本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在葡枝根霉休眠孢子中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法。

背景技術(shù)：

分子生物學(xué)的中心法則是指遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再?gòu)腞NA傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過(guò)程。現(xiàn)代基因工程中，常常使用宿主來(lái)表達(dá)外源蛋白，常用的做法就是構(gòu)建質(zhì)粒載體，把外源蛋白的編碼DNA序列放在一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子后面，導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，編碼DNA序列被轉(zhuǎn)錄成mRNA序列(單鏈RNA)，mRNA序列又被細(xì)胞內(nèi)的翻譯機(jī)器表達(dá)成蛋白質(zhì)分子，完成外源蛋白表達(dá)的全過(guò)程。

DNA不論是作為游離于宿主基因組之外的質(zhì)粒，還是插入到宿主基因組之中，都可以穩(wěn)定地復(fù)制自身，并傳遞給子代。也就是說(shuō)，DNA的信息可以遺傳。同時(shí)，DNA可以源源不斷地轉(zhuǎn)錄出新生RNA，并翻譯成蛋白質(zhì)。

RNA由核糖核苷酸經(jīng)磷酸二酯鍵縮合而成長(zhǎng)鏈狀分子。一個(gè)核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和堿基構(gòu)成。RNA的堿基主要有4種，即A(腺嘌呤)、G(鳥嘌呤)、C(胞嘧啶)、U(尿嘧啶)。RNA作為單鏈分子，與雙鏈結(jié)構(gòu)的DNA相比，RNA很不穩(wěn)定，半衰期很短，而且在自然界，RNA酶廣泛存在，RNA非常容易被降解。RNA具有以下眾所周知的特征：游離在細(xì)胞質(zhì)的RNA不會(huì)遺傳；RNA半衰期很短，不能長(zhǎng)期存在；RNA不會(huì)插入到宿主的基因組DNA中。

由于半衰期短，因此，一個(gè)RNA分子存在于細(xì)胞內(nèi)的時(shí)長(zhǎng)，也很短暫，該RNA只能在這個(gè)短暫的時(shí)間內(nèi)，與核糖體相互作用，表達(dá)蛋白質(zhì)分子。而被表達(dá)出來(lái)的蛋白質(zhì)分子，也是有壽命的，一個(gè)蛋白質(zhì)分子在細(xì)胞內(nèi)存在多久，也可以用半衰期指標(biāo)來(lái)衡量。

在傳統(tǒng)的基因工程技術(shù)中，如果要在一個(gè)宿主細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)外源的蛋白質(zhì)，常用的做法是把蛋白質(zhì)的編碼基因構(gòu)建在DNA載體上，把DNA載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞內(nèi)部，DNA載體源源不斷地轉(zhuǎn)錄出編碼蛋白質(zhì)的RNA，RNA不斷翻譯出目的蛋白，實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)。

如果不借助DNA載體，在體外制備編碼蛋白的單鏈RNA分子，僅僅把編碼蛋白質(zhì)的外源單鏈RNA導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)部，只要細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有對(duì)應(yīng)的DNA源源不斷地轉(zhuǎn)錄出新的該RNA，那么，這個(gè)RNA與其所表達(dá)出的蛋白質(zhì)分子，只能在特定的時(shí)間窗口存在。換言之,這個(gè)RNA與其所表達(dá)出的蛋白質(zhì)分子，只能在細(xì)胞生命周期中的某一個(gè)時(shí)間段存在。

因此，這個(gè)特性有個(gè)很重要的作用，可以在特定的時(shí)間周期窗口，瞬時(shí)表達(dá)某個(gè)蛋白或者RNA，可以實(shí)現(xiàn)表達(dá)蛋白質(zhì)而不影響或者盡可能少影響細(xì)胞的正常生理周期和遺傳信息。比如：可以在細(xì)胞生命活動(dòng)的某個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，轉(zhuǎn)入外源RNA，表達(dá)某個(gè)細(xì)胞因子，調(diào)控細(xì)胞的生命周期；可以把TALENs、ZFNs和CRISPR/Cas9等Genome Editing的工具酶蛋白分子，用外源單鏈RNA在宿主細(xì)胞內(nèi)做表達(dá)，避免使用質(zhì)粒或其它DNA形式的載體時(shí)，將DNA序列引入細(xì)胞內(nèi)部，并造成潛在的外源DNA與宿主染色體相互作用(例如同源重組)，影響細(xì)胞的遺傳，等等。這個(gè)特性在基因工程領(lǐng)域，具有重要價(jià)值。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)有先例，可以把外源單鏈RNA直接轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。主要方法包括：1，使用諸如Lipo等試劑的化學(xué)法，Lipo等化學(xué)試劑可以與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生相互作用，把外源RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部。2，傳統(tǒng)的電轉(zhuǎn)化法，比如方波電擊，這是一種用電脈沖短暫作用于接觸外源RNA的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使外源RNA進(jìn)入細(xì)胞。

