本發(fā)明關(guān)于一種流感病毒的血凝素，尤其特別有關(guān)于藉由中國倉鼠卵巢細(xì)胞株制造的重組h7血凝素，及其用于制備成可誘發(fā)特異性抗體的疫苗組成物。

背景技術(shù)：

a型流行性感冒病毒(influenzaaviruses)會感染人類、哺乳動物及鳥類，是一種人獸共通的傳染病。a型流行性感冒的基因體有8分節(jié)(segmented)的負(fù)股rna核殼，其病毒體為多形性(pleomorphic)且具包膜(envelopeproteins)，該包膜含有兩種糖蛋白：血球凝集素(簡稱血凝素，hemagglutinin，ha)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，na)，內(nèi)部有基質(zhì)蛋白(m1)和膜蛋白(m2)。其中，ha可促使產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體(neutralizingantibody)。

新型流行性感冒病毒的產(chǎn)生是由分節(jié)的基因，經(jīng)基因突變或基因重組(reassortment)造成抗原性改變。依據(jù)a型流行性感冒病毒的ha及na抗原特征(antigeniccharacteristics)，可將a型流行性感冒病毒分類成17種ha(h1～h17)和10種na(n1～n10)血清型。于2013年，h7n9病毒首次分離自罹患嚴(yán)重呼吸道窘迫癥候群(ards)的中國病患，經(jīng)分析，多數(shù)的人類h7n9病毒分離株具有以下特性：1.在ha1/ha2的裂解部位(cleavagesite)缺少數(shù)個堿性氨基酸(polybasicaminoacids)；2.在ha蛋白中，第226個氨基酸原為轉(zhuǎn)譯glutamine的序列發(fā)生突變，而轉(zhuǎn)譯成leucine(haq226lmutation)；3.在na蛋白桿(stalk)上有5個氨基酸缺失；4.在pb2蛋白中，第627個氨基酸原為轉(zhuǎn)譯glutamate的序列，被取代為轉(zhuǎn)譯lysine的序列(pb2上的一個e627k取代)。據(jù)上述分析結(jié)果，為降低h7n9病毒成為全國大流行的可能性，針對h7n9提供有效的疫苗是當(dāng)務(wù)之急。

一般流行性感冒病毒疫苗的制程是將病毒接種在雞胚胎蛋內(nèi)培養(yǎng)(egg-basedvirusvaccineproduction)，經(jīng)由此方法制作疫苗需特別備有昂貴的生物安全二或三級實(shí)驗(yàn)室(2+or3biosafetylevelfacility)。而迄今，h7n9死病毒疫苗(inactivatedvaccine)是對h7n9/pr8病毒進(jìn)行逆向工程制備得來，并配制成水中油滴型乳化液(oil-in-wateremulsion)。此型疫苗經(jīng)嚙齒類動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，可誘發(fā)中和抗體及保護(hù)性免疫反應(yīng)(duan,y.etal.,responseofmiceandferretstoamonovalentinfluenzaa(h7n9)splitvaccine.plosone2014,9(6):e99322.；wu,c.y.etal.,squalene-adjuvantedh7n9virusvaccineinducesrobusthumoralimmuneresponseagainsth7n9andh7n7viruses.vaccine2014.)，唯此型疫苗的產(chǎn)出未經(jīng)任何哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)譯后的蛋白質(zhì)修飾(post-translationalmodification)，如雙硫鍵生成(disulfidebondformation)和糖基化修飾(complextypeglycosylation)，少了轉(zhuǎn)譯后的蛋白質(zhì)修飾，則其蛋白質(zhì)折疊的錯誤率可能提高且其穩(wěn)定性亦降低(hansons.r.etal.,thecoretrisaccharideofann-linkedglycoproteinintrinsicallyacceleratesfoldingandenhancesstability.procnatlacadsciusa2009,106(9):3131-3136.)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種重組h7血凝素，其改善先前技術(shù)中需特別準(zhǔn)備昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)施的缺失，并降低h7n9病毒成為全國大流行的可能性。針對h7n9提供利用哺乳動物細(xì)胞制作出經(jīng)轉(zhuǎn)譯后的蛋白質(zhì)修飾的重組h7血凝素，并利用此重組h7血凝素制備對抗h7n9病毒的疫苗。

