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      不依賴介質(zhì)直接轉(zhuǎn)化外源DNA進入黑曲霉休眠孢子的方法與流程

      文檔序號:12457360閱讀:來源:國知局

      技術特征:

      1.不依賴介質(zhì)直接轉(zhuǎn)化外源DNA進入黑曲霉休眠孢子的方法,其特征在于:所述方法包括以下步驟:

      1)黑曲霉培養(yǎng)和孢子收集

      在固體瓊脂培養(yǎng)基表面接種黑曲霉,培養(yǎng)至培養(yǎng)基表面長滿黑曲霉孢子,洗下培養(yǎng)基表面的黑曲霉孢子,吸出孢子懸液并過濾去除菌絲,收集含有孢子的濾液,將濾液離心,收集沉淀的休眠孢子;

      2)黑曲霉孢子預處理

      用電擊緩沖液重懸孢子,離心并收集孢子沉淀,重復上述重懸和離心步驟3-4次后,將最后收集的孢子沉淀重懸于電擊緩沖液中,得到孢子濃度為104-1011個/ml的黑曲霉孢子懸液;

      所述電擊緩沖液由終濃度為0.01-100mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸和終濃度為0.5-5000mmol/L的甘露醇組成,電擊緩沖液的pH為3.0-9.5;

      3)使用HDEN法電擊黑曲霉孢子

      在細胞培養(yǎng)板的孔中加入上述步驟得到的黑曲霉孢子懸液以及待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒,混勻,得到孢子與質(zhì)?;旌衔?,將細胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10-15min,然后采用Etta Biotech X-Porator H1電轉(zhuǎn)儀進行HDEN法電擊,將帶有矩陣式電極的電擊頭插入孢子與質(zhì)粒混合物內(nèi)部,通電,使得孢子與質(zhì)?;旌衔飪?nèi)部產(chǎn)生電場,電擊之后再將細胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10-15min,然后將孢子和質(zhì)?;旌衔镂?,得到導入外源DNA的休眠的黑曲霉孢子;

      所述黑曲霉懸液與待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的比例為:6-600000μl的黑曲霉孢子懸液:0.1-10000μg的待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒;

      所述電擊參數(shù)如下:電壓1-6000V,脈寬2-2000000ms,重復1-100次,每次間隔5-50000ms。

      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不依賴介質(zhì)直接轉(zhuǎn)化外源DNA進入黑曲霉休眠孢子的方法,其特征在于:所述步驟1)的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基或察氏培養(yǎng)基。

      3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不依賴介質(zhì)直接轉(zhuǎn)化外源DNA進入黑曲霉休眠孢子的方法,其特征在于:所述步驟1,)黑曲霉的培養(yǎng)條件為:溫度16-40℃,濕度15-85%,培養(yǎng)3-15日。

      4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的不依賴介質(zhì)直接轉(zhuǎn)化外源DNA進入黑曲霉休眠孢子的方法,其特征在于:所述步驟1),黑曲霉的培養(yǎng)條件為:溫度30℃,濕度50-60%,培養(yǎng)5日。

      5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不依賴介質(zhì)直接轉(zhuǎn)化外源DNA進入黑曲霉休眠孢子的方法,其特征在于:所述步驟2),電擊緩沖液由終濃度為1mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸和終濃度為50mmol/L的甘露醇組成,電擊緩沖液的pH為7.0。

      6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不依賴介質(zhì)直接轉(zhuǎn)化外源DNA進入黑曲霉休眠孢子的方法,其特征在于:所述步驟2)的黑曲霉孢子懸液在電擊前,于顯微鏡下觀察,確認孢子懸液中無菌絲體混雜污染并且孢子均未萌發(fā),然后再進行電擊。

      7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不依賴介質(zhì)直接轉(zhuǎn)化外源DNA進入黑曲霉休眠孢子的方法,其特征在于:所述步驟3),待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒為重組質(zhì)粒AnEp8-hygro,所述重組質(zhì)粒AnEp8-hygro由潮霉素B抗性基因和AnEp8質(zhì)粒構(gòu)建而成。

      8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的不依賴介質(zhì)直接轉(zhuǎn)化外源DNA進入黑曲霉休眠孢子的方法,其特征在于:所述步驟3),黑曲霉懸液與重組質(zhì)粒AnEp8-hygro的比例為:60μl的黑曲霉孢子懸液:1μg的重組質(zhì)粒 AnEp8-hygro。

      9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不依賴介質(zhì)直接轉(zhuǎn)化外源DNA進入黑曲霉休眠孢子的方法,其特征在于: 所述步驟3),電擊參數(shù)如下:電壓400 V,脈寬2000ms,重復3次,每次間隔500ms 。

      10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的不依賴介質(zhì)直接轉(zhuǎn)化外源DNA進入黑曲霉休眠孢子的方法,其特征在于:所述步驟3),還包括如下處理:將孢子和質(zhì)?;旌衔镂?,涂布在含有終濃度為200μg/ml的潮霉素B的YPD固體瓊脂培養(yǎng)基平板上,于溫度16-40℃,濕度15-85%下培養(yǎng),直至形成單菌落,并進行菌落計數(shù)。

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