葡枝根霉是一種常見(jiàn)的霉菌，由土壤或空氣中都很容易分離得到，它可以用于生產(chǎn)果膠酶、內(nèi)切葡聚糖苷酶、脂肪酶、睪酮等一系列具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)物，是一種重要的工業(yè)發(fā)酵菌種。對(duì)其進(jìn)行科學(xué)研究和基因工程改造，都涉及到在其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)，但是在這種真菌未萌發(fā)孢子中表達(dá)蛋白質(zhì)非常困難。

真菌孢子是真菌的主要繁殖器官，孢子呈休眠狀態(tài)且可以生存很長(zhǎng)時(shí)間。孢子在適宜的外界條件下，能夠蘇醒并萌發(fā)，形成菌絲而進(jìn)行分裂繁殖。最為重要的是，很多類型真菌的孢子，是天然的單倍體，孢子是基因工程領(lǐng)域良好的起始生物材料。

但是，由于孢子一般處于休眠狀態(tài)，其細(xì)胞壁非常厚實(shí)，休眠孢子的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的狀態(tài)，與萌發(fā)孢子、與菌絲體是不同的。且休眠孢子細(xì)胞內(nèi)的生命活動(dòng)也處于最不旺盛的狀態(tài)，因此，本領(lǐng)域公知，休眠孢子的細(xì)胞通透性不如萌發(fā)孢子和菌絲，休眠孢子幾乎不與外界交流物質(zhì)，閉關(guān)鎖國(guó)，一般處于睡眠狀態(tài)。而萌發(fā)孢子或菌絲體，需要從外界吸收各種營(yíng)養(yǎng)分子供給生命活動(dòng)，因此細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性大于休眠孢子。所以，非常難以將外源RNA分子直接導(dǎo)入到睡眠孢子的內(nèi)部。目前也尚未有任何方法可以做到直接把外源RNA分子在無(wú)介質(zhì)介導(dǎo)的情況下，導(dǎo)入休眠的(未萌發(fā))真菌孢子內(nèi)部。這也是本行業(yè)內(nèi)一直沒(méi)有攻克的技術(shù)難題。

目前尚未有把外源單鏈RNA導(dǎo)入葡枝根霉細(xì)胞內(nèi)部的報(bào)道，更沒(méi)有把外源RNA導(dǎo)入葡枝根霉孢子(無(wú)論是萌發(fā)孢子，還是未萌發(fā)孢子)的報(bào)道。目前用基因工程技術(shù)在葡枝根霉細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的蛋白質(zhì)的方法，仍然需要借助DNA載體，且一般需要使用葡枝根霉成熟菌絲體的原生質(zhì)體作為宿主細(xì)胞，或者借助農(nóng)桿菌作為介質(zhì)，用DNA載體運(yùn)載基因信息進(jìn)入宿主細(xì)胞。

此外，編碼蛋白質(zhì)的外源RNA導(dǎo)入未萌發(fā)孢子內(nèi)部后，還需要與孢子內(nèi)部的蛋白翻譯因子等各種細(xì)胞因子、酶系相互作用，才能翻譯出蛋白質(zhì)分子。但是，眾所周知，睡眠孢子的生命活動(dòng)處于最不旺盛的狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)各種蛋白翻譯因子和酶系的活力是很低的，各種因子和酶系分子的數(shù)量也是很少的，即便外源RNA進(jìn)入了未萌發(fā)孢子內(nèi)部，也需要比較長(zhǎng)的相互作用時(shí)間，才能翻譯出目的蛋白。而時(shí)間長(zhǎng)，就意味著外源RNA在細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)源性RNA酶降解的概率加大，因此，就要求要有足夠多數(shù)量的外源RNA，可以進(jìn)入未萌發(fā)孢子內(nèi)部。