本發(fā)明開發(fā)一種重組h7血凝素，其是一種糖蛋白，源自于h7n9病毒株(a/shanghai/2/2013)的血凝素的ecto-domain。利用此重組h7血凝素輔以一藥學(xué)上可接受的佐劑，制備成可對抗h7n9病毒的疫苗。

首先，設(shè)計可表達(dá)重組h7血凝素蛋白的中國倉鼠卵巢(cho-rh7ha)細(xì)胞的表達(dá)基因，再構(gòu)建cho-rh7ha的表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明所使用的中國倉鼠卵巢細(xì)胞缺少二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase)。將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至此中國倉鼠卵巢細(xì)胞。

利用此重組h7血凝素加上不同的佐劑使小鼠免疫，再檢驗(yàn)小鼠的血液及血清，發(fā)現(xiàn)此重組h7血凝素及佐劑可誘發(fā)特異性的igg抗體、igg1抗體、igg2a抗體、血球凝集抑制抗體，以及對抗h7n9病毒的中和抗體。進(jìn)一步利用活h7n9病毒進(jìn)行攻毒(viruschallenge)試驗(yàn)確認(rèn)，經(jīng)此重組h7血凝素加上佐劑免疫過的小鼠，在活h7n9病毒的感染下，小鼠的存活率有顯著的提升。

以下藉由具體實(shí)施例配合所附的圖式詳加說明，當(dāng)更容易了解本發(fā)明的目的、技術(shù)內(nèi)容、特點(diǎn)及其所達(dá)成的功效。

附圖說明

圖1a是表達(dá)重組h7血凝素蛋白的中國倉鼠卵巢細(xì)胞的表達(dá)基因示意圖。

圖1b是構(gòu)建表達(dá)重組h7血凝素蛋白的中國倉鼠卵巢細(xì)胞的質(zhì)粒示意圖。

圖2a顯示中國倉鼠卵巢細(xì)胞株生產(chǎn)的重組h7血凝素蛋白利用sds-page電泳進(jìn)行定性分析的結(jié)果。

圖2b顯示中國倉鼠卵巢細(xì)胞株生產(chǎn)的重組h7血凝素蛋白經(jīng)endoh及pngasef處理后，利用western印跡法分析的結(jié)果。

圖2c顯示利用凝膠過濾層析法分析中國倉鼠卵巢細(xì)胞株生產(chǎn)的重組h7血凝素蛋白的組成份。

圖3顯示中國倉鼠卵巢細(xì)胞株生產(chǎn)的重組h7血凝素蛋白的n-糖基結(jié)構(gòu)。

圖4a-4d顯示利用中國倉鼠卵巢細(xì)胞株生產(chǎn)的重組h7血凝素蛋白作為疫苗接種于小鼠，進(jìn)行免疫化的過程(regimen)，并輔以各種佐劑，誘發(fā)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體的免疫反應(yīng)。

圖5a-5f顯示分析經(jīng)中國倉鼠卵巢細(xì)胞株生產(chǎn)的重組h7血凝素蛋白免疫的小鼠血清樣本，確認(rèn)誘發(fā)特異性抗體的免疫反應(yīng)。

圖6a-6c顯示分析經(jīng)中國倉鼠卵巢細(xì)胞株生產(chǎn)的重組h7血凝素蛋白免疫的小鼠血清樣本，確認(rèn)血清樣本誘發(fā)出針對重組h7血凝素蛋白的血球凝集抑制抗體。

圖6d-6f顯示分析經(jīng)中國倉鼠卵巢細(xì)胞株生產(chǎn)的重組h7血凝素蛋白免疫的小鼠血清樣本，確認(rèn)血清樣本誘發(fā)出對抗h7n9病毒的中和抗體。

