiàn)中描述的方法：分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(MolecularCloning；ALaboratoryManual)，第2版(薩姆布魯克(Sambrook)、福瑞斯(Fritsch)和瑪尼蒂斯(Maniatis)(編)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(ColdSpringHarbor)，紐約(N.Y.)，1989)；分子生物學(xué)現(xiàn)行規(guī)范(CurrentProtocolsinMolecularBiology)(奧蘇貝爾F.M.(Ausubel，F(xiàn).M.)等人編，格林出版協(xié)會(huì)(GreenePublishingAssociates)，1989)；和美國專利第4,816,397號(hào)。編碼本發(fā)明的變體CTLA4多肽的核酸可部分或完全合成?；蛘?，首先獲得編碼CTLA4結(jié)合部分的核酸。這些DNA可由對例如H38(HTLV-II相關(guān)的白血病)細(xì)胞系的總細(xì)胞RNA進(jìn)行PCR來獲得。參看美國專利第5,434,131號(hào)。此外，如果CTLA4蛋白為融合蛋白，則編碼融合搭配物(例如免疫球蛋白恒定區(qū))的核酸可通過例如使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增且修飾編碼所要融合蛋白的生殖系DNA或cDNA獲得。可合成編碼野生型阿巴西普的核酸且將其用作誘變的模板以便使用常規(guī)誘變技術(shù)來產(chǎn)生如本文所述的變體；或者，可直接合成編碼變體的核酸。一旦獲得編碼變體CTLA4結(jié)合域的核酸，即可通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操作核酸，例如以可操作地連接編碼CTLA4結(jié)合域的DNA與編碼另一蛋白質(zhì)(例如融合搭配物，例如抗體恒定區(qū)和/或可撓性連接子)的另一核酸。如本文中使用的術(shù)語“可操作地連接”預(yù)期指接合兩個(gè)核酸以使由這兩個(gè)核酸編碼的氨基酸序列保持同框(in-frame)。編碼CTLA4結(jié)合域的分離的DNA可通過可操作地連接編碼CTLA4結(jié)合域的DNA與編碼一個(gè)或一個(gè)以上重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2、CH3和任選CH4)的另一DNA分子而轉(zhuǎn)化成編碼融合蛋白的核酸。人類重鏈恒定區(qū)核酸的序列在所屬領(lǐng)域中為已知的(參看例如卡巴特E.A.(Kabat，E.A.)等人，1991，具有免疫學(xué)重要性的蛋白質(zhì)序列(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)，第5版，美國健康與公眾服務(wù)部(U.S.DepartmentofHealthandHumanServices)，NIH公開案第91-3242號(hào))并且涵蓋這些區(qū)域的核酸可通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得。重鏈恒定區(qū)可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但在某些實(shí)施例中，為IgG1恒定區(qū)。為了表達(dá)本發(fā)明的CTLA4蛋白，將如上所述獲得的編碼部分或全長蛋白質(zhì)的DNA插入表達(dá)載體中以使核酸與轉(zhuǎn)錄以及翻譯控制序列可操作地連接。在這種情形下，術(shù)語“可操作地連接”預(yù)期指編碼CTLA4蛋白的核酸連接到載體中，以使載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列發(fā)揮其調(diào)控編碼CTLA4蛋白的核酸的轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)期功能。選擇表達(dá)載體和表達(dá)控制序列以與所用表達(dá)宿主細(xì)胞相容。通過標(biāo)準(zhǔn)方法將編碼本發(fā)明CTLA4蛋白的核酸插入表達(dá)載體中(例如連接CTLA4蛋白基因片段和載體上的互補(bǔ)限制位點(diǎn)，或如果無限制位點(diǎn)存在，則進(jìn)行鈍端連接)。如果CTLA4蛋白為融合蛋白，則在插入編碼CTLA4結(jié)合域的序列之前，表達(dá)載體可能已攜帶融合搭配物序列，例如抗體恒定區(qū)序列。舉例來說，一種將僅包含CTLA4結(jié)合域的本發(fā)明蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成CTLA4融合蛋白的方法為將編碼CTLA4結(jié)合域的核酸插入已編碼免疫球蛋白Fc的表達(dá)載體中，以使CTLA4編碼序列與載體內(nèi)的Fc編碼序列可操作地連接?；蛘呋蛄硗?，重組表達(dá)載體可編碼促進(jìn)CTLA4蛋白從宿主細(xì)胞分泌的信號(hào)肽。編碼CTLA4蛋白的核酸可克隆到載體中以使信號(hào)肽與CTLA4蛋白編碼核酸的氨基端同框連接。信號(hào)肽可為CTLA4信號(hào)肽或異源信號(hào)肽，例如免疫球蛋白信號(hào)肽。除編碼CTLA4蛋白的核酸之外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還攜帶調(diào)控序列，所述序列控制編碼CTLA4蛋白的核酸在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。術(shù)語“調(diào)控序列”預(yù)期包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、和控制編碼本發(fā)明CTLA4蛋白的核酸的轉(zhuǎn)錄或翻譯的其它表達(dá)控制元件(例如聚腺苷酸化信號(hào))。所述調(diào)控序列描述于例如戈德爾(Goeddel)，基因表達(dá)技術(shù)：酶學(xué)方法(GeneExpressionTechnology：MethodsinEnzymology)185(學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress)，圣地亞哥(SanDiego)，加利福尼亞(CA)，1990)中。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)(包括調(diào)控序列的選擇)可視例如欲轉(zhuǎn)型的宿主細(xì)胞的選擇、所要蛋白質(zhì)的表達(dá)量等因素而定。適用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)的調(diào)控序列包括引導(dǎo)蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高含量表達(dá)的病毒元件，例如來源于細(xì)胞巨大病毒(CMV)(例如CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP))以及多瘤病毒的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子。對于病毒調(diào)控元件和其序列的進(jìn)一步描述，參看例如施廷斯基(Stinski)的美國專利第5,168,062號(hào)、拜耳(Bell)等人的美國專利第4,510,245號(hào)和夏弗納(Schaffner)等人的美國專利第4,968,615號(hào)。除CTLA4蛋白編碼核酸和調(diào)控序列之外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還可攜帶其它序列，例如調(diào)控載體在宿主細(xì)胞中的復(fù)制的序列(例如復(fù)制起點(diǎn))和可選標(biāo)記基因?？蛇x標(biāo)記基因有助于已引入有載體的宿主細(xì)胞的選擇(參看例如美國專利第4,399,216號(hào)、第4,634,665號(hào)和第5,179,017號(hào)，均屬于阿克賽爾(Axel)等人)。舉例來說，通常，可選標(biāo)記基因賦予已引入有載體的宿主細(xì)胞對藥物(例如G418、嘌呤霉素(puromycin)、殺稻瘟菌素(blasticidin)、潮霉素(hygromycin)或甲氨蝶呤(methotrexate))的抗性。適合的可選標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于DHFR-宿主細(xì)胞中甲氨蝶呤選擇/擴(kuò)增)和neo基因(用于G418選擇)。對于CTLA4蛋白的表達(dá)，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼CTLA4蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”的各種形式應(yīng)涵蓋常用于將外源DNA引入原核或真核宿主細(xì)胞中的多種技術(shù)，例如電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沈淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等。可在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明CTLA4蛋白。在某些實(shí)施例中，在真核細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞或酵母宿主細(xì)胞)中進(jìn)行CTLA4蛋白表達(dá)以使經(jīng)適當(dāng)折疊、經(jīng)翻譯后修飾且具有免疫活性的抗體的分泌最佳。用于表達(dá)本發(fā)明的重組蛋白的示范性哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(包括沃勞(Urlaub)和岑森(Chasin)1980年在《美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》77：4216-4220中描述的DHFR-CHO細(xì)胞，與DHFR可選標(biāo)記一起使用，例如考夫曼(Kaufman)和夏普(Sharp)1982年在《分子生物學(xué)(Mol.Biol.)》159：601-621中所述)、NS0骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞、293細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞。當(dāng)將編碼CTLA4蛋白的重組表達(dá)載體引入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中時(shí)，通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞持續(xù)一段足以使所述蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中表達(dá)或使所述蛋白質(zhì)分泌到宿主細(xì)胞所生長的培養(yǎng)基中的時(shí)期來產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法自培養(yǎng)基回收CTLA4蛋白。重組DNA技術(shù)也可用于去除一些或所有非與CTLA4配體結(jié)合所必需的編碼CTLA4蛋白的DNA。本發(fā)明的蛋白質(zhì)還涵蓋由所述截短的DNA分子表達(dá)的分子。一旦產(chǎn)生編碼野生型阿巴西普或CDR樣序列與阿巴西普的CDR樣序列相關(guān)的CTLA4蛋白的一個(gè)或一個(gè)以上部分的核酸，即可將進(jìn)一步改變或突變引入編碼序列中，例如以產(chǎn)生編碼具有不同CDR樣序列的CTLA4蛋白或?qū)c受體的親和力降低的蛋白質(zhì)的核酸。也可通過化學(xué)合成(例如通過描述于固相肽合成(SolidPhasePeptideSynthesis)，第2版，1984皮爾斯化學(xué)公司(ThePierceChemicalCo.)，羅克福德(Rockford)，伊里諾斯州(I11.)中的方法)產(chǎn)生本發(fā)明CTLA4蛋白。變體蛋白質(zhì)也可使用無細(xì)胞平臺(tái)產(chǎn)生(參看例如楚(Chu)等人，生物化學(xué)第2期(BiochemiaNo.2)，2001(羅氏分子生物制品公司(RocheMolecularBiologicals)))。一旦已通過重組表達(dá)產(chǎn)生本發(fā)明CTLA4蛋白，即可通過所屬領(lǐng)域中已知用于純化蛋白質(zhì)的任何方法對其進(jìn)行純化，所述方法例如使用可與本發(fā)明蛋白質(zhì)的CTLA4結(jié)合域反應(yīng)的抗體；或色譜法(例如離子交換色譜法、親和力(例如對CD80和/或CD86的親和力)色譜法和篩分柱色譜法(sizingcolumnchromatography))；離心法；差異溶解度；或通過任何其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。另外，本發(fā)明CTLA4蛋白可與本文所述或另外為所屬領(lǐng)域中已知的異源多肽序列融合以便于純化。一旦經(jīng)分離，必要時(shí)可例如通過高效液相色譜法(參看例如費(fèi)希爾(Fisher)，生物化學(xué)和分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)(LaboratoryTechniquesInBiochemistryAndMolecularBiology)(沃克(Work)和伯登(Burdon)編，愛思唯爾公司(Elsevier)，1980))或通過凝膠過濾色譜法在SuperdexTM75柱(醫(yī)藥和生物技術(shù)有限公司(PharmaciaBiotechAB)，烏普薩拉(Uppsala)，瑞典(Sweden))上進(jìn)一步純化CTLA4蛋白。6.CTLA4蛋白的生物活性在各種實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白具有某些生物活性，例如與阿巴西普競爭結(jié)合CD80和/或CD86，或阻斷T細(xì)胞反應(yīng)。因此，在某些實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與阿巴西普競爭結(jié)合CD80或CD86。競爭結(jié)合CD80或CD86的能力可使用競爭分析加以測試。在競爭分析的一個(gè)實(shí)例中，(放大發(fā)光親近性均相(AmplifiedLuminescentProximityHomogeneous))或分析可用作ELISA的非洗滌替代分析。在分析中，融合有標(biāo)簽(例如Cλ-HA)的配體CD80或CD86與結(jié)合有抗標(biāo)簽抗體(例如山羊抗人類Cλ)的受體珠粒結(jié)合且經(jīng)生物素標(biāo)記的阿巴西普與抗生蛋白鏈菌素(strepavidin)涂覆的供體珠粒(珀金埃爾默公司(PerkinElmer)，沃爾瑟姆(Waltham)，馬薩諸塞州(MA))結(jié)合。在不存在競爭性CTLA4變體的情況下，阿巴西普與CD80或CD86相互作用且產(chǎn)生615nm下的信號(hào)。添加的未標(biāo)記的CTLA4變體與阿巴西普/CD80或CD86相互作用競爭，從而在數(shù)量上減少熒光以使得能夠測定相對結(jié)合親和力?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法用硫基-NHS-生物素對阿巴西普進(jìn)行生物素標(biāo)記且在PBS中透析。受體珠粒的結(jié)合是通過根據(jù)“分析開發(fā)指南”(珀金埃爾默公司(PerkinElmer))進(jìn)行。在384孔AlphaPlate(珀金埃爾默公司(PerkinElmer))中在分析緩沖液(例如含1％BSA、0.01％吐溫20(Tween20)的PBS(pH7.1))中進(jìn)行結(jié)合。各孔含有0.5nM經(jīng)生物素標(biāo)記的阿巴西普、從40nM起始以1∶4連續(xù)稀釋的CTLA4競爭劑、0.078μg/mlCD80和5μg/ml結(jié)合山羊抗人類Cλ的受體珠粒。在室溫下在黑暗中將板培育1小時(shí)。接著以5μg/ml添加抗生蛋白鏈菌素供體珠粒到各孔中。在室溫下在黑暗中將板再培育30分鐘，此后在EnVision讀取器(珀金埃爾默公司(PerkinElmer))上進(jìn)行讀取。利用軟件GRAPHPADPRISM(GraphPad，圣地亞哥(SanDiego))使用非線性回歸擬合數(shù)據(jù)。對于CD86結(jié)合，首先培育8nM經(jīng)生物素標(biāo)記的阿巴西普、從100nM起始以1∶4連續(xù)稀釋的競爭劑、0.1μg/mlCD86和10μg/ml結(jié)合山羊抗人類Cλ的受體珠粒，接著添加10μg/ml抗生蛋白鏈菌素供體珠粒。這種競爭分析的變化形式也可用于測試本發(fā)明CTLA4蛋白與阿巴西普之間的競爭。舉例來說，在某些方面，CTLA4蛋白用作參照物且阿巴西普用作測試分子。另外，可使用在所培養(yǎng)的細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO)的表面上表達(dá)的膜結(jié)合配體來代替可溶性CD80或CD86。所屬領(lǐng)域中已知并且可使用其它形式的競爭分析。