如何讓真菌的孢子萌發(fā)，本領(lǐng)域已經(jīng)有現(xiàn)成的技術(shù)方案，但是無(wú)論哪種萌發(fā)方法，都需要消耗時(shí)間、精力、人工操作、以及化學(xué)試劑。業(yè)內(nèi)已經(jīng)有用萌發(fā)的真菌孢子，導(dǎo)入外源DNA的案例，因此，按照本領(lǐng)域的基礎(chǔ)理論，一般認(rèn)為，用細(xì)胞通透性更強(qiáng)的萌發(fā)孢子導(dǎo)入外源分子(例如外源的RNA)的成功率更大，因?yàn)槊劝l(fā)的孢子已經(jīng)蘇醒，細(xì)胞內(nèi)各種因子和酶系已經(jīng)充分調(diào)動(dòng)和活躍起來(lái)了，細(xì)胞要吸收養(yǎng)分，細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交流活躍?？上У氖牵壳盀橹?，尚未有用孢子(無(wú)論是萌發(fā)還是未萌發(fā))導(dǎo)入外源編碼RNA的先例。但是，顯而易見(jiàn)，用未萌發(fā)的孢子來(lái)作為導(dǎo)入外源分子的起始材料，非常簡(jiǎn)便，因?yàn)榭梢允∪プ鲦咦用劝l(fā)這一復(fù)雜的步驟，更重要的是，萌發(fā)的孢子，可能已經(jīng)產(chǎn)生了多倍體，而未萌發(fā)的孢子，可以保證是單倍體，很多基因工程的應(yīng)用，要求宿主細(xì)胞必須是單倍體，才能達(dá)到預(yù)想的結(jié)果或者效率。因此本發(fā)明嘗試?yán)@過(guò)真菌孢子萌發(fā)這個(gè)步驟，直接用休眠的孢子，來(lái)導(dǎo)入外源RNA。

另外，眾所周知真菌能產(chǎn)生大量的RNA酶，并且能夠大量外分泌這些RNA酶，真菌是自然界RNA酶的主要來(lái)源之一。真菌孢子采集自菌體，采集真菌孢子時(shí)，孢子會(huì)攜帶有菌體分泌的大量的外源性RNA酶，而且很難在不殺滅孢子的情況下，把RNA酶徹底清洗干凈(如果使用DEPC等化合物來(lái)做徹底清洗，勢(shì)必會(huì)殺滅真菌孢子)。而且孢子自身也會(huì)產(chǎn)生和外分泌一些RNA酶。因此，使用外源單鏈RNA來(lái)轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞，非常困難，無(wú)異于雞蛋碰石頭，單鏈RNA還未接觸到真菌細(xì)胞就會(huì)被RNA酶降解了。

綜上所述，將編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，直接導(dǎo)入真菌(無(wú)論是菌絲體還是孢子，無(wú)論是萌發(fā)的孢子還是未萌發(fā)的孢子)內(nèi)部，是本行業(yè)內(nèi)一直沒(méi)有攻克的技術(shù)難題。

電擊轉(zhuǎn)化(Electroporation)是一種用電脈沖短暫作用于接觸了外源核酸的細(xì)胞，使外源核酸進(jìn)入細(xì)胞的方法。電擊轉(zhuǎn)化法又根據(jù)各自特點(diǎn)，有許多細(xì)分。已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道了用電擊法，遞送DNA進(jìn)入某些種類真菌的細(xì)胞。但是，DNA與編碼蛋白的單鏈RNA相比，在結(jié)構(gòu)上、在生物化學(xué)和分子生物學(xué)屬性上，均完全不同，它們與細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的相互作用方式也是不同的，因此讓它們通過(guò)真菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的機(jī)制，也是不同的。DNA分子與單鏈RNA相比，DNA半衰期長(zhǎng)，不容易被降解，非常穩(wěn)定。用于遞送DNA的方法，不能直接用于遞送單鏈RNA，目前也沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

2013年面世的HDEN電擊轉(zhuǎn)化技術(shù)，是一種專門針對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的特性，而開(kāi)發(fā)的電轉(zhuǎn)化技術(shù)，其開(kāi)發(fā)目的是為了提高向哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)傳送外源DNA和藥物的效率。該技術(shù)包含3大部分內(nèi)容，一是施加于細(xì)胞樣品的電波形式，二是細(xì)胞樣品在電擊時(shí)的溶液環(huán)境，三是細(xì)胞樣品的培養(yǎng)方法和電擊前預(yù)處理方法。由于該技術(shù)是專門針對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞開(kāi)發(fā)的，因此，上述3大部分內(nèi)容，都是針對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的特性而設(shè)計(jì)。