圖7a顯示小鼠經(jīng)中國倉鼠卵巢細(xì)胞株生產(chǎn)的重組h7血凝素蛋白免疫，被活h7n9病毒感染后的存活率。

圖7b顯示小鼠經(jīng)中國倉鼠卵巢細(xì)胞株生產(chǎn)的重組h7血凝素蛋白免疫，被活h7n9病毒感染后體重下降的情況。

具體實(shí)施方式

以下將詳述本發(fā)明的各實(shí)施例，并配合圖式作為例示。除了這些詳細(xì)說明之外，本發(fā)明亦可廣泛地施行于其它的實(shí)施例中，任何所述實(shí)施例的輕易替代、修改、等效變化都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并以權(quán)利要求的范圍為準(zhǔn)。在說明書的描述中，為了使讀者對本發(fā)明有較完整的了解，提供了許多特定細(xì)節(jié)；然而，本發(fā)明可能在省略部分或全部特定細(xì)節(jié)的前提下，仍可實(shí)施。此外，眾所周知的步驟或組件并未描述于細(xì)節(jié)中，以避免對本發(fā)明形成不必要的限制。圖式中相同或類似的組件將以相同或類似符號來表示。特別注意的是，圖式僅為示意之用，并非代表組件實(shí)際的尺寸或數(shù)量，有些細(xì)節(jié)可能未完全繪出，以求圖式的簡潔。

1.重組h7血凝素蛋白(rh7ha)的制備

a.設(shè)計可表達(dá)重組h7血凝素蛋白的中國倉鼠卵巢(cho-rh7ha)細(xì)胞的表達(dá)基因并構(gòu)建cho-rh7ha的表達(dá)質(zhì)粒

請配合參閱圖1a。cho-rh7ha細(xì)胞的表達(dá)基因利用a/shanghai/2/2013(h7n9)病毒株的hacdna序列來構(gòu)建。首先將全長ha位于c端的跨膜區(qū)段(transmembranedomain)和胞質(zhì)區(qū)域(cytoplasmicdomain)的序列刪除，另以一leucinezippergcn4-pii序列(mkqiedkieeilskiyhieneiarikkligev)取代前述被刪除的序列，使得在凝血酶切割位置(thrombincleavagesite)的前方形成三聚合結(jié)構(gòu)(trimeriaztion)，尾端再增加his-tag序列以便之后的分離純化。請配合參閱圖1b。cho-rh7ha基因再接著克隆至ikid表達(dá)質(zhì)粒(cassetteplasmid)內(nèi)，此質(zhì)粒包括pcmv啟動子、ivs、ires-drivendhfr及psv40driven抗zoecin基因。

b.轉(zhuǎn)染(transfection)及單細(xì)胞克隆(singlecellcloning)

為取得可穩(wěn)定表達(dá)rh7ha的cho細(xì)胞，可將二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase，dhfr)缺陷的cho(cho/dhfr-)細(xì)胞轉(zhuǎn)染上述質(zhì)粒，并進(jìn)行zeocin抗生素篩選。cho/dhfr-細(xì)胞株(atcccrl-9096)取自臺灣bioresourcecollectionandresearchcenter。cho/dhfr-細(xì)胞因缺少二氫葉酸還原酶，故無法合成核糖核苷(ribonucleoside，rns)及脫氧核糖核苷(deoxyribonucleoside，drns)。使用thermoscientific的turbofect轉(zhuǎn)染試劑于cho/dhfr-細(xì)胞進(jìn)行dna轉(zhuǎn)染。cho/dhfr-細(xì)胞先培養(yǎng)于含有rns、drns與10％胎牛血清的mem-α培養(yǎng)液(minimumessentialmediumalphamedium，invitrogen的產(chǎn)品)中。轉(zhuǎn)染后48小時，再將前述培養(yǎng)液置換為不含rns和drns但含有10％透析型胎牛血清(df)與200μg/mlzeocin(invitrogen的產(chǎn)品)的mem-α培養(yǎng)液。

經(jīng)zeocin篩選二周后，收集穩(wěn)定承載cho-rh7ha表達(dá)質(zhì)粒的剩余細(xì)胞，再稀釋成1cell/100μl至96孔板的每一孔洞里，以進(jìn)行singlecolony培養(yǎng)。37℃培養(yǎng)一周后，使用顯微鏡檢查確認(rèn)只包含單一細(xì)胞colony的孔洞，接著將那些孔洞里的單一細(xì)胞colony轉(zhuǎn)移至24孔板里，培養(yǎng)3天以進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增。為篩選穩(wěn)定表達(dá)cho-rh7ha的細(xì)胞株且淘汰不表達(dá)cho-rh7ha的細(xì)胞株，先收集每一孔洞的mediumsample后再利用抗rh7ha抗體的western印跡法進(jìn)行分析。表達(dá)cho-rh7ha的細(xì)胞株會被篩選出，以進(jìn)行下一步獲得高cho-rh7ha產(chǎn)量的細(xì)胞株步驟。