在各種實(shí)施例中，當(dāng)本發(fā)明CTLA4蛋白以0.01μg/ml、0.025μg/ml、0.05μg/ml、0.075μg/ml、0.1μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、0.75μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的濃度或以介于任何上述值之間的范圍內(nèi)的濃度(例如以介于0.1μg/ml到2μg/ml的范圍內(nèi)的濃度)使用時(shí)，CTLA4蛋白使經(jīng)標(biāo)記的阿巴西普的結(jié)合減少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％、或介于任何上述值之間的范圍內(nèi)的百分比(例如本發(fā)明CTLA4蛋白使經(jīng)標(biāo)記的阿巴西普的結(jié)合減少10％到40％、50％到70％、40％到60％、或80％到99％)。在某些方面，測試本發(fā)明CTLA4變體引發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)的能力。具體說來，使用多中心(multi-pin)形式由模擬表位(Mimotope)(阿德雷德(Adelaide)，澳大利亞(Australia))合成CTLA4肽?？珊铣蒀TLA4多肽序列，例如呈有12個(gè)氨基酸重疊的15聚體肽形式。將肽以約1-2mg/ml再懸浮于DMSO(西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich))中。保持儲(chǔ)備肽冷凍在-20℃下。為了分離外周血液單核細(xì)胞，可從史丹福血液中心(StanfordBloodCenter)，帕洛阿爾托(PaloAlto)，加利福尼亞(CA)購得社區(qū)供體白細(xì)胞層產(chǎn)物。用不含鈣或鎂的DPBS按1∶1v∶v稀釋白細(xì)胞層物質(zhì)。用12.5mlFicollPaque-PLUS(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GEHealthcare))使經(jīng)稀釋的白細(xì)胞層物質(zhì)(25-35ml)處于50ml錐形離心管(薩斯特公司(Sarsted)或考斯塔公司(Costar))下層。在室溫下以900g將樣品離心30分鐘。從界面收集外周血液單核細(xì)胞(PBMC)。添加DPBS以使最終體積達(dá)到50ml且以350g將細(xì)胞離心5分鐘。將集結(jié)成粒的細(xì)胞再懸浮于DPBS中且計(jì)數(shù)。為了分離樹突狀細(xì)胞，將含108個(gè)新鮮分離的PBMC的AIMV培養(yǎng)基(英杰公司(Invitrogen))(總體積為30ml)接種于T75培養(yǎng)瓶(考斯塔公司(Costar))中。將過量PBMC于90％胎牛血清(FCS)、10％DMSO中以5×107個(gè)細(xì)胞/毫升冷凍于-80℃下。在37℃下于5％CO2中培育T75培養(yǎng)瓶2小時(shí)。去除非粘著細(xì)胞，且用DPBS洗滌粘著單層細(xì)胞。為了區(qū)分樹突狀細(xì)胞與單核細(xì)胞，添加30ml含有800個(gè)單位/毫升GM-CSF(R和D系統(tǒng)(RandDSystems))和500個(gè)單位/毫升IL-4(R和D系統(tǒng)(RandDSystems))的AIMV培養(yǎng)基。將培養(yǎng)瓶培育5天。在第5天添加IL-1α(音杰公司(Endogen))和TNFα(音杰公司(Endogen))分別達(dá)到50pg/ml和0.2ng/ml。將培養(yǎng)瓶再培育兩天。在第7天，通過添加3ml含有0.5到1.0mg絲裂霉素C(MitomycinC)(西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich))的100mMEDTA達(dá)到最終濃度為10mMEDTA和16.5到33μg/ml絲裂霉素C來收集樹突狀細(xì)胞。在37℃和5％CO2下再培育培養(yǎng)瓶1小時(shí)。收集樹突狀細(xì)胞，且在AIMV培養(yǎng)基中洗滌2-3次。對于細(xì)胞培養(yǎng)，在第7天，在37℃水浴中迅速解凍先前冷凍的自體PBMC。立即將細(xì)胞稀釋于DPBS或AIMV培養(yǎng)基中且以350g離心5分鐘。通過陰性選擇使用磁珠(Easy-SepCD4+試劑盒，干細(xì)胞技術(shù)公司(StemCellTechnologies))來增濃CD4+細(xì)胞。在96孔圓底板(考斯塔(Costar)9077)中以每孔每2×104個(gè)樹突狀細(xì)胞對應(yīng)2×105個(gè)CD4+T細(xì)胞來共培養(yǎng)自體CD4+T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。以約5μg/ml添加肽。對照孔僅含有0.25％v∶v的DMSO(西格瑪(Sigma))媒劑。陽性對照孔含有0.25％的DMSO和1μg/ml的破傷風(fēng)類毒素(tetanustoxoid)(李斯特生物公司(ListBiologicals)或卡爾生物化學(xué)公司(CalBioChem))。將培養(yǎng)物培育5天。在第5天，每孔添加0.25μCi的氚化胸苷(安瑪西亞公司(Amersham)或通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GEHealthcare))。在第6天，使用PackardFiltermate細(xì)胞收集器將培養(yǎng)物收集到過濾墊。使用WallacMicroBeta1450閃爍計(jì)數(shù)器(珀金埃爾默公司(PerkinElmer))進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)。通過對6到12個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的個(gè)別結(jié)果求平均值來計(jì)算平均背景CPM值。對四個(gè)陽性對照孔的CPM值求平均值。對各肽的重復(fù)實(shí)驗(yàn)孔或一式三份孔求平均值。通過用平均實(shí)驗(yàn)CPM值除以平均對照值來計(jì)算陽性對照孔和肽孔的刺激指數(shù)值。為了納入數(shù)據(jù)集之中，需要破傷風(fēng)類毒素陽性對照孔中大于3.0的刺激指數(shù)。記錄產(chǎn)生2.95或2.95以上的刺激指數(shù)的任何肽的反應(yīng)。使用來自一組100個(gè)供體的外周血液樣品對肽進(jìn)行測試。匯集對所有肽的反應(yīng)。對于所測試的各肽，計(jì)算在2.95或2.95以上的刺激指數(shù)下起反應(yīng)的供體組(donorset)的百分比。此外，還計(jì)算所有供體的平均刺激指數(shù)。通過分析在100個(gè)供體的組內(nèi)對肽的反應(yīng)百分比來鑒別CD4+T細(xì)胞抗原決定基肽。對所測試的說明CTLA4多肽的所有肽計(jì)算平均反應(yīng)百分比和標(biāo)準(zhǔn)偏差。大于或等于平均背景反應(yīng)加上3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差的反應(yīng)率被視為潛在CD4+T細(xì)胞抗原決定基。在其它方面，本發(fā)明CTLA4多肽抑制在一系列活體外分析中抑制CD80和/或CD86的活性，例如細(xì)胞增殖、細(xì)胞激素(例如IL-2)產(chǎn)生和細(xì)胞粘著。在一些實(shí)施例中，所分析的活性為本發(fā)明CTLA4多肽的免疫抑制活性。具體說來，從供體新鮮收集的人類血液用等體積PBS稀釋且根據(jù)制造商說明書使用Histopaque(西格瑪(Sigma))Ficoll梯度部分分離以分離PMBC。PMBC在補(bǔ)充有10％FBS(?？坡」?Hyclone))和1×PSG(青霉素(penicillin)、鏈霉素(streptomycin)和谷氨酰胺)(英杰公司(Invitrogen))的RPMI培養(yǎng)基(西格瑪(Sigma))中稀釋且以1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度添加到96孔培養(yǎng)板(BD生物科學(xué)公司(BDBiosciences))中。待測試的CTLA4蛋白在相同培養(yǎng)基中連續(xù)稀釋且一式四份添加到各孔中。通過添加PPD抗原(來自結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mycos)的經(jīng)純化蛋白質(zhì)衍生物)達(dá)到5μl/ml的最終濃度來引發(fā)細(xì)胞增殖。在37℃下培育5天之后，以每孔1μCi添加3H胸苷(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GEHealthcare))且在37℃下將板再培育18小時(shí)。使用制造商推薦的條件用細(xì)胞收集器(FilterMateOmnifilter-96收集器，珀金埃爾默公司(PerkinElmer))收集細(xì)胞且使用閃爍計(jì)數(shù)器(沃拉克特里克斯(WallacTrilux))測量3H胸苷并入量。利用GraphPadPrism5軟件使用非線性回歸曲線擬合模型(S形劑量-反應(yīng)，可變斜率)和最小平方擬合法分析細(xì)胞增殖數(shù)據(jù)。測定各變體的IC50參數(shù)和其相關(guān)95％置信區(qū)間。在某些實(shí)施例中，分析的活性為抑制初級(jí)和二級(jí)同種異體刺激(allo-stimulated)的T細(xì)胞的增殖。具體說來，所述活性可通過人類外周血液CD4+T細(xì)胞的增殖來測量，例如如由拉森(Larsen)等人，2005，美國移植雜志(Am.J.Transplant.)5：443-453所述。在初級(jí)同種異體反應(yīng)(allo-response)分析中，分離人類CD4+T細(xì)胞(每孔3-10×104個(gè))且與表達(dá)等量CD80和CD86的經(jīng)照射的人類B類淋巴母細(xì)胞系(lymphoblastoidcellline)(例如PM細(xì)胞，每孔8.0×103個(gè))，以及不同濃度的野生型CTLA4-Ig或本發(fā)明CTLA4蛋白一起培育。初級(jí)同種異體刺激分析進(jìn)行6天，隨后對于培養(yǎng)的最后7小時(shí)，添加每孔0.5μCi[3H]-胸苷。對于二級(jí)同種異體刺激分析，通過差異密度離心分離來自7天初級(jí)同種異體刺激的T細(xì)胞的活細(xì)胞且靜息24小時(shí)。接著通過在滴定量的野生型CTLA4-Ig或本發(fā)明CTLA4蛋白存在下以與上文相同的比率添加PM細(xì)胞來再刺激(二級(jí)刺激)T細(xì)胞。刺激T細(xì)胞3天，對于培養(yǎng)的最后7小時(shí)，脈沖添加[3H]-胸苷，且如上進(jìn)行收集。或者，可如下文實(shí)例2中所述分析初級(jí)和二級(jí)同種異體刺激的T細(xì)胞的增殖。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4變體的活性可通過抑制細(xì)胞激素產(chǎn)生來測量。舉例來說，在特定實(shí)施例中，細(xì)胞激素為由JurkatT細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2(考克斯(Cox)等人，1999，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化(ProteinExpr.Purif.)17(1)：26-32)。在滴定量的野生型CTLA4-Ig或本發(fā)明CTLA4蛋白存在下用10μg/mLPHA-L和表達(dá)重組CD80或CD86的細(xì)胞(例如CHO-K1，每孔2.5×104個(gè))刺激Jurkat細(xì)胞(每孔1.0×105個(gè))。在培養(yǎng)24小時(shí)之后，使用例如人類IL-2試劑盒(珀金埃爾默公司(PerkinElmer))測量培養(yǎng)上清液中的IL-2濃度?；蛘?，可通過所屬領(lǐng)域中已知的其它方法(例如ELISA)測量IL-2濃度?；蛘?，在另一實(shí)施例中，可在二級(jí)同種異體刺激的T細(xì)胞的培養(yǎng)基中測量對細(xì)胞激素產(chǎn)生的抑制作用(拉森(Larsen)等人，2005，美國移植雜志(Am.J.Transplant.)5：443-453)。去除來自如以上二級(jí)同種異體刺激分析中所述經(jīng)同種異體刺激3天的T細(xì)胞的培養(yǎng)上清液的等分試樣，隨后添加[3H]-胸苷。使用基于珠粒的分析(例如(英杰公司(Invitrogen)))或所屬領(lǐng)域中已知的其它方法(例如ELISA)測量細(xì)胞激素產(chǎn)生(例如IFNγ、IL-2、IL-4)的程度。在某些實(shí)施例中，分析的活性為細(xì)胞粘著。具體說來，將在細(xì)胞表面上重組表達(dá)CD80或CD86的細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)在培養(yǎng)基(例如含10％FBS的RPMI)中稀釋，接種于96孔板中并生長至匯合。當(dāng)匯合時(shí)，將細(xì)胞與本發(fā)明CTLA4蛋白或阿巴西普一起培育或用作陰性對照。通過用溫?zé)崤囵B(yǎng)基洗滌而從細(xì)胞去除未結(jié)合蛋白質(zhì)。純化的T細(xì)胞未經(jīng)刺激，或經(jīng)1μg/ml抗CD3單株抗體預(yù)刺激(在37℃下30分鐘)。將T細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞/孔，在100μl培養(yǎng)基中)接種于CD80或CD86表達(dá)細(xì)胞上且使其在37℃下粘著30分鐘。通過用溫?zé)崤囵B(yǎng)基洗滌各孔3次來去除非粘著細(xì)胞且一式三份進(jìn)行計(jì)數(shù)(例如通過臺(tái)盼藍(lán)拒染(trypanblueexclusion))。按(非粘著細(xì)胞的數(shù)目/輸入細(xì)胞的總數(shù))×100％計(jì)算與CHO細(xì)胞的細(xì)胞粘著?；蛘?，T細(xì)胞可根據(jù)制造商說明書與熒光染料，例如鈣黃綠素(calcein)AM(分子探針公司(MolecularProbes)，尤金(Eugene)俄勒岡州(OR))一起培育，隨后接種到孔中。在與T細(xì)胞一起培育、去除含有非粘著T細(xì)胞的培養(yǎng)基并洗滌之后，通過熒光多孔板讀取器對板進(jìn)行讀取。T細(xì)胞粘著的百分比由下式獲得：(在測試融合蛋白存在下的特異性粘著-背景粘著)/(在阿巴西普存在下的特異性粘著-背景粘著)。7.CTLA4-Ig融合蛋白的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)在某些實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白對CD80和CD86具有高親和力。如本文所用，相較于阿巴西普，對CD80和/或CD86具有“高親和力”的變體蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力改進(jìn)至少1.5倍。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白對CD80具有高親和力且對CD86具有中性親和力。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白對CD80具有高親和力且對CD86具有低親和力。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白對CD86具有高親和力且對CD80具有中性親和力。如本文所用，相較于阿巴西普，對CD80和/或CD86具有“中性親和力”的變體蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力改進(jìn)至少0.5倍但小于1.5倍。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白對CD80具有低親和力且對CD86具有高親和力。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白對CD80與CD86兩者均具有中性親和力。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白對CD80具有中性親和力且對CD86具有低親和力。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白對CD80具有低親和力且對CD86具有中性親和力。如本文所用，相較于阿巴西普，對CD80和/或CD86具有“低親和力”的變體的結(jié)合親和力改進(jìn)小于0.5倍。在特定實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白具有特定締合速率常數(shù)(kon或ka值)、解離速率常數(shù)(koff或kd值)、親和力常數(shù)(KA值)、解離常數(shù)(KD值)和/或IC50值。在各種實(shí)施例中，可根據(jù)卡爾森(Karlsson)等人，1991，免疫方法雜志(J.Immunol.Methods)145：229-240中揭示的方法使用表面等離子體共振測定CTLA4蛋白與CD80或CD86細(xì)胞外域的相互作用的結(jié)合常數(shù)。在某些方面，所述值是選自以下實(shí)施例。