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道了HDEN技術(shù)在HEK-293A，Hela，Neuro-2A，MCF-7，C2C12，3T3-L1，CHO，MDCK，HL-60，HUVEC，A375，U251等哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，遞送DNA進(jìn)入細(xì)胞的應(yīng)用案例。目前尚未有該技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞以外的物種中應(yīng)用的案例報(bào)道。因此，HDEN電轉(zhuǎn)化技術(shù)能不能應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞以外的物種，也是一個(gè)未知數(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)背景技術(shù)現(xiàn)狀，提供一種在葡枝根霉休眠孢子中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法，該方法繞過(guò)真菌孢子萌發(fā)這個(gè)步驟，采用HDEN電轉(zhuǎn)化技術(shù)，將體外的單鏈編碼蛋白R(shí)NA遞送穿過(guò)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，在葡枝根霉休眠孢子內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種在葡枝根霉休眠孢子中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法，包括以下步驟：

1)葡枝根霉培養(yǎng)和孢子收集

在固體瓊脂培養(yǎng)基表面接種葡枝根霉，培養(yǎng)至培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿葡枝根霉孢子，洗下培養(yǎng)基表面的葡枝根霉孢子，吸出孢子懸液并過(guò)濾去除菌絲，收集含有孢子的濾液，將濾液離心，收集沉淀的休眠孢子；

2)葡枝根霉孢子預(yù)處理

用電擊緩沖液重懸孢子，離心并收集孢子沉淀，重復(fù)上述重懸和離心步驟3-4次后，將最后收集的孢子沉淀重懸于電擊緩沖液中，得到孢子濃度為10⁴—10¹¹個(gè)/ml的葡枝根霉孢子懸液；

所述電擊緩沖液由終濃度為0.01-100mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和終濃度為0.5-5000mmol/L的甘露醇組成，電擊緩沖液的pH為3.0-9.5；

3)使用HDEN法電擊葡枝根霉孢子

在細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中加入上述步驟得到的葡枝根霉孢子懸液以及待轉(zhuǎn)化RNA，混勻，得到孢子與RNA混合物，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10-15min，然后采用Etta Biotech X-Porator H1電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行HDEN法電擊，將帶有矩陣式電極的電擊頭插入孢子與RNA混合物內(nèi)部，通電，使得孢子與RNA混合物內(nèi)部產(chǎn)生電場(chǎng)，電擊之后再將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10-15min，然后將孢子和RNA混合物吸出，得到導(dǎo)入外源RNA的休眠的葡枝根霉孢子；

所述葡枝根霉懸液與待轉(zhuǎn)化RNA的比例為：0.6-60000μl的葡枝根霉孢子懸液：0.1-10000μg的待轉(zhuǎn)化RNA；

所述電擊參數(shù)如下：電壓1—6000V，脈寬2-2000000ms，重復(fù)1-100次，每次間隔5-50000ms。

進(jìn)一步，所述步驟1)的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基或察氏培養(yǎng)基，優(yōu)選為PDA培養(yǎng)基的效果最好，產(chǎn)孢子最快最多。

所述步驟1，)葡枝根霉的培養(yǎng)條件為：溫度16-40℃，濕度15-85％，培養(yǎng)3-15日。

優(yōu)選的，所述步驟1)，葡枝根霉的培養(yǎng)條件為：溫度28℃，濕度50-60％，培養(yǎng)6日。

進(jìn)一步，所述步驟2)，電擊緩沖液由終濃度為1-10mmol/L的HEPES和終濃度為50-100mmol/L的甘露醇組成，電擊緩沖液的pH為5.0-7.0；

優(yōu)選的，所述步驟2)，電擊緩沖液由終濃度為1mmol/L的HEPES和終濃度為50mmol/L的甘露醇組成，電擊緩沖液的pH為7.0。

所述步驟2)的葡枝根霉孢子懸液在電擊前，于顯微鏡下觀察，確認(rèn)孢子懸液中無(wú)菌絲體混雜污染并且孢子均未萌發(fā)，然后再進(jìn)行電擊。

進(jìn)一步，所述步驟3)，待轉(zhuǎn)化RNA為外源單鏈編碼蛋白質(zhì)的RNA，可以是綠色熒光蛋白的編碼RNA、紅色熒光蛋白的編碼RNA或黃色熒光蛋白的編碼RNA等等。

本發(fā)明擴(kuò)增綠色熒光蛋白基因或黃色熒光蛋白基因的PCR引物如下：

F：5'AGATGACGTCGCTAGCATGGTGAGCAAGGGC 3'；(SEQ ID NO.1)

R：5'ACGCGTCGACTTACTTGTACAGCTCGT3'；(SEQ ID NO.2)