c.經(jīng)由dhfr基因擴(kuò)增以獲得高cho-rh7ha產(chǎn)量的穩(wěn)定cho細(xì)胞株及純化cho-rh7ha

為增加cho-rh7ha的產(chǎn)量，上述每一細(xì)胞株會進(jìn)行dhfr基因擴(kuò)增，以放大rh7ha基因拷貝數(shù)(genecopynumber)。dhfr可將葉酸轉(zhuǎn)換為四氫葉酸，四氫葉酸參與鳥嘌呤核甘單磷酸(gmp)、單磷酸腺苷(amp)、脫氧單磷酸胸腺苷(dtmp)及甘氨酸(glycine)的合成，因此缺少dhfr的細(xì)胞必須培養(yǎng)于含有rns和drns的培養(yǎng)液里。之后，每個細(xì)胞株的培養(yǎng)液再置換為不含rns或drns但含有10％透析型胎牛血清(df)的mem-α培養(yǎng)液，如此一來，rh7ha表達(dá)質(zhì)粒里的dhfr基因即成為使細(xì)胞存活的必需基因。接著再加入dhfr抑制劑，氨甲基葉酸(methotrexate，mtx，sigma的產(chǎn)品)，rh7ha表達(dá)質(zhì)粒里的dhfr基因必須被放大并嵌入細(xì)胞染色體，使細(xì)胞發(fā)展為對mtx有抵抗力的細(xì)胞株。為獲得高rh7ha基因拷貝數(shù)的cho細(xì)胞株，mtx以階梯式地逐漸增加濃度(0.02μm、0.08μm、0.32μm、1μm)加入每一細(xì)胞株，若在1μmmtx條件下能存活的細(xì)胞株將被收集并利用抗rh7ha抗體的western印跡法進(jìn)行分析，確認(rèn)cho-rh7ha的表達(dá)。最終篩選出的細(xì)胞株命名為1b1，再接著進(jìn)行cho-rh7ha量產(chǎn)的培養(yǎng)。cho-rh7ha的純化是利用nickel-chelated親和力層析(tosoh)以pbs透析，并儲存于-20℃。cho-rh7ha的完整氨基酸序列如seqidno:1所示。

2.cho-rh7ha蛋白的分析

a.sds-page

請配合參閱圖2a。使用sds-page電泳(tris-glycinesds-polyacrylamidegelelectrophoresis)分析蛋白表達(dá)。將5％的焦集膠體(3.4ml的水+830μl的30％丙烯酰胺混合物、630μl的1mtris(ph6.8)、50μl的10％sds、50μl的10％過硫酸銨與5μl的temed)作為上層，12％的分離膠體(3.3ml的水+4ml的30％丙烯酰胺混合物、2.5ml的1mtris(ph8.8)、100μl的10％sds、100μl的10％過硫酸銨與10μl的temed)作為下層。樣本在150v的電壓下進(jìn)行電泳2小時。在電泳后，以0.25％考馬斯亮藍(lán)(coomassiebriliantbluer-250，sigma的產(chǎn)品)將sds-page膠體染色隔夜。接著，使用去染緩沖液(300ml的甲醇、100ml的醋酸與600ml的ddh2o)去除染劑。經(jīng)cho細(xì)胞株生產(chǎn)的rh7ha利用sds-page進(jìn)行定性，可見cho-rh7ha的分子量約在100kda附近。

b.western印跡法

請配合參閱圖2b。加入endoh(endoglycosidaseh)及pngasef(peptide-n-glycosidasef)以確認(rèn)cho-rh7ha糖蛋白的n-糖基(n-linkedglycans)特性。endoh用來裂解以甘露糖為尾端連接在氮上的糖基(mannose-terminatedn-glycans)；pngasef可去除所有的n-糖基。將1-2μg的蛋白與5μl含有dtt的追蹤染劑(loadingdye)混合，并以沸水加熱5分鐘。cho-rh7ha與denaturingbuffer以3：1混合，并以沸水加熱10分鐘。接著，樣本以endoh(newenglandbiolabs的產(chǎn)品)處理：將1μg加熱后的蛋白與1μl10x的denaturebuffer混合10分鐘，加入ddh2o使總體積為10μl，再加入2μl10x的g5buffer、1.5μl的endoh、6.5μl的ddh2o，總體積為20μl，于37℃下混合2小時；樣本以pngasef(newenglandbiolabs的產(chǎn)品)處理：將1μg加熱后的蛋白與1μl10x的denaturebuffer混合10分鐘，加入ddh2o使總體積為10μl，再加入2μl10x的g7buffer、2μl10％的np40buffer、1.5μl的pngasef、4.5μl的ddh2o，總體積為20μl，于37℃下混合2小時。使用sds-page電泳分析蛋白表達(dá)。樣本在150v的電壓下進(jìn)行電泳2小時。電泳后，將膠體以135v的電壓轉(zhuǎn)染至硝基纖維素(nitro-cellulose，nc)膜上，轉(zhuǎn)染過程為35分鐘。以5％的牛奶封阻nc膜2小時或隔夜。之后，加入利用tbstbuffer以1：5000比例稀釋的抗his共軛hrp抗體(genetex的產(chǎn)品)，反應(yīng)1小時。最后，進(jìn)行呈色。經(jīng)pngasef處理后，可明顯看出cho-rh7ha的分子量減少。