在特定實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與CD80結(jié)合的kon為至少102M-1s-1、至少5×102M-1s-1、至少103M-1s-1、至少5×103M-1s-1、至少104M-1s-1、至少5×104M-1s-1、至少105M-1s-1、至少5×105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5×106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5×107M-1s-1、至少108M-1s-1、至少5×108M-1s-1、至少109M-1s-1、至少5×109M-1s-1，或kon在任何一對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如5×104M-1s-1到106M-1s-1或102M-1s-1到5×105M-1s-1)。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與CD86結(jié)合的kon為至少102M-1s-1、至少5×102M-1s-1、至少103M-1s-1、至少5×103M-1s-1、至少104M-1s-1、至少5×104M-1s-1、至少105M-1s-1、至少5×105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5×106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5×107M-1s-1、至少108M-1s-1、至少5×108M-1s-1、至少109M-1s-1、至少5×109M-1s-1，或kon在任何一對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如5×104M-1s-1到106M-1s-1或103M-1s-1到5×105M-1s-1)。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與CD80結(jié)合的koff為2s-1或2s-1以下、1.5s-1或1.5s-1以下、1s-1或1s-1以下、0.5s-1或0.5s-1以下、0.1s-1或0.1s-1以下、5×10-2s-1或5×10-2s-1以下、10-2s-1或10-2s-1以下、5×10-3s-1或5×10-3s-1以下、10-3s-1或10-3s-1以下、5×10-4s-1或5×10-4s-1以下、10-4s-1或10-4s-1以下、5×10-5s-1或5×10-5s-1以下、10-5s-1或10-5s-1以下、5×10-6s-1或5×10-6s-1以下、10-6s-1或10-6s-1以下、5×10-7s-1或5×10-7s-1以下、10-7s-1或10-7s-1以下、5×10-8s-1或5×10-8s-1以下、10-8s-1或10-8s-1以下，或koff速率在任何一對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如1s-1到5×10-3s-1、或5×10-5s-1到10-8s-1)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與CD86結(jié)合的koff為10s-1或10s-1以下、5s-1或5s-1以下、1s-1或1s-1以下、0.5s-1或0.5s-1以下、0.1s-1或0.1s-1以下、5×10-2s-1或5×10-2s-1以下、10-2s-1或10-2s-1以下、5×10-3s-1或5×10-3s-1以下、10-3s-1或10-3s-1以下、5×10-4s-1或5×10-4s-1以下、10-4s-1或10-4s-1以下、5×10-5s-1或5×10-5s-1以下、10-5s-1或10-5s-1以下、5×10-6s-1或5×10-6s-1以下、10-6s-1或10-6s-1以下、5×10-7s-1或5×10-7s-1以下、10-7s-1或10-7s-1以下、5×10-8s-1或5×10-8s-1以下、10-8s-1或10-8s-1以下，或koff速率在任何一對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如1s-1到5×10-3s-1、或5×10-5s-1到10-8s-1)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與CD80結(jié)合的KA(kon/koff)為至少至少5×105M-1、至少105M-1、至少5×106M-1、至少106M-1、至少5×107M-1、至少107M-1、至少108M-1、至少5×108M-1、至少109M-1、至少5×109M-1、至少5×1010M-1、至少1010M-1、至少5×1011M-1、至少1011M-1、至少5×1012M-1、至少1012M-1、至少5×1013M-1、至少1013M-1、至少5×1014M-1、至少1014M-1、至少5×1015M-1、至少1015M-1，或KA在任何一對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如5×105M-1到5×1013M-1或5×108M-1到5×1015M-1)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與CD86結(jié)合的KA(kon/koff)為至少5×104M-1、至少104M-1、至少5×105M-1、至少105M-1、至少5×106M-1、至少106M-1、至少107M-1、至少5×107M-1、至少108M-1、至少5×108M-1、至少5×109M-1、至少109M-1、至少5×1010M-1、至少1010M-1、至少5×1011M-1、至少1011M-1、至少5×1012M-1至少1012M-1、至少5×1013M-1、至少1013M-1、至少5×1014M-1、至少1014M-1，或KA在任何一對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如5×104M-1到1013M-1或5×107M-1到5×1013M-1)。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4與CD80結(jié)合的KD(koff/kon)為5×10-6M或5×10-6M以下、10-6M或10-6M以下、5×10-7M或5×10-7M以下、10-7M或10-7M以下、5×10-8M或5×10-8M以下、10-8M或10-8M以下、5×10-9M或5×10-9M以下、10-9M或10-9M以下、5×10-10M或5×10-10M以下、10-10M或10-10M以下、5×10-11M或5×10-11M以下、10-11M或10-11M以下、5×10-12M或5×10-12M以下、10-12M或10-12M以下、5×10-13M或5×10-13M以下、10-13M或10-13M以下、5×10-14M或5×10-14M以下、10-14M或10-14M以下、5×10-15M或5×10-15M以下、10-15M或10-15M以下，或KD在任何一對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如10-7M到5×10-13M、或5×10-9M到10-15M)。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與CD86結(jié)合的KD(koff/kon)為10-5M或10-5M以下、5×10-6M或5×10-6M以下、10-6M或10-6M以下、5×10-7M或5×10-7M以下、10-7M或10-7M以下、5×10-8M或5×10-8M以下、10-8M或10-8M以下、5×10-9M或5×10-9M以下、10-9M或10-9M以下、5×10-10M或5×10-10M以下、10-10M或10-10M以下、5×10-11M或5×10-11M以下、10-11M或10-11M以下、5×10-12M或5×10-12M以下、10-12M或10-12M以下、5×10-13M或5×10-13M以下、10-13M或10-13M以下、5×10-14M或5×10-14M以下、10-14M或10-14M以下、5×10-15M或5×10-15M以下、10-15M或10-15M以下，或KD在任何一對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如10-6M到5×10-10M、或5×10-9M到10-15M)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白結(jié)合CD80且在結(jié)合分析(例如競爭分析)中抑制CD80與阿巴西普結(jié)合，IC50值為小于1000nM、小于750nM、小于500nM、小于100nM、小于50nM、小于10nM、小于5nM、小于1nM、小于0.75nM、小于0.5nM、小于0.25nM、小于0.1nM、小于5×10-2nM、小于10-2nM、小于5×10-3nM、小于10-3nM、小于5×10-4nM或小于10-4nM，或IC50在任何一對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如100nM到5×10-2nM或0.5nM與5×10-4nM)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白結(jié)合CD86且在結(jié)合分析(例如競爭分析)中抑制CD86與阿巴西普結(jié)合，IC50值為小于1000nM、小于500nM、小于100nM、小于50nM、小于10nM、小于5nM、小于1nM、小于0.75nM、小于0.5nM、小于0.25nM、小于0.1nM、小于5×10-2nM、小于10-2nM、小于5×10-3nM、小于10-3nM、小于5×10-4nM或小于10-4nM，或IC50在任何一對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如100nM到5×10-2nM或0.5nM與5×10-4nM)。在某些實(shí)施例中，在比較分析中，本發(fā)明融合蛋白的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)與阿巴西普類似或相對于阿巴西普得以改進(jìn)。舉例來說，在某些實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與CD80和/或CD86結(jié)合的kon速率在阿巴西普的kon的約0.05倍到1000倍的范圍內(nèi)，例如kon為阿巴西普的kon的0.06倍、kon為阿巴西普的kon的0.08倍、kon為阿巴西普的kon的0.1倍、kon為阿巴西普的kon的0.5倍、kon為阿巴西普的kon的1倍、kon為阿巴西普的kon的1.1倍、kon為阿巴西普的kon的1.2倍、kon為阿巴西普的kon的1.3倍、kon為阿巴西普的kon的1.4倍、kon為阿巴西普的kon的1.5倍、kon為阿巴西普的kon的1.6倍、kon為阿巴西普的kon的1.6倍、kon為阿巴西普的kon的1.7倍、kon為阿巴西普的kon的1.8倍、kon為阿巴西普的kon的1.9倍、kon為阿巴西普的kon的2倍、kon為阿巴西普的kon的2.25倍、kon為阿巴西普的kon的2.5倍、kon為曲妥珠單抗(traztuzumab)的kon的2.75倍、kon為阿巴西普的kon的3倍、kon為阿巴西普的kon的4倍、kon為阿巴西普的kon的5倍、kon為阿巴西普的kon的6倍、kon為阿巴西普的kon的7倍、kon為阿巴西普的kon的8倍、kon為阿巴西普的kon的9倍、kon為阿巴西普的kon的10倍、kon為阿巴西普的kon的15倍、kon為阿巴西普的kon的20倍、kon為阿巴西普的kon的50倍、kon為阿巴西普的kon的75倍、kon為阿巴西普的kon的100倍、kon為阿巴西普的kon的150倍、kon為阿巴西普的kon的200倍，或kon在任何一對上述值之間的范圍內(nèi)，例如kon為阿巴西普的kon的0.1倍-75倍、kon為阿巴西普的kon的5倍-100倍、kon為阿巴西普的kon的0.05倍-1000倍、kon為阿巴西普的kon的0.75倍-250倍等。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與CD80和/或CD86結(jié)合的koff速率在阿巴西普的koff的約0.001倍到約3倍的范圍內(nèi)，例如koff為阿巴西普的koff的0.002倍、koff為阿巴西普的koff的0.003倍、koff為阿巴西普的koff的0.004倍、koff為阿巴西普的koff的0.005倍、koff為阿巴西普的koff的0.006倍、koff為阿巴西普的koff的0.0075倍、koff為阿巴西普的koff的0.01倍、koff為阿巴西普的koff的0.025倍、koff為阿巴西普的koff的0.05倍、koff為阿巴西普的koff的0.075倍、koff為阿巴西普的koff的0.1倍、koff為阿巴西普的koff的0.25倍、koff為阿巴西普的koff的0.5倍、koff為阿巴西普的koff的0.75倍、koff為阿巴西普的koff的1倍、koff為阿巴西普的koff的1.25倍、koff為阿巴西普的koff的1.5倍、koff為阿巴西普的koff的1.75倍、koff為阿巴西普的koff的2倍、koff為阿巴西普的koff的2.25倍、koff為阿巴西普的koff的2.5倍、koff為阿巴西普的koff的3倍、koff為阿巴西普的koff的4倍、koff為阿巴西普的koff的5倍，或koff在任何一對上述值之間的范圍內(nèi)，例如koff為阿巴西普的koff的0.01倍到1.25倍、koff為阿巴西普的koff的0.05倍到2.5倍、或koff為阿巴西普的koff的0.006倍到0.1倍等。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與CD80和/或CD86結(jié)合的KA(kon/koff)在阿巴西普的KA的約0.1倍到約1000倍的范圍內(nèi)，例如KA為阿巴西普的KA的0.2倍、KA為阿巴西普的KA的0.25倍、KA為阿巴西普的KA的0.5倍、KA為阿巴西普的KA的0.75倍、KA為阿巴西普的KA的1倍、KA為阿巴西普的KA的2倍、KA為阿巴西普的KA的3倍、KA為阿巴西普的KA的4倍、KA為阿巴西普的KA的5倍、KA為阿巴西普的KA的10倍、KA為阿巴西普的KA的15倍、KA為阿巴西普的KA的20倍、KA為阿巴西普的KA的30倍、KA為阿巴西普的KA的40倍、KA為阿巴西普的KA的50倍、KA為阿巴西普的KA的75倍、KA為阿巴西普的KA的100倍、KA為阿巴西普的KA的200倍、KA為阿巴西普的KA的250倍、KA為阿巴西普的KA的300倍、KA為阿巴西普的KA的350倍、KA為阿巴西普的KA的400倍、KA為阿巴西普的KA的500倍、KA為阿巴西普的KA的750倍、KA為阿巴西普的KA的1000倍，或KA在任何一對上述值之間的范圍內(nèi)，例如KA為阿巴西普的KA的0.1倍到100倍、KA為阿巴西普的KA的10倍到50倍、或KA為阿巴西普的KA的5倍到50倍等。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與CD80和/或CD86結(jié)合的KD(koff/kon)在阿巴西普的KD的約0.001倍到10倍的范圍內(nèi)，例如KD為阿巴西普的KD的0.001倍、KD為阿巴西普的KD的0.002倍、KD為阿巴西普的KD的0.003倍、KD為阿巴西普的KD的0.004倍、KD為阿巴西普的KD的0.005倍、KD為阿巴西普的KD的0.0075倍、KD為阿巴西普的KD的0.01倍、KD為阿巴西普的KD的0.025倍、KD為阿巴西普的KD的0.05倍、KD為阿巴西普的KD的0.075倍、KD為阿巴西普的KD的0.1倍、KD為阿巴西普的KD的0.2倍、KD為阿巴西普的KD的0.3倍、KD為阿巴西普的KD的0.4倍、KD為阿巴西普的KD的0.5倍、KD為阿巴西普的KD的0.75倍、KD為阿巴西普的KD的1倍、KD為阿巴西普的KD的1.5倍、KD為阿巴西普的KD的2倍、KD為阿巴西普的KD的3倍、KD為阿巴西普的KD的4倍、KD為阿巴西普的KD的5倍、KD為阿巴西普的KD的6倍、KD為阿巴西普的KD的7倍、KD為阿巴西普的KD的8倍、KD為阿巴西普的KD的9倍、KD為阿巴西普的KD的10倍，或KD在任何一對上述值之間的范圍內(nèi)，例如KD為阿巴西普的KD的0.001倍到0.5倍、KD為阿巴西普的KD的0.1倍到4倍、KD為阿巴西普的KD的0.05倍到1倍等。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與CD80和/或CD86結(jié)合且抑制細(xì)胞生長或IL2產(chǎn)生，IC50值在阿巴西普的IC50的約0.001倍到10倍的范圍內(nèi)，例如IC50為阿巴西普的IC50的0.005倍、IC50為阿巴西普的IC50的0.01倍、IC50為阿巴西普的IC50的0.05倍、IC50為阿巴西普的IC50的0.1倍、IC50為阿巴西普的IC50的0.2倍、IC50為阿巴西普的IC50的0.3倍、IC50為阿巴西普的IC50的0.4倍、IC50為阿巴西普的IC50的0.5倍、IC50為阿巴西普的IC50的0.6倍、IC50為阿巴西普的IC50的0.7倍、IC50為阿巴西普的IC50的0.8倍、IC50為阿巴西普的IC50的0.9倍、IC50為阿巴西普的IC50的1倍、IC50為阿巴西普的IC50的1.5倍、IC50為阿巴西普的IC50的2倍、IC50為阿巴西普的IC50的3倍、IC50為阿巴西普的IC50的4倍、IC50為阿巴西普的IC50的5倍、IC50為阿巴西普的IC50的6倍、IC50為阿巴西普的IC50的7倍、IC50為阿巴西普的IC50的8倍、IC50為阿巴西普的IC50的9倍、IC50為阿巴西普的IC50的10倍、IC50為阿巴西普的IC50的100倍、IC50為阿巴西普的IC50的500倍、IC50為阿巴西普的IC50的1000倍，或IC50在任何一對上述值之間的范圍內(nèi)，例如IC50為阿巴西普的IC50的0.005倍到0.2倍、IC50為阿巴西普的IC50的0.1倍到1.5倍、IC50為阿巴西普的IC50的0.2倍到2倍等。