其中，引物F中靠近5’端的GCTAGC序列，用于促進(jìn)該DNA轉(zhuǎn)錄成RNA后，翻譯起始因子與RNA結(jié)合，該序列與所表達(dá)的目的基因的起始密碼子ATG緊鄰。

本發(fā)明擴(kuò)增紅色熒光蛋白基因用的PCR引物如下：

上游引物：RFP-F:5'CGGAATTCGCCACCATGGCCTCCTCCGAGGACGT 3'；(SEQ ID NO.3)

下游引物：RFP-R:5'TCGAGCTCGTTAGGCGCCGGTGGAGTGG 3'；(SEQ ID NO.4)

其中，引物RFP-F中靠近5’端的GCCACC序列，用于促進(jìn)該DNA轉(zhuǎn)錄成RNA后，翻譯起始因子與RNA結(jié)合，該序列與所表達(dá)的目的基因的起始密碼子ATG緊鄰。

優(yōu)選的，所述步驟3)，葡枝根霉懸液與待轉(zhuǎn)化RNA的比例為：60μl的葡枝根霉孢子懸液：10μg的待轉(zhuǎn)化RNA。

進(jìn)一步，所述步驟3)，電壓300-1000V，脈寬1500-20000ms，重復(fù)1-50次，每次間隔500-5000ms；優(yōu)選為：電壓600V，脈寬2000ms，重復(fù)4次，每次間隔700ms。

本發(fā)明所述電擊采用Etta Biotech X-Porator H1電轉(zhuǎn)儀，購(gòu)買自蘇州壹達(dá)生物公司。

本發(fā)明收集未萌發(fā)的孢子，以及后續(xù)的電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，若無(wú)特殊說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)操作均在不高于23攝氏度的恒溫實(shí)驗(yàn)室中操作，離心步驟均為4℃冷凍離心，接觸未萌發(fā)孢子的各種液體均事先在冰上預(yù)冷。未萌發(fā)孢子嚴(yán)禁接觸到任何含有可促使其萌發(fā)的因素和物質(zhì)(比如以YEPD等為代表的萌發(fā)培養(yǎng)基)，以保證孢子的休眠狀態(tài)。

本發(fā)明葡枝根霉培養(yǎng)過(guò)程，當(dāng)葡枝根霉表面長(zhǎng)滿孢子后，向培養(yǎng)基表面倒入無(wú)菌水，洗下培養(yǎng)基表面的葡枝根霉孢子，用移液器吸出孢子懸液，使用滅菌過(guò)的擦鏡紙(或者砂芯漏斗、濾紙等)過(guò)濾，去除菌絲，保留孢子，如果沒(méi)有過(guò)濾步驟，那么孢子懸液中會(huì)混雜有菌絲，后續(xù)步驟得到的轉(zhuǎn)化子，無(wú)法判斷究竟是由孢子轉(zhuǎn)化DNA后形成的陽(yáng)性克隆，還是菌絲轉(zhuǎn)化DNA后形成的假陽(yáng)性。得到的孢子還要用染色體染色法對(duì)其染色體染色，并觀察和確認(rèn)孢子內(nèi)的染色體是單倍體狀態(tài)。

本發(fā)明制備固體瓊脂培養(yǎng)基的水應(yīng)該是MillQ級(jí)別的分子生物學(xué)用高純水或雙蒸水，水的電阻率不低于18.2MΩ-cm。

使用HDEN法電擊葡枝根霉孢子時(shí)，在細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中加入適當(dāng)比例的葡枝根霉孢子懸液以及待轉(zhuǎn)化RNA，混合勻勻，將容器置于冰上進(jìn)行冰浴。例如在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中(NUNC公司的Nunclon Surface 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，貨號(hào)Cat.No.167008)，加入60μl的葡枝根霉孢子懸液，以及不少于10μg的RNA。所述細(xì)胞培養(yǎng)板也可以是384孔板、24孔板、6孔板、或者其它更大、更小的容器，然后按照容器體積大小比例，放大或縮小孢子和RNA混合物體系。