c.膠體過濾層析法

請配合參閱圖2c。先將hiload16/60superdex200pg的凝膠管柱(ge-healthcare的產(chǎn)品)以0.005mtrisbuffer和0.1mnacl(ph8)先進(jìn)行預(yù)平衡(pre-equilibrated)，再將1mg的蛋白利用前述設(shè)備進(jìn)行分析。沖提后的蛋白接著以aktaprimeplus系統(tǒng)(ge-healthcare的產(chǎn)品)在280nm條件下偵測。為識別此蛋白樣本的分子量，先利用ge-healthcare的蛋白分子樣本制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。膠體過濾層析分析結(jié)果顯示，cho-rh7ha主要由rh7ha的寡聚體(oligomer)組成，其次組成份為rh7ha的三聚體(trimer)和單體(monomer)。

d.糖基分析

請配合參閱圖3。純化后cho-rh7ha的糖基結(jié)構(gòu)依據(jù)royle(royleetal.,detailedstructuralanalysisofn-glycansreleasedfromglycoproteinsinsds-pagegelbandsusinghplccombinedwithexoglycosidasearraydigestions.methodsinmolecularbiology2006,347:125-143.)所提出的方法進(jìn)行分析。樣本先經(jīng)sds-page電泳分析及染色。膠體條帶(gelbands)切成1mm³的塊狀，保存于-20℃隔夜，以1：1的乙腈(acetonitrile)與20mm碳酸氫鈉(sodiumbicarbonate)溶液進(jìn)行清洗，再使用speedvac離心。使用pngasef裂解蛋白樣本中的糖基，于37℃下處理隔夜。之后再利用水中超音波震蕩將糖基自膠體移除，以dowex除去鹽分，再使用45μmfilter進(jìn)行過濾。接著使用speedvac將糖基離心下來，并以2-aminobenzamide(2-ab)標(biāo)記。將多余的2-ab移除后，樣本再利用hilic-hplc(x-bridgeamide3.5μm管柱)分離出獨(dú)立的糖基結(jié)構(gòu)。以jackbeanα-mannosidase(prozyme的產(chǎn)品)水解2-ab標(biāo)記的糖基，使用hilic-hplc再次分析以確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。利用2-ab標(biāo)記的葡萄聚糖標(biāo)準(zhǔn)梯度(dextranladderstandard)，以hilic-hplc的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為標(biāo)準(zhǔn)，推導(dǎo)出5級多項(xiàng)式(5^thorderpolynomial)，并將蛋白樣本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果套入此5級多項(xiàng)試算出gu值(glucoseunitvalues)，再制作gu值的波峰圖。將gu值對照nibrtglycobase數(shù)據(jù)庫后，即可知悉該gu值所對應(yīng)的糖基組成，并進(jìn)一步判斷分析蛋白質(zhì)的糖基組成。糖基分析的結(jié)果如圖3所示，呈現(xiàn)出cho-rh7ha的主要復(fù)合型式n-糖基(complextypen-linkedglycans)。