在某些實(shí)施例中，CDR樣環(huán)中的單一取代可導(dǎo)致上述相較于阿巴西普的IC50差異，其中本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白相較于阿巴西普可在CDR樣環(huán)中包含所述取代和多達(dá)5個(gè)其它取代、多達(dá)10個(gè)其它取代、多達(dá)15個(gè)其它取代或多達(dá)20個(gè)其它取代。8.CTLA4蛋白結(jié)合物本發(fā)明CTLA4蛋白包括例如通過使任何類型的分子與蛋白質(zhì)共價(jià)連接以使得所述共價(jià)連接不干擾與CD80或CD86結(jié)合而經(jīng)修飾的結(jié)合物。在某些方面，本發(fā)明CTLA4蛋白可與效應(yīng)部分或標(biāo)記結(jié)合。如本文所用的術(shù)語“效應(yīng)部分”包括例如抗贅生性藥劑、藥物、毒素、生物活性蛋白(例如酶)、抗體或抗體片段、合成或天然存在的聚合物、核酸(例如DNA和RNA)、放射性核素(尤其放射性碘化物)、放射性同位素、螯合金屬、納米粒子和報(bào)告基團(tuán)(例如熒光化合物或可用NMR或ESR光譜法檢測的化合物)。在一個(gè)實(shí)例中，CTLA4蛋白可與效應(yīng)部分(例如細(xì)胞毒性劑、放射性核素或藥物部分)結(jié)合以改變給定生物反應(yīng)。效應(yīng)部分可為蛋白質(zhì)或多肽，例如而不限于毒素(例如相思子毒素(abrin)、蓖麻毒素A(ricinA)、綠膿桿菌外毒素(Pseudomonasexotoxin)或白喉毒素(Diphtheriatoxin))、信號(hào)傳導(dǎo)分子(例如α-干擾素、β-干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板源性生長因子或組織纖維蛋白溶酶原活化因子(tissueplasminogenactivator))、免疫抑制劑(例如環(huán)孢素A(cyclosporineA)、他克莫司(tacrolimus)、卡普司-1H(Campath-1H)或糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid))或消炎劑(例如阿司匹林(aspirin)或萘普生(naproxen))或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，例如抗體、抗淋巴細(xì)胞球蛋白(anti-lymphocyteglobulin)、蛋白質(zhì)或細(xì)胞激素(例如抗TNFα抗體或影響細(xì)胞遷移的抗體，例如那他珠單抗(natalizumab))。在另一實(shí)例中，效應(yīng)部分可為細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑。細(xì)胞毒素和細(xì)胞毒性劑的實(shí)例包括紫杉醇(taxol)、細(xì)胞遲緩素B(cytochalasinB)、短桿菌肽D(gramicidinD)、溴化乙錠(ethidiumbromide)、吐根素(emetine)、絲裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、特諾波賽(tenoposide)、長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、秋水仙堿(colchicin)、阿霉素(doxorubicin)、道諾霉素(daunorabicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycinD)、1-去氫睪酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、和嘌呤霉素、以及其類似物或同系物。效應(yīng)部分還包括(但不限于)抗代謝物(例如甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine))、烷基化劑(例如二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、噻替哌(thioepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)和洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、環(huán)磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露糖醇(dibromomannito1)、鏈佐霉素(streptozotocin)、絲裂霉素C5(mitomycinC5)和順二氯二胺鉑(II)(cis-dichlorodiamineplatinum(II))(DDP)順鉑(cisplatin))、蒽環(huán)霉素(anthracycline)(例如道諾霉素(daunorubicin，先前為daunomycin)和阿霉素)、抗生素(例如放線菌素D(dactinomycin，先前為actinomycin)、博萊霉素(bleomycin)、光神霉素和氨茴霉素(anthramycin)(AMC)、卡奇霉素(calicheamicin)或倍癌霉素(duocarmycin))、和抗有絲分裂劑(例如長春新堿和長春堿)。其它效應(yīng)部分可包括放射性核素，例如(但不限于)111In和90Y、Lu177、鉍213、锎252、銥192和鎢18s/錸188；和藥物，例如(但不限于)烷基磷酸膽堿(alkylphosphocholine)、拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑、紫杉烷(taxoid)和蘇拉明(suramin)。使所述效應(yīng)部分與蛋白質(zhì)結(jié)合的技術(shù)在所屬領(lǐng)域中為眾所周知的(參看例如赫斯多姆(Hellstrom)等人，控制藥物遞送(ControlledDrugDelivery)，第2版，第623-53頁(羅濱遜(Robinson)等人編，1987))；索普(Thorpe)等人，1982，免疫學(xué)評(píng)論(Immunol.Rev.)62：119-58和杜波夫基克(Dubowchik)等人，1999，藥理學(xué)與治療學(xué)(PharmacologyandTherapeutics)83：67-123)。在某些方面，CTLA4蛋白與小分子毒素結(jié)合。在某些示范性實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白與海兔毒素(dolastatin)或海兔毒素的肽類似物或衍生物，例如奧瑞他汀(auristatin)(美國專利第5,635,483號(hào)和第5,780,588號(hào))結(jié)合。海兔毒素或奧瑞他汀藥物部分可經(jīng)由其N(氨基)末端、C(羧基)末端或在內(nèi)部與抗體連接(WO02/088172)。示范性奧瑞他汀實(shí)施例包括N末端經(jīng)連接的單甲基奧瑞他汀藥物部分DE和DF，如美國專利第7,498,298號(hào)中所揭示，所述專利因此以全文引用的方式并入本文中(揭示例如連接子和制備與連接子結(jié)合的單甲基纈氨酸化合物(例如MMAE和MMAF)的方法)。在其它示范性實(shí)施例中，小分子毒素包括(但不限于)卡奇霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)(美國專利第5,208,020號(hào))、新月毒素(trichothene)和CC1065。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，CTLA4蛋白與一個(gè)或一個(gè)以上美登素分子(例如每個(gè)蛋白質(zhì)分子約1到約10個(gè)美登素分子)結(jié)合。美登素可例如轉(zhuǎn)化成May-SS-Me，May-SS-Me可還原成May-SH3且與蛋白質(zhì)反應(yīng)(查理(Chari)等人，1992，癌癥研究(CancerResearch)52：127-131)以產(chǎn)生類美登素-蛋白質(zhì)(maytansinoid-protein)或類美登素-Fc融合結(jié)合物。也可使用的卡奇霉素的結(jié)構(gòu)類似物包括(但不限于)γ11、γ31、γ31、N-乙?；?γ11、PSAG和θ11(希曼(Hinman)等人，1993，癌癥研究(CancerResearch)53：3336-3342；洛德(Lode)等人，1998，癌癥研究(CancerResearch)58：2925-2928；美國專利第5,714,586號(hào)；美國專利第5,712,374號(hào)；美國專利第5,264,586號(hào)；美國專利第5,773,001號(hào))。在某些方面，本發(fā)明CTLA4蛋白可與免疫抑制劑連接。所述藥劑包括糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞生長抑制劑、抗體、作用于免疫親和素(immunophilins)的藥物、士他汀類(statins)，和其它藥劑，例如干擾素(例如INF-β和INF-γ)、類鴉片(opioids)、TNF結(jié)合劑(例如英利昔單抗(infliximab)、依那西普(etanercept)、阿達(dá)木單抗(adalimumab)、姜黃素(curcumin)和兒茶素(catechins))、霉酚酸酯(mycophenolate)、IL-1受體拮抗劑，和其它小分子藥劑(例如芬戈莫德(fingolimod)、多球殼菌素(myriocin))。示范性糖皮質(zhì)激素包括(但不限于)氫皮質(zhì)酮(hydrocortisone)、潑尼松(prednisone)、潑尼龍(prednisolone)、甲潑尼松(methylprednisone)、地塞米松(dexamethasone)、倍他米松(betamethasone)、曲安西龍(triamcinolone)、倍氯米松(beclometasone)、乙酸氟氫皮質(zhì)酮(fludrocortisoneacetate)、乙酸脫氧皮質(zhì)酮(deoxycorticosteroneacetate)和醛固酮(aldosterone)。示范性細(xì)胞生長抑制劑包括(但不限于)環(huán)磷酰胺、亞硝基脲(nitrosoureas)、鉑化合物、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤(azathioprine)、巰基嘌呤、嘧啶類似物、蛋白質(zhì)合成抑制劑，和抗生素，例如放線菌素D、蒽環(huán)霉素、絲裂霉素C、博來霉素和光神霉素。示范性免疫抑制抗體包括(但不限于)抗CD20抗體、抗IL2受體抗體(達(dá)利珠單抗(daclizumab)、巴利昔單抗(basiliximab))、卡普司-1H、抗α4β1整合素抗體、抗IL-15抗體、抗IL-6受體抗體和抗CD3抗體(莫羅單抗(muromonab))。作用于免疫親和素的示范性藥劑包括(但不限于)環(huán)孢素、他克莫司和西羅莫司(sirolimus)。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白可與消炎劑連接。示范性消炎劑包括(但不限于)非類固醇消炎劑，例如布洛芬(ibuprofen)、阿司匹林、萘普生、二氟尼柳(diflunisal)、酮洛芬(ketoprofen)、萘丁美酮(nabumetone)、吡羅昔康(piroxicam)、雙氯芬酸(diclofenac)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)、依托度酸(etodolac)、酮洛酸(ketorolac)、噁丙嗪(oxaprozin)和塞來昔布(celecoxib)，和糖皮質(zhì)激素，其也具有免疫抑制活性。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明CTLA4蛋白可與聚(乙二醇)(PEG)部分連接。在一個(gè)特定實(shí)例中，PEG部分可經(jīng)由位于蛋白質(zhì)中的任何可用氨基酸側(cè)鏈或末端氨基酸官能團(tuán)(例如任何游離氨基、亞氨基、硫醇基、羥基或羧基)連接。所述氨基酸可天然存在于蛋白質(zhì)中或可使用重組DNA方法工程改造到蛋白質(zhì)中。參看例如美國專利第5,219,996號(hào)。多個(gè)位點(diǎn)可用于連接兩個(gè)或兩個(gè)以上PEG分子。PEG部分可通過位于CTLA4蛋白中的至少1個(gè)半胱氨酸殘基的硫醇基共價(jià)連接。當(dāng)硫醇基用作連接點(diǎn)時(shí)，可使用適當(dāng)活化的效應(yīng)部分，例如硫醇選擇性衍生物，例如順丁烯二酰亞胺和半胱氨酸衍生物。CTLA4蛋白可使用所屬領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)，例如美國專利第4,179,337號(hào)、第4,301,144號(hào)、第4,496,689號(hào)、第4,640,835號(hào)、第4,670,417號(hào)和第4,791,192號(hào)中所述的技術(shù)與PEG或其它親水性合成聚合物(例如聚丙二醇或聚氧化烯)連接，或與例如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等聚合物連接。“標(biāo)記”一詞在本文中使用時(shí)是指可直接或間接與本發(fā)明CTLA4蛋白結(jié)合的可檢測化合物或組合物。標(biāo)記本身可為可檢測的(例如放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)，或在酶標(biāo)記情形下，可催化可檢測的底物化合物或組合物的化學(xué)變化。適用熒光部分包括(但不限于)熒光素(fluorescein)、異硫氰酸熒光素、若丹明(rhodamine)、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻紅素(phycoerythrin)等。適用酶標(biāo)記包括(但不限于)堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶等。尤其適用于診斷目的的其它CTLA4蛋白結(jié)合物描述于以下章節(jié)5.7中。9.CTLA4蛋白的診斷用途本發(fā)明CTLA4蛋白，包括已例如通過生物素化、辣根過氧化物酶或任何其它可檢測部分(包括描述于章節(jié)5.6中的部分)修飾的蛋白質(zhì)，可有利地用于診斷目的。具體說來，CTLA4蛋白可用于例如(但不限于)與CD80和/或CD86結(jié)合以達(dá)成：體外白血球分型(typing)，從而確定B細(xì)胞成熟階段；檢測與B細(xì)胞相關(guān)的疾病；分離CD80和/或CD86陽性細(xì)胞；以及體外和體內(nèi)診斷方法。(參看例如橫地(Yokochi)等人，1982，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)128(2)：823-27)。舉例來說，所述蛋白質(zhì)可在免疫分析中用以定性和定量地測量生物樣品中CD80和/或CD86陽性細(xì)胞的含量。用于執(zhí)行所述診斷技術(shù)的通用指導(dǎo)見于例如哈露(Harlow)等人，抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南(Antibodies：ALaboratoryManual)，第2版(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，1988)和漢普頓R(HamptonR)等人，血清學(xué)方法實(shí)驗(yàn)指南(SerologicalMethodsALaboratoryManual)(APS出版社(APSPress)，1990)中，其各自以全文引用的方式并入本文中。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白可在分析中用以鑒別能夠調(diào)控T細(xì)胞/B細(xì)胞相互作用的其它藥劑，例如抗CTLA4抗體或其片段。具體說來，所述分析鑒別能夠抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)與CD80和/或CD86的結(jié)合的藥劑。適用于篩選調(diào)控T細(xì)胞/B細(xì)胞相互作用的藥劑的分析在所屬領(lǐng)域中為已知的且包括(但不限于)競爭ELISA分析。本發(fā)明另外涵蓋與診斷劑結(jié)合的CTLA4蛋白或其片段。所述蛋白質(zhì)可在診斷上用以例如檢測相關(guān)標(biāo)靶在特定細(xì)胞、組織或血清中的表達(dá)；或監(jiān)測免疫反應(yīng)的發(fā)展或進(jìn)展作為臨床測試程序的一部分，以例如確定給定治療方案的功效。通過使蛋白質(zhì)與可檢測物質(zhì)偶合可便于檢測?？蓹z測物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、發(fā)射正電子的金屬(使用各種正電子發(fā)射斷層攝影法)和非放射性順磁金屬離子?？蓹z測物質(zhì)可直接地或使用所屬領(lǐng)域中已知的技術(shù)經(jīng)由中間物(例如所屬領(lǐng)域中已知的連接子)間接地與蛋白質(zhì)(或其片段)偶合或結(jié)合。酶標(biāo)記的實(shí)例包括熒光素酶(例如螢火蟲熒光素酶和細(xì)菌熒光素酶；美國專利第4,737,456號(hào))、熒光素、2，3-二氫酞嗪二酮、蘋果酸脫氫酶、尿素酶、過氧化物酶(例如辣根過氧化物酶(HRPO))、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙酰膽堿酯酶、葡糖淀粉酶(glucoamylase)、溶菌酶、糖類氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶(lactoperoxidase)、微過氧化物酶(microperoxidase)等。