本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，用未萌發(fā)的孢子來(lái)作為導(dǎo)入外源分子的起始材料，非常簡(jiǎn)便，因?yàn)榭梢允∪プ鲦咦用劝l(fā)這一復(fù)雜的步驟，更重要的是，萌發(fā)的孢子，可能已經(jīng)產(chǎn)生了多倍體，而未萌發(fā)的孢子，可以保證是單倍體，很多基因工程的應(yīng)用，要求宿主細(xì)胞必須是單倍體，才能達(dá)到預(yù)想的結(jié)果或者效率。同時(shí)，本發(fā)明應(yīng)用HDEN電轉(zhuǎn)化技術(shù)將外源RNA導(dǎo)入葡枝根霉休眠孢子。HDEN電轉(zhuǎn)化技術(shù)采用了高密度矩陣式電極，它能產(chǎn)生高度均勻且強(qiáng)度足夠的電場(chǎng)，電場(chǎng)內(nèi)每個(gè)細(xì)胞接受電擊的條件幾乎完全一致，操作時(shí)，只要把細(xì)胞放在通用容器中，比如細(xì)胞培養(yǎng)板，再把帶有矩陣式電極的電擊頭插入容器中，通電即可。而傳統(tǒng)的電轉(zhuǎn)技術(shù)一般是使用專用電擊杯，在兩塊平行放置的金屬板之間放置細(xì)胞，并對(duì)金屬板加電，形成電場(chǎng)電擊。因此，二者的放電方式完全不同，前者的電極插入細(xì)胞懸液內(nèi)部，在內(nèi)部產(chǎn)生電場(chǎng)，而后者是在細(xì)胞懸液整體的外部產(chǎn)生電場(chǎng)；前者的電極頭由許多金屬針組成，在針與針之間產(chǎn)生電壓，而后者只有兩塊金屬板，一塊正極，一塊負(fù)極，在二者之間產(chǎn)生電壓。HDEN技術(shù)還基本消除了傳統(tǒng)電擊技術(shù)的陰極效應(yīng)，避免產(chǎn)生大量氫氧根離子，避免殺傷細(xì)胞，提高電擊后的細(xì)胞存活率。而傳統(tǒng)電擊技術(shù)很難消除陰極效應(yīng)。本發(fā)明的HDEN法，電擊多次，可以疊加多次電擊的效果，并且不會(huì)大幅增加細(xì)胞死亡率，而傳統(tǒng)的電擊方法一般只電擊1次，因?yàn)閭鹘y(tǒng)電擊方法如果電擊多次，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡率大幅度增加。

HDEN電轉(zhuǎn)化技術(shù)是一種專門針對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的特性而開(kāi)發(fā)的電轉(zhuǎn)化技術(shù)，其開(kāi)發(fā)目的是為了提高向哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)傳送外源DNA和藥物的效率。而在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知，微生物細(xì)胞的特性和培養(yǎng)方法，與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比，千差萬(wàn)別。哺乳動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)不同，哺乳動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，微生物細(xì)胞(比如絕大部分真菌、包括葡枝根霉)有細(xì)胞壁。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞膜和微生物的細(xì)胞膜也不一樣。即便是同一種生物，它的不同組織、不同器官或不同的細(xì)胞類型，各自的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)、狀態(tài)、化學(xué)成分，也都不一樣。哪怕是同一種生物的同樣的組織、同樣的器官、同樣的細(xì)胞類型，在不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段，或者在不同的外界環(huán)境中，各自的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)、狀態(tài)、化學(xué)成分，也都不一樣。而細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，是阻擋外源分子進(jìn)入細(xì)胞的屏障，屏障不同(結(jié)構(gòu)不同，化學(xué)成分不同)，決定了突破屏障的方法也是不同的。此外，不同的外源分子，因?yàn)榫哂胁煌慕Y(jié)構(gòu)、分子量、體積和化學(xué)成分，面對(duì)相同的屏障時(shí)，不同外源分子突破屏障的方法也是不一樣的。如果面對(duì)不同的屏障，那么不同外源分子突破不同屏障的方法和機(jī)制，更是千差萬(wàn)別了。

因此，任何應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)，都很難直接應(yīng)用于微生物細(xì)胞。目前尚未有HDEN技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞以外的物種中應(yīng)用的案例報(bào)道。本發(fā)明針對(duì)葡枝根霉細(xì)胞的特性，采用HDEN技術(shù)將體外的單鏈編碼蛋白R(shí)NA導(dǎo)入葡枝根霉休眠孢子，該方法確定了細(xì)胞樣品的培養(yǎng)方法和電擊前預(yù)處理方法，細(xì)胞樣品在電擊時(shí)的溶液環(huán)境，以及施加于細(xì)胞樣品的電波形式。

此外，RNA翻譯成蛋白質(zhì)，需要有調(diào)控序列與與翻譯起始因子結(jié)合并介導(dǎo)蛋白翻譯的起始。什么樣的調(diào)控序列可以在真菌(例如本發(fā)明的葡枝根霉)細(xì)胞內(nèi)使用，是一個(gè)未知數(shù)，沒(méi)有任何文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)。本發(fā)明還披露了可以在葡枝根霉細(xì)胞內(nèi)使用的2種調(diào)控序列，見(jiàn)本發(fā)明實(shí)施例部分。