3.cho-rh7ha的免疫作用測定

a.pelc/cpg佐劑的制備

本發(fā)明所使用的藥學(xué)上可接受的佐劑pelc/cpg參照國家衛(wèi)生研究院(nationalhealthresearchinstitutes)黃明熙博士所研發(fā)的pelc(huangetal.,formulationandimmunologicalevaluationofnovelvaccinedeliverysystemsbasedonbioresorbablepoly(ethyleneglycol)-block-poly(lactide-co-ε-caprolactone).wileyinterscience2009,90b:832-841.)進(jìn)行改良，即在pbs中，加入10％pelc并搭配10μg免疫調(diào)節(jié)劑寡脫氧核苷酸(cpg)。

pelc是一復(fù)合相乳液佐劑(water-in-oil-in-wateremulsionadjuvant)，其組成成份與諾華(novartis)所開發(fā)的佐劑mf59類似，其主要差異在于pelc親水性乳化劑改良自fda已核可使用于人體且同時具有親疏水團(tuán)聯(lián)的生物可吸收式高分子(biodegradablepolymerpoly(ethyleneglycol)-block-poly(lactideco-ε-caprolactone，peg-b-placl)，以取代毒性相對較強(qiáng)的tween80。pelc親水端部份為水溶性聚乙二醇peg，疏水端部份則選用生物降解性材料聚乳酸己內(nèi)酯plc。pelc的組成成份包括核心油脂角鯊烯(squalene)及乳化劑(生物可吸收式高分子/疏水性賦形劑span85)，其制造程序?yàn)槿榛稚呻A段。

乳化劑的親疏水性質(zhì)，可以藉由所組成親水與疏水團(tuán)聯(lián)的分子量加以控制，乳化劑于進(jìn)入生物體內(nèi)之后將開始進(jìn)行水解，所產(chǎn)生的副產(chǎn)物乳酸和己醇酸都可以透過體內(nèi)的克氏循環(huán)(krebscycle)轉(zhuǎn)化成對人體無傷害性的二氧化碳和水，連同水解產(chǎn)物聚乙二醇一同排出體外。由此可知，佐劑的組成安全性較高，植入人體之后能由體內(nèi)所分解代謝，使用時較不會有疑慮。

b.小鼠免疫

免疫小鼠的方式有肌肉注射(intramuscularinjection)及鼻內(nèi)滴入(intranasalimmunization)兩種。請配合參閱圖4a-4d。由國家實(shí)驗(yàn)動物中心購買6-8周齡的balb/c小鼠。每組5只，免疫2次，以肌肉注射不同的cho-rh7ha疫苗組成份，溶于200μl的pbs，組成份包括：pbs、0.2μg和2μg不含佐劑的cho-rh7ha疫苗、300μg的alum佐劑、10μg的r848、10μg的cpg、50％的addavax、10μg的poly(i:c)或10％的pelc與10μg的cpg的混合液(pelc/cpg)。在第2次免疫后14天，收集血液樣本。在鼻內(nèi)滴入免疫方式中，也制備不同的cho-rh7ha疫苗組成份，每只小鼠給予總體積30μl，組成份包括：pbs、10μg不含佐劑的cho-rh7ha疫苗及10μg的cho-rh7ha疫苗并加入pelc/cpg。進(jìn)行每一次免疫前，小鼠皆以腹膜內(nèi)注射zoletil50(virbac的產(chǎn)品)使之麻醉，劑量為30mg/kg。之后，取15μl的疫苗滴入小鼠的鼻內(nèi)，共滴3次，每次間隔3周。在第3次免疫后2周，收集血清樣本。血清樣本先置于56℃下30分鐘進(jìn)行去活化，再儲存于-20℃，供后續(xù)分析使用。如圖4b-4d所示，經(jīng)接種cho-rh7ha疫苗各種組成份后，皆可于小鼠體內(nèi)誘發(fā)igg抗體。

c.cho-rh7ha特異性igg抗體效價

請配合參閱圖5a-5f。將2μg/ml純化的cho-rh7ha涂布于96孔板中隔夜后，利用elisablockingbuffer(pbs與1％bsa)封阻1小時，接著加入兩倍序列稀釋的血清樣本反應(yīng)1小時。每一孔洞再以pbst(pbs與0.05％tween-20)清洗。樣本再與抗小鼠igg共軛hrp(1：30000)、抗小鼠igg1共軛hrp(1：50000)或抗小鼠igg2a共軛hrp(1：50000)反應(yīng)1小時后，96孔板再以pbst清洗兩次。最后，加入tmb至樣本里，在黑暗中反應(yīng)15分鐘，再加入2nh2so4溶液中止elisa反應(yīng)。以分光亮度儀偵測od450nm數(shù)值。分析經(jīng)cho-rh7ha免疫的小鼠血清樣本，其結(jié)果顯示，可誘發(fā)cho-rh7ha特異性igg抗體(如圖4b-4d所示)、cho-rh7ha特異性igg1抗體(如圖5a-5c所示)及cho-rh7ha特異性igg2a抗體(如圖5d-5f所示)，亦即，在0.2μg、2μg和20μg劑量的cho-rh7ha與不同種類的佐劑免疫作用下，可誘發(fā)cho-rh7ha特異性b細(xì)胞免疫反應(yīng)及th1細(xì)胞和th2細(xì)胞的免疫反應(yīng)。