適合輔基復(fù)合物的實(shí)例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素和抗生蛋白(avidin)/生物素；適合熒光物質(zhì)的實(shí)例包括傘酮(umbelliferone)、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯(dansylchloride)或藻紅素；發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括魯米諾(luminol)；生物發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括熒光素酶、熒光素和水母發(fā)光蛋白(aequorin)；且適合放射性物質(zhì)的實(shí)例包括125I、131I、111In或99Tc。本發(fā)明提供CD80和/或CD86表達(dá)的檢測，其包含使用一種或一種以上本發(fā)明CTLA4蛋白(任選與可檢測部分結(jié)合)接觸生物樣品(例如細(xì)胞、組織或體液)，和檢測樣品對于CD80-和/或CD86表達(dá)細(xì)胞是否為陽性，或樣品相較于對照樣品，是否已改變(例如減小或增加)表達(dá)CD80和/或CD86的細(xì)胞的數(shù)目?？墒褂帽景l(fā)明方法診斷的疾病包括(但不限于)本文所述的疾病。在某些實(shí)施例中，組織或體液為外周血液、外周血液白血球、活檢組織(例如乳房或淋巴結(jié)活檢體)和組織。10.使用CTLA4蛋白的治療方法10.1臨床益處本發(fā)明CTLA4蛋白與抗原呈遞細(xì)胞上的CD80和/或CD86相互作用且調(diào)控T細(xì)胞與CD80/CD86陽性細(xì)胞的相互作用。因此，本發(fā)明蛋白質(zhì)適用于治療涉及T細(xì)胞與CD80/CD86陽性細(xì)胞(包括抗原呈遞細(xì)胞)的相互作用調(diào)節(jié)異常的病理學(xué)病況。如以上章節(jié)5.1中所述，在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的變體CTLA4多肽對CD80和CD86具有不同結(jié)合親和力。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的變體CTLA4多肽對CD80與CD86兩者具有類似結(jié)合親和力。CD80和CD86與T細(xì)胞表面蛋白質(zhì)(例如CD28和CTLA4)結(jié)合且引發(fā)不同生物效應(yīng)。舉例來說，CD86與天然T細(xì)胞上的CD28結(jié)合可引發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)。因此，例如通過投與對CD86具有高或中性結(jié)合親和力的本發(fā)明的變體CTLA4多肽抑制或減少CD86與CD28的結(jié)合可抑制T細(xì)胞反應(yīng)的起始且導(dǎo)致T細(xì)胞無反應(yīng)性。此外，CD80與CTLA4的結(jié)合可終止T細(xì)胞反應(yīng)。因此，例如通過投與對CD80具有高或中性結(jié)合親和力的本發(fā)明的變體CTLA4多肽抑制或減少CD80與T細(xì)胞上的CTLA4的結(jié)合可阻斷反應(yīng)的終止且延長T細(xì)胞反應(yīng)。因此，在某些實(shí)施例中，對CD80具有高結(jié)合親和力且對CD86具有低結(jié)合親和力的變體CTLA4多肽，或?qū)D80具有中性結(jié)合親和力且對CD86具有低結(jié)合親和力的變體CTLA4多肽適用于治療要求T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺滅增強(qiáng)的病況，例如癌癥。在其它實(shí)施例中，對CD86具有高親和力或中性結(jié)合親和力且對CD80具有低親和力的變體CTLA4蛋白，或?qū)D80與CD86兩者均具有高結(jié)合親和力的變體CTLA4蛋白適用于治療由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺滅增強(qiáng)所引起的病況，例如自身免疫疾病、或組織、器官或細(xì)胞移植排斥反應(yīng)。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明蛋白質(zhì)適用于治療贅生物。本發(fā)明蛋白質(zhì)適用于治療腫瘤，包括癌癥和良性腫瘤。本文中待治療的癌癥的實(shí)例包括(但不限于)黑素瘤、乳癌、前列腺癌、膀胱癌和結(jié)腸直腸癌。所述癌癥的更特定實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀癌)、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、陰門癌、甲狀腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)和各種類型的頭頸部癌，以及多發(fā)性骨髓瘤、B細(xì)胞淋巴瘤(包括低度/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin′slymphoma，NHL)；小淋巴細(xì)胞性(SL)NHL；中度/濾泡性NHL；中度彌漫性NHL；重度免疫母細(xì)胞性NHL；重度淋巴母細(xì)胞性NHL；重度小無裂細(xì)胞NHL；巨瘤癥性NHL(bulkydiseaseNHL)；套細(xì)胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma)；AIDS相關(guān)的淋巴瘤；和瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom′sMacroglobulinemia))、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性淋巴母細(xì)胞白血病(ALL)、毛細(xì)胞白血病(Hairycellleukemia)、慢性骨髓母細(xì)胞白血病、和移植后淋巴組織增生病癥(PTLD)、以及與母斑病(phakomatosis)、水腫(例如與腦腫瘤相關(guān)的水腫)和梅格斯氏綜合癥(Meigs′syndrome)相關(guān)的異常血管增生。更具體說來，可用本發(fā)明CTLA4蛋白治療的癌癥包括CD80和/或CD86陽性癌癥。在一些實(shí)施例中，適用于癌癥治療的本發(fā)明變體蛋白質(zhì)對CD80具有高親和力且對CD86具有低親和力。在其它實(shí)施例中，適用于癌癥治療的本發(fā)明變體蛋白質(zhì)對CD80具有中性親和力且對CD86具有低親和力。在某些方面，癌癥治療方法包括在向患者投與本發(fā)明CTLA4蛋白的步驟之前，檢測癌細(xì)胞上的CD80和/或CD86的步驟。所述檢測步驟可通過所屬領(lǐng)域中已知的用于測量癌細(xì)胞上的CD80和/或CD86蛋白質(zhì)含量的任何方法(包括(但不限于)免疫組織化學(xué)分析)來達(dá)成。在某些實(shí)施例中，可使用經(jīng)標(biāo)記的抗CD80和/或抗CD86抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明蛋白質(zhì)適用于治療自身免疫疾病。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明蛋白質(zhì)適用治療患有自身免疫疾病的患者，其先前尚未針對所述疾病進(jìn)行治療。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明蛋白質(zhì)適用于治療患有自身免疫疾病且對用甲氨蝶呤、疾病改善抗風(fēng)濕病藥物或抗TNFα拮抗劑的治療反應(yīng)不充分的患者。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4蛋白適用于治療選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的自身免疫疾病。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明蛋白質(zhì)適用于治療選自強(qiáng)直性脊柱炎、硬皮病、多發(fā)性硬化癥和全身性紅斑狼瘡癥的自身免疫疾病。更具體說來，本發(fā)明CTLA4蛋白適用于治療選自以下的自身免疫疾?。杭毙圆ド⑿阅X脊髓炎(acutedisseminatedencephalomyelitis，ADEM)、急性壞死性出血腦白質(zhì)炎、艾迪森氏病(Addison′sdisease)、無γ球蛋白血癥、過敏性哮喘、過敏性鼻炎、斑形脫發(fā)、淀粉樣變性、強(qiáng)直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM腎炎、抗磷脂綜合癥(APS)、自身免疫再生不能性貧血、自身免疫自主神經(jīng)障礙、自身免疫肝炎、自身免疫高脂質(zhì)血癥、自身免疫免疫缺乏、自身免疫內(nèi)耳疾病(AIED)、自身免疫心肌炎、自身免疫胰腺炎、自身免疫視網(wǎng)膜病、自身免疫血小板減少性紫癜(autoimmunethrombocytopenicpurpura，ATP)、自身免疫甲狀腺病、軸索和神經(jīng)元神經(jīng)病(axonal&neuronalneuropathies)、巴洛病(Balodisease)、白塞氏病(Behcet′sdisease)、大皰性類天皰瘡、心肌病、卡斯曼病(Castlemandisease)、口炎性腹瀉(非熱帶性)、卻格司氏病(Chagasdisease)、與慢性疲勞綜合癥或肌肉纖維疼痛相關(guān)的自身免疫病況、慢性發(fā)炎性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)病(chronicinflammatorydemyelinatingpolyneuropathy，CIDP)、慢性復(fù)發(fā)性多灶性骨髓炎(CRMO)、謝格-司托司綜合癥(Churg-Strausssyndrome)、瘢痕性類天皰瘡(cicatricialpemphigoid)/良性粘膜性類天皰瘡、克羅恩氏病(Crohn′sdisease)、科根氏綜合癥(Coganssyndrome)、冷凝集素病、先天性心臟傳導(dǎo)阻滯、科沙奇病毒心肌炎(coxsackiemyocarditis)、CREST病、原發(fā)性混合冷球蛋白血癥、脫髓鞘性神經(jīng)病、皮肌炎、德維克氏病(Devic′sdisease)(視神經(jīng)脊髓炎)、盤狀狼瘡、德雷斯勒氏綜合癥(Dressler′ssyndrome)、子宮內(nèi)膜組織異位癥、嗜伊紅血球筋膜炎、結(jié)節(jié)性紅斑、實(shí)驗(yàn)性過敏腦脊隨炎、埃文斯綜合癥(Evanssyndrome)、纖維性肺泡炎、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎(顳動(dòng)脈炎)、腎小球腎炎、古巴士德氏綜合癥(Goodpasture′ssyndrome)、格雷夫斯氏病(Graves′disease)、古立安-白瑞綜合癥(Guillain-Barresyndrome)、橋本氏腦炎(Hashimoto′sencephalitis)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto′sthyroiditis)、溶血性貧血、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonleinpurpura)、妊娠皰疹、低γ-球蛋白血癥、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA腎病變、免疫調(diào)節(jié)脂蛋白、包涵體肌炎、胰島素依賴性糖尿病(第1型)、間質(zhì)性膀胱炎、幼年性關(guān)節(jié)炎、幼年性糖尿病、川崎綜合癥(Kawasakisyndrome)、蘭伯特-伊頓綜合癥(Lambert-Eatonsyndrome)、溶白血球血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質(zhì)性結(jié)膜炎、線性IgA疾病(LAD)、狼瘡(SLE)、萊姆病(lymedisease)、美尼爾氏病(Meniere′sdisease)、顯微多血管炎、混合結(jié)締組織病(MCTD)、莫倫氏潰瘍(Mooren′sulcer)、姆查-哈伯曼病(Mucha-Habermanndisease)、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、肌炎、發(fā)作性睡病、視神經(jīng)脊髓炎(參看德維克氏病)、嗜中性球減少癥、眼瘢痕類天皰瘡、視神經(jīng)炎、反復(fù)性風(fēng)濕病、PANDAS(與鏈球菌(Streptococcus)相關(guān)的嬰兒自身免疫神經(jīng)精神病癥)、副腫瘤性小腦退化、陣發(fā)性夜間血紅素尿(paroxysmalnocturnalhemoglobinuria，PNH)、帕里羅伯格綜合癥(ParryRombergsyndrome)、帕森那-特納綜合癥(Parsonnage-Turnersyndrome)、睫狀體平坦部炎(外周性眼色素層炎)、天皰瘡(pemphigus)、外周神經(jīng)病、靜脈周腦脊髓炎、惡性貧血、POEMS綜合癥、多發(fā)性結(jié)節(jié)性動(dòng)脈炎、第I型、第II型和第III型自身免疫多腺體綜合癥、風(fēng)濕性多肌痛、多發(fā)性肌炎、心肌梗塞后綜合癥、心包切開后綜合癥、孕酮性皮炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性肺纖維化、壞疽性膿皮病、單純紅血球形成不全、雷諾氏綜合癥(Raynaudsphenomenon)、反射交感性營養(yǎng)不良、萊特氏綜合癥(Reiter′ssyndrome)、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、腿不寧綜合癥、腹膜后纖維化、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類肉瘤病、史密德綜合癥(Schmidtsyndrome)、鞏膜炎、硬皮病、休格連氏綜合癥(Sjogren′ssyndrome)、精子和睪丸自身免疫性、僵人綜合癥、亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎(SBE)、交感性眼炎、高安氏動(dòng)脈炎(Takayasu′sarteritis)、顳動(dòng)脈炎/巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、血小板減少性紫癜(TTP)、托洛薩-亨特綜合癥(Tolosa-Huntsyndrome)、橫貫性脊髓炎、潰瘍性結(jié)腸炎、未分化結(jié)締組織疾病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、大皰性皮膚病、白斑癥和韋格納氏肉芽腫病(Wegener′sgranulomatosis)。在某些實(shí)施例中，適用于治療自身免疫疾病的本發(fā)明變體蛋白質(zhì)對CD86具有高親和力且對CD80具有低親和力。在其它實(shí)施例中，適用于治療自身免疫疾病的本發(fā)明變體蛋白質(zhì)對CD86具有中性親和力且對CD80具有低親和力。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明變體蛋白質(zhì)對CD86與CD80兩者均具有高親和力。在各種實(shí)施例中，本發(fā)明CLTA4蛋白質(zhì)適用于治療細(xì)胞、器官和組織移植物的排斥反應(yīng)、移植物抗宿主疾病和/或適用于誘導(dǎo)患有第1型糖尿病的患者的異種移植耐受性，例如胰島異種移植耐受性。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明變體蛋白質(zhì)對CD86具有高親和力且對CD80具有低親和力。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明變體蛋白質(zhì)對CD86具有中性親和力且對CD80具有低親和力。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明變體蛋白質(zhì)對CD86與CD80兩者均具有高親和力。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明蛋白質(zhì)適用于治療由依賴于T細(xì)胞活化的病毒增殖引起的感染。所述病毒包括(但不限于)HTLV-1、HIV-1和HIV2病毒。因此，本發(fā)明提供治療有需要的患者的任何上述疾病的方法，其包含：向所述患者投與本發(fā)明CTLA4蛋白。任選地，例如在以下時(shí)間之后重復(fù)所述投藥：1天、2天、3天、5天、1周、2周、3周、1個(gè)月、5周、6周、7周、8周、2個(gè)月或3個(gè)月?？梢韵嗤瑒┝炕虿煌瑒┝恐貜?fù)投藥?？芍貜?fù)投藥1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或10次以上。舉例來說，根據(jù)某些給藥方案，患者接受CTLA4療法持續(xù)一段較長時(shí)期，例如6個(gè)月、1年或1年以上。在各種實(shí)施例中，CTLA4療法的時(shí)期與無CTLA4療法的時(shí)期交替。在某些實(shí)施例中，向患者投與的蛋白質(zhì)的量為治療有效量。