采用本發(fā)明方法，實(shí)現(xiàn)了歷史上首次將編碼蛋白質(zhì)的RNA直接導(dǎo)入葡枝根霉休眠孢子并表達(dá)蛋白質(zhì)，且步驟非常簡(jiǎn)便快速，另外，效果極佳，可以得到至少90％的轉(zhuǎn)化率。

附圖說(shuō)明

以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明：

圖1為實(shí)施例1轉(zhuǎn)錄出的RNA產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好的理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程的所有操作均要遵循微生物實(shí)驗(yàn)的無(wú)菌操作原則，器皿、耗材、試劑均要滅菌處理。

本發(fā)明所用的所有內(nèi)切酶均為Fermentas公司fastdigest系列限制性內(nèi)切酶產(chǎn)品，以下實(shí)施例用到的T4DNA ligase為Fermentas公司產(chǎn)品，酶切和連接及膠回收和DNA純化操作，均按照產(chǎn)品說(shuō)明書操作。

實(shí)施例1

在葡枝根霉細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)：

一、質(zhì)粒構(gòu)建

使用GFP基因編碼序列，GFP基因如SEQ ID NO.5所示，

上述GFP基因的蛋白序列如SEQ ID NO.6所示，

擴(kuò)增GFP基因用的PCR引物：

F：波浪線是Aat II酶切位點(diǎn)

R：波浪線是Sal I酶切位點(diǎn)

引物F中帶下劃線的GCTAGC序列，用于促進(jìn)該DNA轉(zhuǎn)錄成RNA后，翻譯起始因子與RNA結(jié)合，該序列與所表達(dá)的目的基因的起始密碼子ATG緊鄰。用上述這對(duì)引物做PCR后，可以讓GFP基因上游帶上GCTAGC，上下游均帶上酶切位點(diǎn)。

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物無(wú)誤后，使用Thermo GeneJET Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit回收純化PCR產(chǎn)物。

將上述PCR產(chǎn)物用Aat II和Sal I雙酶切，用T4DNA ligase將它連接在也經(jīng)過(guò)Aat II和Sal I雙酶切的Promega公司pGEM-T easy質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽(yáng)性克隆，用質(zhì)粒上的通用測(cè)序引物測(cè)序驗(yàn)證插入序列無(wú)誤后，大量提取重組質(zhì)粒。上述步驟正好可以讓該GFP基因位于該質(zhì)粒載體T7promoter的下游。

體外轉(zhuǎn)錄

用Fermentas公司的Fastdigest Nde1內(nèi)切酶對(duì)上述提取的重組質(zhì)粒做單酶切線性化。使用Thermo Scientific TranscriptAid T7High Yield Transcription Kit，對(duì)上述重組質(zhì)粒做體外轉(zhuǎn)錄，均按照說(shuō)明書操作。

轉(zhuǎn)錄出的RNA產(chǎn)物純化

1)在20μl轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入115μl的DEPC-H₂O和15μl的3M NaAc溶液(pH 5.2)，混勻；

2)加入等體積的酚氯仿異戊醇混合物(酚：氯仿：異戊醇＝25:24:1)，混勻；

3)高速離心，使液體上下分層，取上層水相至另一個(gè)1.5ml離心管。

4)在水相中加入2倍體積無(wú)水乙醇，置于-20℃至少30min，高速離心，沉淀RNA，去上清。

5)加入1ml預(yù)冷的70％乙醇，輕輕顛倒后高速離心1min；

6)將沉淀重懸于合適體積的DEPC-H₂O中，使RNA濃度不低于10μg/μL；

電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示：

泳道1：RiboRuler RNA Ladder，high range，ready-to-use；

泳道2：positive control，2222nt；

泳道3：體外轉(zhuǎn)錄出的GFP的RNA，～750nt

二、使用上述綠色熒光蛋白的編碼RNA在葡枝根霉休眠孢子中表達(dá)綠色熒光蛋白，步驟如下：

1)葡枝根霉培養(yǎng)和孢子收集

在15cm培養(yǎng)皿中，制備固體瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)，在固體瓊脂培養(yǎng)基表面接種葡枝根霉CICC 40325，溫度28℃，濕度50-60％，培養(yǎng)6日，讓培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿葡枝根霉孢子。