d.血球凝集抑制效應(yīng)分析(hemagglutinininhibitionassay)

請配合參閱圖6a-6c。血清樣本與受體破壞酵素(denkaseiken的產(chǎn)品)在37℃下作用隔夜，接著56℃作用30分鐘。血清樣本再進(jìn)行兩倍序列稀釋(從1：10開始)，并使其與含有4haunit的cho-rh7ha在室溫下作用30分鐘，再使其與0.5％火雞紅血球反應(yīng)，于室溫下作用30分鐘。以100％抑制凝集(完全不凝集)的血清樣本最大稀釋度為該血清的血球凝抑制效價，即hi效價。如圖6a-6c所示，經(jīng)cho-rh7ha免疫，血清樣本誘發(fā)出針對rh7ha的hi抗體。

e.中和試驗(yàn)(neutralizationassay)

請配合參閱圖6d-6f。首先將1.5x10⁴/well的mdck細(xì)胞接種于96孔板中。兩倍序列稀釋的血清樣本與相同體積的h7n9病毒(a/taiwan/01/2013；100tcid50/well)混合并于4℃反應(yīng)1小時，接著將血清/病毒混合物感染96孔板中的mdck細(xì)胞，在37℃下反應(yīng)4天。于第4天觀察細(xì)胞病變的狀態(tài)以決定感染力。如圖6d-6f所示，經(jīng)cho-rh7ha免疫，血清樣本誘發(fā)出對抗h7n9病毒的中和抗體。

綜合圖4b-4d、圖5a-5f及圖6a-6f所示，利用cho-rh7ha作為疫苗基礎(chǔ)，并加入pelc/cpg佐劑，相較于其他種類的佐劑，可誘發(fā)最高的抗體效價。根據(jù)上述數(shù)據(jù)顯示，cho-rh7ha具有制備成生物藥劑的潛力，cho-rh7ha加上pelc/cpg佐劑可進(jìn)一步制備為有效針對h7n9的疫苗。

f.活病毒試驗(yàn)(viruschallenges)

請配合參閱圖7a-7b。最終免疫(finalimmunizations)后3周，將小鼠麻醉，自其鼻內(nèi)施予50μl的10ld50h7n9病毒(a/taiwan/01/2013)。以pbs-immunized小鼠為對照組。觀察14天小鼠的存活率及體重下降的情況，體重下降＞25％即為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)(end-point)。如圖7a所示，經(jīng)cho-rh7ha加上pelc/cpg佐劑進(jìn)行免疫，可為小鼠提供100％對抗此活h7n9病毒的免疫保護(hù)。

依據(jù)上述各項(xiàng)實(shí)施例及圖式顯示，接種cho-rh7ha加上pelc/cpg佐劑，可誘發(fā)高cho-rh7ha特異性igg、hi及中和抗體，以對抗h7n9病毒，意謂cho-rh7ha加上pelc/cpg佐劑具有針對h7n9病毒制備出有效的疫苗的潛力。且亦可透過cho細(xì)胞株這平臺，大規(guī)模量產(chǎn)rh7ha，以作為疫苗生物藥劑的材料基礎(chǔ)。

g.統(tǒng)計分析

以上所有結(jié)果是利用one-wayanovas及tukey’stests(graphpadprismv5.03)分析，p＜0.05表示具有統(tǒng)計顯著差異。以上各項(xiàng)實(shí)施例皆至少執(zhí)行兩次。

以上所述的實(shí)施例僅是為說明本發(fā)明的技術(shù)思想及特點(diǎn)，其目的在使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，當(dāng)不能以之限定本發(fā)明的專利范圍，即大凡依本發(fā)明所揭示的精神所作的均等變化或修飾，仍應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。