如本文所用，“治療有效”量的CTLA4蛋白可以單次劑量投與或歷經(jīng)治療方案的過程投與，例如歷經(jīng)1周、2周、3周、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年或1年以上的過程。示范性治療方案描述于以下章節(jié)5.8.4中。在某些實(shí)施例中，CTLA4療法在疾病發(fā)作時(shí)或接近疾病發(fā)作時(shí)開始，例如在疾病發(fā)作之后1天到6個(gè)月開始。在一些實(shí)施例中，CTLA4療法在疾病已進(jìn)展之后開始，例如在疾病發(fā)作之后6個(gè)月到1年、2年、或3年開始。在其它實(shí)施例中，CTLA4療法在疾病緩解期內(nèi)投與。在其它實(shí)施例中，CTLA4療法在疾病活動(dòng)期內(nèi)投與。投與CTLA4療法的時(shí)序?qū)⒁曀鶎兕I(lǐng)域技術(shù)人員已知的因素而定，例如疾病性質(zhì)和CD28-CD80/CD86共刺激途徑在所治療疾病中的作用。根據(jù)本發(fā)明，治療疾病涵蓋治療已經(jīng)診斷為患有任何形式的處于任何臨床階段或表現(xiàn)形式的疾病的患者；延遲疾病癥狀或征象的發(fā)作或發(fā)展或加重或惡化；和/或防止和/或減輕疾病的嚴(yán)重性。本發(fā)明CTLA4蛋白所投與的“個(gè)體”或“患者”較佳為哺乳動(dòng)物，例如非靈長類動(dòng)物(例如牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)或靈長類動(dòng)物(例如猴或人類)。在某些實(shí)施例中，個(gè)體或患者為人類。在某些方面，人類為成人患者。在其它方面，人類為嬰兒患者。10.2醫(yī)藥組合物和投藥途徑本文提供包含本發(fā)明CTLA4蛋白、任選的一種或一種以上其它治療劑(例如以下章節(jié)5.8.3中所述的組合治療劑)的組合物。組合物通常將作為一般將包括醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑的無菌醫(yī)藥組合物的一部分來提供。這種組合物可呈任何適合形式(視將其投與患者的所要方法而定)。本發(fā)明CTLA4蛋白可通過多種途徑投與患者，所述途徑例如經(jīng)口、透皮、皮下、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、局部、鞘內(nèi)和腦室內(nèi)。在任何給定情況下，最適合的投藥途徑均將視特定蛋白質(zhì)、個(gè)體、和疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重性以及個(gè)體的身體狀況而定。對于治療本文所述的適應(yīng)癥，本發(fā)明CTLA4蛋白的有效劑量經(jīng)單次(例如推注)投藥、多次投藥或連續(xù)投藥可在約0.1mg/kg到約75mg/kg的范圍內(nèi)，或經(jīng)單次(例如推注)投藥、多次投藥或連續(xù)投藥達(dá)到0.0lμg/ml到5000μg/ml血清濃度的血清濃度，或其中任何有效范圍或值，視所治療的病況、投藥途徑以及個(gè)體的年齡、重量和狀況而定。在某些實(shí)施例中，例如對于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，各劑量可在每公斤體重約0.2mg到約50mg，例如每公斤體重約0.5mg到約20mg的范圍內(nèi)。CTLA4蛋白可調(diào)配成水溶液且通過輸注投與。醫(yī)藥組合物宜呈每劑量含有預(yù)定量的本發(fā)明CTLA4蛋白的單位劑型。這種單位可含有例如(但不限于)0.1mg到5g，例如1mg到1g、100mg到500mg、或10mg到50mg。用于本發(fā)明中的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑可呈現(xiàn)多種形式，視例如待治療的病況或投藥途徑而定?？赏ㄟ^混合具有所要純度的蛋白質(zhì)與所屬領(lǐng)域中常用的任選的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑(其在本文中皆稱為“載劑”)，即緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、等張劑、非離子清潔劑、抗氧化劑和其它雜項(xiàng)添加劑，將本發(fā)明CTLA4蛋白的治療調(diào)配物制備成凍干調(diào)配物或水溶液以供儲(chǔ)存。參看雷明頓藥物科學(xué)(Remington′sPharmaceuticalSciences)，第16版(奧斯陸(Osol)編1980)。所述添加劑在所用劑量和濃度下對接受者必須無毒。緩沖劑有助于維持pH值在接近生理?xiàng)l件的范圍內(nèi)。其可以約2mM到約50mM范圍內(nèi)的濃度存在。適用于本發(fā)明的緩沖劑包括有機(jī)酸與無機(jī)酸和其鹽，例如檸檬酸鹽緩沖液(例如檸檬酸單鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸單鈉混合物等)、丁二酸鹽緩沖液(例如丁二酸-丁二酸單鈉混合物、丁二酸-氫氧化鈉混合物、丁二酸-丁二酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖液(例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、反丁烯二酸鹽緩沖液(例如反丁烯二酸-反丁烯二酸單鈉混合物、反丁烯二酸-反丁烯二酸二鈉混合物、反丁烯二酸單鈉-反丁烯二酸二鈉混合物等)、葡糖酸鹽緩沖液(例如葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、葡糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖液(例如草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖液(例如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)和乙酸鹽緩沖液(例如乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。另外，可使用磷酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液和三甲胺鹽(例如Tris)?？商砑臃栏瘎┮宰柚刮⑸锷L，且其添加量可在0.2％-1％(w/v)范圍內(nèi)。適用于本發(fā)明的防腐劑包括苯酚、苯甲醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯化十八基二甲基苯甲基銨、芐烷銨(benzalconium)鹵化物(例如氯化物、溴化物和碘化物)、氯化六羥季銨(hexamethoniumchloride)，和對羥基苯甲酸烷酯(例如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)已醇和3-戊醇。可添加等張劑(有時(shí)稱為“穩(wěn)定劑”)以確保本發(fā)明的液體組合物的等張性，且等張劑包括多元糖醇，例如三元或三元以上的糖醇，例如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇(arabitol)、木糖醇、山梨醇和甘露醇。穩(wěn)定劑是指一大類賦形劑，其功能范圍可為膨脹劑到使治療劑溶解或有助于防止變性或粘著于容器壁的添加劑。典型穩(wěn)定劑可為多元糖醇(以上列舉)；氨基酸，例如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、L-白氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等；有機(jī)糖或糖醇，例如乳糖、巖藻糖、水蘇糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括環(huán)醇(cyclitols)，例如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫還原劑，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫甘油、α-單硫甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(例如具有10個(gè)或10個(gè)以下殘基的肽)；蛋白質(zhì)，例如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；單糖，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，例如乳糖、麥芽糖、蔗糖；和三糖，例如棉子糖；和多糖，例如葡聚糖。穩(wěn)定劑可以每重量份活性蛋白質(zhì)0.1到10,000重量的范圍內(nèi)存在。可添加非離子表面活性劑或清潔劑(也稱為“濕潤劑”)以有助于使治療劑溶解以及保護(hù)治療蛋白質(zhì)以免發(fā)生攪拌引起的聚集，其也允許調(diào)配物暴露于承受應(yīng)力的剪切面而不導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。適合的非離子表面活性劑包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(polyoxamers)(184、188等)、氧化異丙烯多元醇(Pluronicpolyols)、聚氧乙烯山梨糖醇酐單醚(等)。非離子表面活性劑可以約0.05mg/ml到約1.0mg/ml，例如約0.07mg/ml到約0.2mg/ml的范圍存在。其它雜項(xiàng)賦形劑包括膨脹劑(例如淀粉)、螯合劑(例如EDTA)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、甲硫氨酸、維生素E)和共溶劑。本文調(diào)配物除本發(fā)明CTLA4蛋白外還可含有組合治療劑。適合的組合治療劑的實(shí)例提供于以下章節(jié)5.8.3中。通過輸注投藥的給藥時(shí)程可在每6個(gè)月1次到每日1次之間變化，視許多臨床因素而定，包括疾病類型、疾病嚴(yán)重性和患者對CTLA4蛋白的敏感性。待投與的本發(fā)明CTLA4蛋白的劑量將根據(jù)以下而變化：特定抗體、疾病類型、個(gè)體、和疾病嚴(yán)重性、個(gè)體的身體狀況、治療方案(例如是否使用組合治療劑)和所選投藥途徑；所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定適當(dāng)劑量。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明CTLA4蛋白的最佳量、和個(gè)別劑量的間隔將由所治療病況的性質(zhì)和程度、投藥形式、途徑和部位、以及所治療特定個(gè)體的年齡和狀況決定，且醫(yī)師將最終確定待使用的適當(dāng)劑量?？蛇m當(dāng)?shù)囟啻沃貜?fù)這個(gè)劑量。如果顯現(xiàn)副作用，則可根據(jù)正常臨床實(shí)踐來改變或降低給藥的量和/或頻率。10.3組合療法以下描述可利用本發(fā)明CTLA4蛋白的組合方法。本發(fā)明的組合方法涉及向患者投與至少兩種藥劑，第一藥劑為本發(fā)明CTLA4蛋白，且第二藥劑為組合治療劑。CTLA4蛋白與組合治療劑可同時(shí)、依序或分別投與。本發(fā)明的組合治療方法可產(chǎn)生比累加效應(yīng)大的效應(yīng)，從而提供治療益處，其中CTLA4蛋白或組合治療劑均不以單獨(dú)治療有效的量投與。在本發(fā)明方法中，本發(fā)明CTLA4蛋白和組合治療劑可并行(同時(shí)或依次)投與。如本文所用，如果本發(fā)明CTLA4蛋白和組合治療劑在同一天(例如在相同患者就診期間)投與患者，則認(rèn)為其為依次投與。依次投藥可相隔1、2、3、4、5、6、7或8小時(shí)進(jìn)行。相比之下，如果本發(fā)明CTLA4抗體和組合治療劑在不同天投與患者，例如本發(fā)明CTLA4蛋白和組合治療劑可以1天、2天或3天、1周、2周或1個(gè)月時(shí)間間隔投與，則認(rèn)為其為分別投與。在本發(fā)明的方法中，投與本發(fā)明CTLA4蛋白可在投與組合治療劑之前或之后進(jìn)行。作為非限制性實(shí)例，本發(fā)明CTLA4蛋白和組合治療劑可并行投與一段時(shí)期，隨后的第二時(shí)期中交替投與本發(fā)明CTLA4蛋白和組合治療劑。由于投與本發(fā)明CTLA4蛋白和組合治療劑具有潛在協(xié)同效應(yīng)，所以所述藥劑可以在單獨(dú)投與所述藥劑中的一或兩者時(shí)不具治療有效性的量投與。在某些方面，組合治療劑為化學(xué)治療劑、抗風(fēng)濕病藥物、消炎劑、放射線治療劑、免疫抑制劑或細(xì)胞毒性藥物。用于本文所述的組合療法中的抗風(fēng)濕病藥物包括(但不限于)阿那白滯素(anakinra)、金諾芬(auranofin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、氯奎(chloroquine)、D-青霉胺(D-penicillamine)、硫代蘋果酸金鈉(goldsodiumthiomalate)、羥氯喹(hydroxychloroquine)、硫代苯酸金鈉(Myocrisin)、柳氮磺胺吡啶甲氨蝶呤(sulfasalazinemethotrexate)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、來氟米特(leflunomide)和二甲胺四環(huán)素(minocycline)。在某些實(shí)施例中，抗風(fēng)濕病藥物為TNF-α拮抗劑，包括(但不限于)以下藥劑：例如英利昔單抗(infliximab)(森特考公司(Centocor))或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；阿達(dá)木單抗(adalimumab)(雅培公司(Abbott))或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；戈利木單抗(golimumab)(SIMPONITM；森特考公司(Centocor))或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；塞妥珠單抗(certolizumabpegol)(UCB)或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；依那西普(etanercept)(安進(jìn)公司(Amgen))或其片段、衍生物或類似物；IL-10；沙立度胺(thalidomide)；黃嘌呤衍生物，例如配妥西菲林(pentoxifylline)；和安非他酮(Bupropion)(葛蘭素史克公司(GlaxoSmithKline))。對于治療癌癥，癌癥疫苗可與本發(fā)明CTLA4蛋白組合使用。適合的癌癥疫苗包括靶向?qū)е掳┌Y的病毒的癌癥疫苗，例如用于肝癌的B型肝炎疫苗和用于子宮頸癌的人類乳頭狀瘤病毒疫苗(和)?？膳c本發(fā)明方法組合使用的其它癌癥疫苗包括(但不限于)用于前列腺癌的(登來隆公司(Dendreon)，華盛頓西雅圖(SeattleWA))和用于黑素瘤的OncoVexGM-CSF(BioVex生物公司(BioVex)，馬薩諸塞州沃本(WoburnMA))、用于非小細(xì)胞肺癌的LucanixTM、用于乳癌的和用于腎癌的(安進(jìn)克斯公司(Antigenics)，馬薩諸塞州萊克星頓(LexingtonMA))。在某些實(shí)施例中，癌癥疫苗在投與本發(fā)明CTLA4多肽之前投與。對于治療癌癥、自身免疫疾病或移植物排斥反應(yīng)，消炎劑可與本發(fā)明CTLA4蛋白組合使用。適用于本文所述的方法中的消炎劑包括(但不限于)布洛芬、阿司匹林、萘普生、二氟尼柳、酮洛芬、萘丁美酮、吡羅昔康、雙氯芬酸、吲哚美辛、舒林酸、托美丁、依托度酸、酮洛酸、噁丙嗪、塞來昔布、乙酰胺苯酚、苯海拉明(diphenhydramine)、哌替啶(meperidine)、地塞米松、頗得斯安(pentasa)、美沙拉嗪(mesalazine)、安腸克(asacol)、磷酸可待因(codeinephosphate)、貝諾酯(benorylate)和芬布芬(fenbufen)。對于治療自身免疫疾病或移植物排斥反應(yīng)，免疫抑制劑可與本發(fā)明CTLA4蛋白組合使用。適用于本文所述的方法中的免疫抑制劑包括(但不限于)氫皮質(zhì)酮；潑尼松；潑尼龍；甲潑尼龍；地塞米松；倍他米松；曲安西龍；倍氯米松；乙酸氟氫皮質(zhì)酮；乙酸脫氧皮質(zhì)酮；醛固酮；環(huán)磷酰胺；亞硝基脲；鉑化合物；甲氨蝶呤；硫唑嘌呤；巰基嘌呤；嘧啶類似物；蛋白質(zhì)合成抑制劑；放線菌素D；蒽環(huán)霉素；絲裂霉素C；博萊霉素；光神霉素；雷帕霉素；環(huán)孢素；他克莫司；西羅莫司；霉酚酸；咪唑立賓(mizoribine)；15-去氧斯匹胍素(15-deoxyspergualin)；霉酚酸嗎啉乙酯(MMF)；抗胸腺細(xì)胞球蛋白(anti-thymocyteglobulin)；抗CD20抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗IL2受體抗體(達(dá)利珠單抗、巴利昔單抗)或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；卡普司-IH；抗α4B1整合素抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗IL-15抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗IL-6受體抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD3抗體(莫羅單抗)或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗MHC抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD2抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD4抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD11a/CD18抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD7抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD27抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD80和/或抗CD86抗體(例如ATCCHB-253、ATCCCRL-2223、ATCCCRL-2226、ATCCHB-301、ATCCHB-11341等)或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD40抗體(例如ATCCHB-9110)或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD45抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD58抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD137抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗ICOS抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗CD150抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗OX40抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；抗4-1BB抗體或其衍生物、類似物或抗原結(jié)合片段；和低分子量粘著拮抗劑，例如LFA-1拮抗劑、選擇素拮抗劑和VLA-4拮抗劑。用于本文所述的組合方法中的其它免疫調(diào)節(jié)化合物包括(但不限于)可溶性gp39(也稱為CD40配體(CD40L)、CD154、T-BAM、TRAP)、可溶性CD29、可溶性CD40、可溶性CD80(例如ATCC68627)、可溶性CD86、可溶性CD28(例如68628)、可溶性CD56、可溶性Thy-1、可溶性CD3、可溶性TCR、可溶性VLA-4、可溶性VCAM-1、可溶性LECAM-1、可溶性ELAM-1、可溶性CD44、可與gp39反應(yīng)的抗體(例如ATCCHB-10916、ATCCHB-12055和ATCCHB-12056)、可與CD28反應(yīng)的抗體(例如ATCCHB-11944或mAb9.3，如由馬丁(Martin)等人(臨床免疫學(xué)雜志(J.Clin.Immun.)4(1)：18-22，1980)所述、可與LFA-1反應(yīng)的抗體(例如ATCCHB-9579和ATCCTIB-213)、可與LFA-2反應(yīng)的抗體、可與IL-12反應(yīng)的抗體、可與IFN-γ反應(yīng)的抗體、可與CD48反應(yīng)的抗體、可與任何ICAM反應(yīng)的抗體(例如ICAM-1(ATCCCRL-2252)、ICAM-2和ICAM-3)、可與CTLA4反應(yīng)的抗體(例如ATCCHB-304)、可與Thy-1反應(yīng)的抗體、可與CD56反應(yīng)的抗體、可與CD29反應(yīng)的抗體、可與TCR反應(yīng)的抗體、可與VLA-4反應(yīng)的抗體、可與VCAM-1反應(yīng)的抗體、可與LECAM-1反應(yīng)的抗體、可與ELAM-1反應(yīng)的抗體、可與CD44反應(yīng)的抗體。對于治療癌癥，化學(xué)治療劑可適合與本發(fā)明CTLA4蛋白組合使用?；瘜W(xué)治療劑包括(但不限于)：放射性分子；毒素，也稱為細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑，其包括任何對細(xì)胞活力有害的藥劑；含有化學(xué)治療化合物的藥劑和脂質(zhì)體或其它微脂粒。適合的化學(xué)治療劑的實(shí)例包括(但不限于)：1-去氫睪酮、5-氟尿嘧啶、達(dá)卡巴嗪、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、放線菌素D、阿德力霉素(adriamycin)、阿地白介素(aldesleukin)、抗α5β1整合素抗體、烷基化劑、別嘌呤醇鈉(allopurinolsodium)、六甲蜜胺(altretamine)、胺磷汀(amifostine)、安美達(dá)錠(anastrozole)、氨茴霉素(AMC))、抗有絲分裂劑、順二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、二氨基二氯鉑(diaminodichloroplatinum)、蒽環(huán)霉素(anthracycline)、抗生素、抗代謝物、天冬酰胺酶(asparaginase)、BCG活體(膀胱內(nèi))、倍他米松磷酸鈉(betamethasonesodiumphosphate)和乙酸倍他米松(betamethasoneacetate)、比卡魯胺(bicalutamide)、硫酸博萊霉素(bleomycinsulfate)、白消安、甲酰四氫葉酸鈣(calciumleucouorin)、卡奇霉素、卡培他濱(capecitabine)、卡鉑(carboplatin)、洛莫司汀(CCNU)、卡莫司汀(BSNU)、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱(Cladribine)、秋水仙堿、結(jié)合雌激素、環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺(Cyclothosphamide)、阿糖胞苷、阿糖胞苷、細(xì)胞遲緩素B、環(huán)磷酰胺(Cytoxan)、達(dá)卡巴嗪(Dacarbazine)、放線菌素D(dactinomycin，先前為actinomycin)、鹽酸道諾霉素、檸檬酸道諾霉素、地尼白介素-毒素連接物(denileukindiftitox)、右雷佐生(Dexrazoxane)、二溴甘露醇、二羥基炭疽菌素二酮、多西他賽(Docetaxel)、甲磺酸多拉司瓊(dolasetronmesylate)、鹽酸阿霉素、屈大麻酚(dronabinol)、大腸桿菌L-天冬酰胺酶(E.coliL-asparaginase)、伊洛昔單抗(eolociximab)、吐根素、依泊汀-α(epoetin-α)、伊文氏桿菌屬L-天冬酰胺酶(ErwiniaL-asparaginase)、酯化雌激素、雌二醇、雌莫司汀磷酸鈉、溴化乙錠、乙烯雌二醇(ethinylestradiol)、依替膦酸鹽(etidronate)、依托泊苷嗜橙菌因子(etoposidecitrororumfactor)、磷酸依托泊苷、非格司亭(filgrastim)、氟尿苷、氟康唑(fluconazole)、磷酸氟達(dá)拉賓(fludarabinephosphate)、氟尿嘧啶、氟他胺(flutamide)、醛葉酸(folinicacid)、鹽酸吉西他濱、糖皮質(zhì)激素、乙酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、短桿菌肽D、鹽酸格拉司瓊(granisetronHCL)、羥基脲、鹽酸黃膽素(idarubicinHCL)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、干擾素α-2b、鹽酸伊立替康(irinotecanHCL)、來曲唑(letrozole)、甲酰四氫葉酸鈣(leucovorincalcium)、乙酸亮丙立德(leuprolideacetate)、鹽酸左旋咪唑(levamisoleHCL)、利多卡因、洛莫司汀、類美登素(maytansinoid)、鹽酸二氯甲基二乙胺(mechlorethamineHCL)、乙酸甲羥助孕酮(medroxyprogesteroneacetate)、乙酸甲地孕酮(megestrolacetate)、鹽酸美法侖(melphalanHCL)、硫醇嘌呤(mercaptipurine)、美司鈉(mesna)、甲氨蝶呤、甲基罩固酮、光神霉素、絲裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、尼魯米特(nilutamide)、乙酸奧曲肽(octreotideacetate)、鹽酸昂丹司瓊(ondansetronHCL)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、帕米膦酸二鈉(pamidronatedisodium)、噴司他丁(pentostatin)、鹽酸毛果蕓香素(pilocarpineHCL)、吡利霉素(plimycin)、以聚苯丙生20為載體的卡莫司汀植入劑(polifeprosan20withcarmustineimplant)、卟非姆鈉(porfimersodium)、普魯卡因、鹽酸丙卡巴肼(procarbazineHCL)、普萘洛爾(propranolol)、利妥昔單抗(rituximab)、沙格司亭(sargramostim)、鏈佐霉素(streptozotocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉醇(taxol)、替尼泊甙(teniposide)、特諾波賽(tenoposide)、睪內(nèi)酯(testolactone)、四卡因(tetracaine)、噻替哌苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、硫鳥嘌呤、噻替哌、鹽酸拓樸替康(topotecanHCL)、檸檬酸托瑞米芬(toremifenecitrate)、維甲酸(tretinoin)、戊柔比星(valrubicin)、硫酸長春堿(vinblastinesulfate)、硫酸長春新堿(vincristinesulfate)和酒石酸長春瑞濱(vinorelbinetartrate)。有時(shí)，對于治療癌癥，也向患者投與一種或一種以上細(xì)胞激素可為有益的。在一較佳實(shí)施例中，CTLA4蛋白與生長抑制劑共投與。生長抑制劑的適合劑量為目前所用的劑量且可由于生長抑制劑與CTLA4蛋白的組合作用(協(xié)同作用)而減小。10.4治療方案本發(fā)明提供涉及投與本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白的治療方案。治療方案將視患者的年齡、重量和疾病病況而變化。治療方案可持續(xù)2周到無限期。在具體實(shí)施例中，治療方案持續(xù)2周到6個(gè)月、3個(gè)月到5年、6個(gè)月到1或2年、8個(gè)月到18個(gè)月等。治療方案可為不變劑量方案或多變劑量方案。對于下述劑量示范性方案，CTLA4-Ig融合蛋白可以用于靜脈內(nèi)輸注的不含防腐劑的無菌溶液的形式投與。對于治療重量小于60kg的成人的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白以50mg到750mg的初始劑量靜脈內(nèi)投與。在具體實(shí)施例中，初始劑量為100-600mg、250-500mg、300-550mg、350-500mg、50-250mg、或400-600mg。在初始劑量之后，本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白在首次輸注后2周和4周靜脈內(nèi)投與且此后每4周靜脈內(nèi)投與，劑量為50-750mg，例如100-600mg，例如250-500mg，例如300-550mg，例如50-250mg，或劑量為400-600mg。對于治療重量介于60kg與100kg之間的成人的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白以75mg到1000mg的初始劑量靜脈內(nèi)投與。在具體實(shí)施例中，初始劑量為100-850mg、250-800mg、300-750mg、400-700mg、75-500mg、500-1000mg、或600-800mg。在初始劑量之后，本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白在首次輸注后2周和4周靜脈內(nèi)投與且此后每4周靜脈內(nèi)投與，劑量為75-900mg，例如100-850mg，例如250-800mg，例如300-750mg，例如400-700mg，例如75-500mg，例如500-1000mg，或例如600-800mg。對于治療重量大于100kg的成人的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白以100mg到1500mg的初始劑量靜脈內(nèi)投與。在具體實(shí)施例中，初始劑量為250-1250mg、500-1100mg、750-1000mg、100-800mg、250-900mg、或700-1200mg。在初始劑量之后，本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白在首次輸注后2周和4周靜脈內(nèi)投與且此后每4周靜脈內(nèi)投與，劑量為100mg到1500mg，例如250-1250mg，例如500-1100mg，例如750-1000mg，例如100-800mg，例如250-900mg，或例如700-1200mg。對于治療年齡介于6歲與17歲之間且重量小于75kg的患者的幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎，本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白以0.1到15mg/kg的初始劑量靜脈內(nèi)投與。在具體實(shí)施例中，初始劑量為0.2-12.5mg/kg、0.5-12mg/kg、1-10.5mg/kg、2-10mg/kg、3-9mg/kg、或4-8.5mg/kg。在初始劑量之后，本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白在首次輸注后2周和4周靜脈內(nèi)投與且此后每4周靜脈內(nèi)投與，劑量為0.1到15mg/kg，例如0.2-12.5mg/kg、0.5-12mg/kg、1-10.5mg/kg、2-10mg/kg、3-9mg/kg、或4-8.5mg/kg。對于治療年齡為6歲到17歲且重量大于75kg的患者的幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎，本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白以75mg到1000mg的初始劑量靜脈內(nèi)投與。在具體實(shí)施例中，初始劑量為100-850mg、250-800mg、300-750mg、400-700mg、75-500mg、500-1000mg、或600-800mg。在初始劑量之后，本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白在首次輸注后2周和4周靜脈內(nèi)投與且此后每4周靜脈內(nèi)投與，劑量為75-900mg，例如100-850mg，例如250-800mg，例如300-750mg，例如400-700mg，例如75-500mg，例如500-1000mg，或例如600-800mg。在這些實(shí)施例中，最大劑量不應(yīng)超過1000mg。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明CTLA4-Ig融合蛋白用于治療對甲氨蝶呤療法或?qū)κ褂每筎NFα藥劑(例如依那西普英利昔單抗阿達(dá)木單抗塞妥珠單抗或sTNFR-IgG(來那西普(lenercept)))的療法反應(yīng)不充分的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者。10.5診斷和醫(yī)藥試劑盒本發(fā)明涵蓋含有本發(fā)明CTLA4蛋白(包括CTLA4蛋白的結(jié)合物)的醫(yī)藥試劑盒。醫(yī)藥試劑盒為包含本發(fā)明CTLA4蛋白(例如呈凍干形式或呈水溶液形式)和一種或一種以上以下物質(zhì)的包裝：·組合治療劑，例如如以上章節(jié)5.8.3中所述；·用于投與CTLA4蛋白的裝置，例如筆、針和/或注射器；和·如果蛋白質(zhì)呈凍干形式，則用于再懸浮抗體的醫(yī)藥級(jí)水或緩沖液。在某些方面，分別包裝各單位劑量的CTLA4蛋白，且試劑盒可含有一個(gè)或一個(gè)以上單位劑量(例如2個(gè)單位劑量、3個(gè)單位劑量、4個(gè)單位劑量、5個(gè)單位劑量、8個(gè)單位劑量、10個(gè)單位劑量或10個(gè)以上單位劑量)。在一具體實(shí)施例中，所述一個(gè)或一個(gè)以上單位劑量各自收納于注射器或筆中。本文還涵蓋含有本發(fā)明CTLA4蛋白(包括蛋白質(zhì)結(jié)合物)的診斷試劑盒。診斷試劑盒為包含本發(fā)明CTLA4蛋白(例如呈凍干形式抑或呈水溶液形式)和一種或一種以上適用于執(zhí)行診斷分析的試劑的包裝。當(dāng)CTLA4蛋白用酶標(biāo)記時(shí)，試劑盒可包括為所述酶所需的底物和輔因子(例如提供可檢測發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)的底物前體)。此外，可包括其它添加劑，例如穩(wěn)定劑、緩沖液(例如阻斷緩沖液或溶解緩沖液)等。在某些實(shí)施例中，包括于診斷試劑盒中的CTLA4蛋白是固定于固體表面上，或在試劑盒中包括上面可固定蛋白質(zhì)的固體表面(例如載片)。可大幅改變各種試劑的相對量以提供溶液中實(shí)質(zhì)上使分析敏感度最佳化的試劑濃度。在一具體實(shí)施例中，蛋白質(zhì)和一種或一種以上試劑可以干粉(通常經(jīng)凍干)的形式提供(個(gè)別地或組合)，所述干粉包括溶解后將提供具有適當(dāng)濃度的試劑溶液的賦形劑。實(shí)例1：鑒別對CD80和CD86具有親和力的CTLA4-IG變體1.材料和方法1.1.產(chǎn)生CD80和CD86蛋白CD80和CD86蛋白表達(dá)為單體分泌的融合蛋白。使CD80或CD86的細(xì)胞外域與含有Cys到Ser突變以破壞分子間雙硫鍵的人類λ恒定區(qū)融合(赤松(Akamatsu)等人，2007，免疫方法雜志(J.Immunol.Methods)327：40)。使CD80-Cλ或CD86-Cλ融合蛋白在293T細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中短暫表達(dá)。通過ELISA，使用山羊抗人類λ輕鏈抗體(生物資源公司(Biosource)，卡馬里奧(Camarillo)，加利福尼亞(CA))進(jìn)行捕捉并使用結(jié)合辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗人類λ鏈抗體(南方生物技術(shù)公司(SouthernBiotech)，伯明翰(Birmingham)，亞拉巴馬州(AL))進(jìn)行檢測，來估計(jì)這些融合蛋白的產(chǎn)生量。1.2.CTLA4-Ig變體與CD80和CD86的結(jié)合使融合有Cλ-HA標(biāo)簽的CD80或CD86與結(jié)合有山羊抗人類Cλ抗體的受體珠粒結(jié)合，且使經(jīng)生物素標(biāo)記的阿巴西普與抗生蛋白鏈菌素涂覆的供體珠粒(珀金埃爾默公司(PerkinElmer)，沃爾瑟姆(Waltham)，馬薩諸塞州(MA))結(jié)合。使用標(biāo)準(zhǔn)方法用硫基-NHS-生物素對阿巴西普進(jìn)行生物素標(biāo)記且在PBS中透析。通過遵循制造商的說明書(“分析開發(fā)指南”，珀金埃爾默公司(PerkinElmer))，執(zhí)行受體珠粒的結(jié)合。在384孔AlphaPlate(珀金埃爾默公司(PerkinElmer))中在分析緩沖液(含1％BSA、0.01％吐溫20的PBS(pH7.1))中執(zhí)行結(jié)合分析。各孔含有0.5nM經(jīng)生物素標(biāo)記的阿巴西普、從40nM起始以1∶4連續(xù)稀釋的未標(biāo)記CTLA4-Ig變體蛋白質(zhì)、0.078μg/mlCD80和5μg/ml結(jié)合山羊抗人類Cλ的受體珠粒。在室溫下在黑暗中培育板1小時(shí)。隨后以5μg/ml添加抗生蛋白鏈菌素供體珠粒到各孔中。在室溫下在黑暗中將板再培育30分鐘，此后在EnVision讀取器(珀金埃爾默公司(PerkinElmer))上進(jìn)行讀取。利用軟件GRAPHPADPRISM(GraphPad，圣地亞哥(SanDiego))使用非線性回歸擬合數(shù)據(jù)。對于CD86結(jié)合分析，如上所述在AlphaPlate中培育8nM經(jīng)生物素標(biāo)記的阿巴西普、從100nM起始以1∶4連續(xù)稀釋的未標(biāo)記CTLA4-Ig變體蛋白質(zhì)、0.1μg/mlCD86和10μg/ml結(jié)合山羊抗人類Cλ的受體珠粒，隨后添加10μg/ml抗生蛋白鏈菌素供體珠粒。1.3.產(chǎn)生表達(dá)細(xì)胞表面CD80或CD86的細(xì)胞系將編碼全長人類CD80和CD86的基因亞克隆到適當(dāng)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。用脂染胺(Lipofectamine)2000(英杰公司(Invitrogen))將含有CD80或CD86的cDNA的各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CHO-K1(ATCC)細(xì)胞中且針對在含有0.5mg/mlG418的F12K培養(yǎng)基(45％DMEM，45％F12K，10％FBS)中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進(jìn)行選擇。通過FACS揀選CD80或CD86在細(xì)胞表面上的表達(dá)最高的1％單一克隆且進(jìn)行培養(yǎng)以產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系。證實(shí)兩個(gè)細(xì)胞系之間的表達(dá)量大致彼此相等。1.4.CTLA4-Ig變體抑制JurkatT細(xì)胞的IL-2產(chǎn)生的效能在10μg/mlPHA-P和滴定量的阿巴西普或本發(fā)明CTLA4蛋白存在下培育Jurkat細(xì)胞(每孔3.0×105個(gè))和穩(wěn)定表達(dá)CD80或CD86的CHO-K1(每孔1.0×104個(gè))。24小時(shí)后，使用人類IL-2試劑盒分析上清液以測量分泌的IL-2的量。2.結(jié)果利用證實(shí)關(guān)于CD80或CD86的結(jié)合的總計(jì)27個(gè)高親和力變體和4個(gè)中性親和力變體。在19個(gè)對CD80具有高親和力的CTLA4-Ig變體中，具有突變K28H的CTLA4-Ig變體顯示最高親和力，其結(jié)合親和力是野生型CTLA4-Ig對CD80的結(jié)合親和力的11.9倍(圖2A)。在18個(gè)對CD86具有高親和力的CTLA4-Ig變體中，具有突變A29H的CTLA4-Ig變體顯示最高親和力，其結(jié)合親和力是野生型CTLA4-Ig對CD86的結(jié)合親和力的14.2倍(圖2A)。突變A29Y和L104E為并入貝拉西普(LEA29，百時(shí)美施貴寶公司(Bristol-MyersSquibb))中的突變且在本分析中被再鑒別為高親和力變體(圖3)。在分析中，貝拉西普顯示相較于野生型CTLA4-Ig，與CD80和CD86的結(jié)合分別改進(jìn)22倍和32倍(數(shù)據(jù)未圖示)。在無阻斷劑的典型24小時(shí)分析中，在由PMA和穩(wěn)定表達(dá)CD80或CD86的CHO-K1細(xì)胞刺激的JurkatT細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生2.1-3.5ng/mlIL-2。在例如CTLA4-Ig蛋白或抗CD80或抗CD86抗體等阻斷劑存在下，通過阻斷共刺激信號(hào)而抑制IL-2產(chǎn)生。在不存在PHA-P或?qū)τ贑D80或CD86表達(dá)呈陰性的CHO-K1的情況下，Jurkat細(xì)胞不產(chǎn)生IL-2。類似地，在不存在Jurkat細(xì)胞的情況下，在培養(yǎng)的CHO-K1的培養(yǎng)上清液中未檢測到IL-2(圖4A)。發(fā)現(xiàn)當(dāng)JurkatT細(xì)胞由PMA和表達(dá)CD80或CD86的CHO-K1細(xì)胞刺激時(shí)，野生型CTLA4-Ig與阿巴西普的抑制曲線實(shí)質(zhì)上重疊(圖4B)。這一結(jié)果指示野生型CTLA4-Ig和阿巴西普抑制Jurkat細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的程度相同(即具有類似效能)。野生型CTLA4-Ig對CD80和CD86的平均IC50值分別測定為1.2nM和17.2nM。盡管相較于野生型CTLA4-Ig，貝拉西普中的兩個(gè)氨基酸突變使對CD80的結(jié)合改進(jìn)22倍，但相較于野生型CTLA4-Ig或阿巴西普，貝拉西普關(guān)于抑制CD80介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的效能僅顯示2.0倍的改進(jìn)。相比之下，貝拉西普中所產(chǎn)生的CD86結(jié)合的32倍改進(jìn)使得抑制CD86介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的效能改進(jìn)11.5倍。本發(fā)明CTLA4變體對CD80的親和力改進(jìn)7.2倍到11.9倍使得抑制CD80介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的效能改進(jìn)1.1倍到2.2倍。相比之下，本發(fā)明CTLA4變體對CD86的親和力改進(jìn)7.0倍到14.2倍使得抑制CD86介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的效能改進(jìn)2.4倍到6.2倍。K28H和A29HCTLA4-Ig變體分別顯示對CD80和CD86的最高親和力以及抑制T細(xì)胞活化的最高效能。因此，賦予與配體結(jié)合的較高親和力的突變通常使抑制T細(xì)胞活化的效能改進(jìn)。同樣，具有中性親和力的變體使生物活性無顯著差異(Y52F)。這些結(jié)果指示相較于野生型蛋白質(zhì)，對CD86具有較高結(jié)合親和力的變體相較于對CD80具有較高結(jié)合親和力的變體顯示較佳效能，這類似于關(guān)于貝拉西普獲得的結(jié)果。這一點(diǎn)可通過當(dāng)基線結(jié)合親和力較低時(shí)對生物活性具有較大影響的親合力效應(yīng)來說明。野生型CTLA4-Ig對CD80的結(jié)合親和力可能過高以致于不能通過親合力獲得進(jìn)一步改進(jìn)。相比之下，野生型CTLA4-Ig對CD86的親和力比對CD80的親和力低13倍(克林斯(Collins)等人，2002，免疫學(xué)(Immunity)17：201-210)，意味著CTLA4-Ig變體對CD86的親和力可得到改進(jìn)。親合力效應(yīng)可見于關(guān)于具有突變L96K的CTLA4-Ig變體獲得的結(jié)果(圖4C)。盡管這種變體顯示CD80結(jié)合親和力顯著降低(相較于野生型CTLA4-Ig，低10倍)，但這種變體的效能僅比野生型CTLA4-Ig的效能低2.4倍，這是由于親合力對這種低親和力變體的生物活性的影響增加之故。實(shí)例2：評(píng)估CTLA4-IG變體抑制T細(xì)胞增殖的效能1.材料和方法：CTLA4-Ig變體體外抑制T細(xì)胞增殖反應(yīng)的效能人類彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系SU-DHL-6(ATCCCRL-2959)在細(xì)胞表面上表達(dá)CD80與CD86兩者。將SU-DHL-6細(xì)胞維持于含有10％FBS的RPMI1640中。通過如德國葛萊娜第一生化股份有限公司Leucosep(LeucosepGreinerBio-One，Germany))的使用手冊中所述的Ficoll-PaquePlus(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GEHealthcare)，皮斯卡塔市(Piscataway)，新澤西州(NJ))密度梯度離心，從人類全血或白細(xì)胞層分離外周血液單核細(xì)胞(PBMC)。使用EasySep陰性選擇人類CD4+T細(xì)胞增濃試劑盒(干細(xì)胞技術(shù)公司(STEMCELLTechnologies)，加拿大(Canada))從PBMC分離人類外周CD4+T細(xì)胞。將T細(xì)胞培養(yǎng)于含有10％熱失活FBS、β-巰基乙醇和100U/ml青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中。所得培養(yǎng)物含有純度在90％以上的CD4+。為了建立分析，將在50μL培養(yǎng)基中稀釋的不同濃度的CTLA4-Ig或其變體添加到圓底96孔微量滴定板的各孔中，一式三份。接著在150μL培養(yǎng)基中以5∶1反應(yīng)者-刺激物比率混合CD4+T細(xì)胞(1×105個(gè))與新鮮照射(10,000拉德(rad))的B淋巴瘤細(xì)胞系(2×104個(gè))。添加細(xì)胞到含有CTLA4-Ig或變體的孔中，使得最終體積為每孔200μL。在37℃下在5％CO2中培育初級(jí)同種異體刺激分析物5天，以0.5μCi/孔添加氚化胸苷，再培養(yǎng)18小時(shí)。使用制造商推薦的條件用細(xì)胞收集器(FiltermateOmnifilter-96收集器，珀金埃爾默公司(PerkinElmer))收集細(xì)胞且使用閃爍計(jì)數(shù)器(沃拉克特里克斯(WallacTrilux))測量[3H]胸苷并入量。對于二級(jí)同種異體刺激分析，收集6天初級(jí)同種異體刺激的T細(xì)胞，通過Ficoll-PaquePlus密度梯度離心進(jìn)行分離且在完全培養(yǎng)基中靜息24小時(shí)。接著在CTLA4-Ig和其突變體存在下以如上的相同比率用新鮮照射的B淋巴瘤細(xì)胞再刺激T細(xì)胞3天。在37℃下培育二級(jí)刺激分析物2天，隨后添加0.5μCi/孔的[3H]-胸苷，最后培養(yǎng)18小時(shí)。如上文所指示執(zhí)行細(xì)胞收集。利用GraphPadPrism5軟件，使用非線性回歸曲線擬合方法分析細(xì)胞增殖數(shù)據(jù)。為了評(píng)估CTLA4-Ig變體抑制經(jīng)同種異體抗原刺激的T細(xì)胞增殖的效能，用同種異體B細(xì)胞系SU-DHL-6(對CD80與CD86均呈陽性)(通過FACS證實(shí)，數(shù)據(jù)未顯示)刺激經(jīng)純化的CD4+T細(xì)胞。野生型CTLA4-Ig與商業(yè)阿巴西普的抑制曲線彼此緊密重疊，從而指示抑制CD4+T細(xì)胞中的增殖反應(yīng)的效能相等。對CD80和/或CD86的結(jié)合改進(jìn)的所有變體在初級(jí)和二級(jí)反應(yīng)中均顯示較大的CD4+T細(xì)胞增殖反應(yīng)抑制。對于初級(jí)和二級(jí)反應(yīng)，觀測到IC50的改進(jìn)分別在1.5到20倍和1.5到10倍的范圍內(nèi)(圖5和圖6)?？傊?，對CD80和/或CD86的親和力改進(jìn)對CD4+T細(xì)胞的初級(jí)增殖反應(yīng)的抑制作用大于二級(jí)反應(yīng)，反映了記憶T細(xì)胞對二級(jí)反應(yīng)的共刺激分子的依賴性降低(克洛夫特(Croft)等人，1997，重癥免疫學(xué)評(píng)論(Crit.Rev.Immunol.)17：89)。在測試的8個(gè)變體中，A29H突變引起的抑制初級(jí)與二級(jí)增殖反應(yīng)兩者的效能最大，分別約20倍和10倍。K28H突變次佳，其抑制初級(jí)和二級(jí)反應(yīng)的效能分別改進(jìn)約12倍和8倍(圖5和6。A29H突變顯示對CD86的結(jié)合活性改進(jìn)14倍，但與CD80的結(jié)合僅改進(jìn)3.0倍。另一方面，K28H突變體顯示對兩種配體的改進(jìn)較為平衡，對CD80和CD86分別為12倍和9.5倍(圖2A)。假定A29H和K28H突變的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性相等，因?yàn)锳29H突變引起的抑制初級(jí)與二級(jí)增殖反應(yīng)兩者的改進(jìn)最佳，所以增加對CD86的親和力可對效能具有更大影響。L96K突變使CD80結(jié)合降低約11倍而使CD86結(jié)合改進(jìn)約11倍。對CD86的結(jié)合較高同時(shí)對CD80的結(jié)合降低的另一實(shí)例為T51N(對CD86為10倍而對CD80為0.25倍)。因?yàn)閮煞N變體均未顯示抑制初級(jí)或二級(jí)反應(yīng)的效能降低，所以對CD80的結(jié)合喪失至少多達(dá)11倍似乎可由對CD86的結(jié)合改進(jìn)來補(bǔ)償。另一種可能的解釋是，因?yàn)橐阎狢D80形成二聚體(池水(Ikemuzu)等人，2000，免疫學(xué)(Immunity)12：51)，所以親和力喪失至少多達(dá)11倍可能對由CD80提供的親合力具有最小影響?？傊瑢θ我慌潴w的親和力較高皆使抑制同種異體抗原刺激中的增殖反應(yīng)的效能改進(jìn)，與使用Jurkat和表達(dá)CD80或CD86的CHO細(xì)胞系的24小時(shí)分析的結(jié)果一致(圖4)。CD80與CD86兩者均可促進(jìn)初級(jí)和二級(jí)同種異體反應(yīng)，但在涉及配體表達(dá)和其它共刺激/粘著分子的差異含量下有可能促進(jìn)程度不同。具體實(shí)施例、參考文獻(xiàn)的引用本申請案中引用的所有公開案、專利、專利申請案和其它文獻(xiàn)出于所有目的以全文引用的方式并入本文中，其引用的程度就如同已個(gè)別地將各個(gè)別公開案、專利、專利申請案或其它文獻(xiàn)出于所有目的以引用的方式并入一般。盡管已說明且描述各種具體實(shí)施例，但應(yīng)了解可在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下作出各種變化。CDR樣環(huán)編號(hào)殘基在CDR樣環(huán)中的位置在多肽鏈中的位置1(SEQIDNO：2)P126G227K328A429T530E631V732R8332(SEQIDNO：3)T151Y252M353M454G555N656E757L858T959F1060L1161D1262D13633(SEQIDNO：4)K193V294E395L496M597Y698P799P8100P9101Y10102Y11103L12104表1表2表3表4表5表6表7表8表9表10表11表12表13表14表15表15(續(xù))表16-1表16-2表16-3表16-4表16-5表16-6當(dāng)前第1頁1 2 3