向培養(yǎng)基表面倒入無(wú)菌水，洗下(震蕩，或者用光滑的無(wú)菌玻璃涂布棒輕輕刮蹭)培養(yǎng)基表面的葡枝根霉孢子，用移液器吸出孢子懸液，使用滅菌過(guò)的擦鏡紙(或者砂芯漏斗、濾紙等)過(guò)濾，去除菌絲，保留孢子，濾過(guò)的液體裝入離心管，離心后，收集沉淀的休眠孢子，去除上清液體。得到的孢子還要用染色體染色法對(duì)其染色體染色，并觀察和確認(rèn)孢子內(nèi)的染色體是單倍體狀態(tài)。

2)葡枝根霉孢子預(yù)處理

用電擊緩沖液重懸孢子沉淀(加入電擊緩沖液的體積應(yīng)能填充滿離心管)，再離心，收集孢子沉淀，去除上清液體。重復(fù)上述步驟兩次后，再次將孢子重懸于電擊緩沖液中，顯微鏡觀察，確認(rèn)孢子懸液中無(wú)菌絲體混雜污染，以及確認(rèn)孢子均未萌發(fā)。最后一次將孢子重懸于電擊緩沖液時(shí)，應(yīng)控制好電擊緩沖液的體積，保持葡枝根霉孢子懸液中孢子濃度為10⁸個(gè)/ml。

所述電擊緩沖液由終濃度為1mmol/L的HEPES和終濃度為50mmol/L的甘露醇組成，電擊緩沖液的pH為7.0。

3)使用HDEN法電擊葡枝根霉孢子

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中加入60μl的葡枝根霉孢子懸液，及10μg綠色熒光蛋白的編碼RNA，混勻，得到孢子與RNA混合物，將容器置于冰上冰浴10min，然后采用Etta Biotech X-Porator H1電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行HDEN法電擊，將帶有矩陣式電極的電擊頭插入孢子與RNA混合物內(nèi)部，通電，使得孢子與RNA混合物內(nèi)部產(chǎn)生電場(chǎng)，電擊之后再將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10min，然后將孢子和RNA混合物吸出，得到導(dǎo)入外源RNA的休眠的葡枝根霉孢子；

本實(shí)施例電擊參數(shù)如下：電壓600V，脈寬2000ms，重復(fù)4次，每次間隔700ms。

4)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將上述吸出的孢子和RNA混合物，加入到100倍體積的YPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)20小時(shí)后，用激光共聚焦顯微鏡觀察。

在進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)步驟的同時(shí)，需要制備對(duì)照組：將未電擊的、相同的“孢子和RNA混合物”，加入到另一YPD培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)，然后用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

結(jié)果顯示：對(duì)照組的細(xì)胞無(wú)熒光，樣品組至少95％的細(xì)胞有綠色熒光，表明有成功的RNA轉(zhuǎn)化。

實(shí)施例2

在葡枝根霉細(xì)胞中表達(dá)紅色熒光蛋白(RFP)：

一、質(zhì)粒構(gòu)建

RFP的核酸序列如SEQ ID NO.7所示，

RFP的蛋白序列如SEQ ID NO.8所示，

擴(kuò)增RFP基因的引物如下：

上游引物：RFP-F:5'CGGAATTCGCCACCATGGCCTCCTCCGAGGACGT 3'

下游引物：RFP-R:5'TCGAGCTCGTTAGGCGCCGGTGGAGTGG 3'

上游引物5端帶有EcoR I酶切位點(diǎn)，帶下劃線的GCCACC序列，用于促進(jìn)該DNA轉(zhuǎn)錄成RNA后，翻譯起始因子與RNA結(jié)合，該序列與所表達(dá)的目的基因的起始密碼子ATG緊鄰。

下游引物5端帶有Sal I酶切位點(diǎn)。

按照實(shí)施例1的做法，把RFP基因通過(guò)PCR擴(kuò)增，做分子克隆，連接到pGEM-T easy載體上，再做體外轉(zhuǎn)錄，并將所得RNA轉(zhuǎn)化宿主孢子。

二、使用紅色熒光蛋白的編碼RNA在葡枝根霉休眠孢子中表達(dá)紅色熒光蛋白，步驟如下：

1)葡枝根霉培養(yǎng)和孢子收集

在15cm培養(yǎng)皿中，制備固體瓊脂培養(yǎng)基(YPD培養(yǎng)基)，在固體瓊脂培養(yǎng)基表面接種葡枝根霉CICC 40325，在溫度16℃，濕度15-50％下，培養(yǎng)15日，讓培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿葡枝根霉孢子。

向培養(yǎng)基表面倒入無(wú)菌水，洗下(震蕩，或者用光滑的無(wú)菌玻璃涂布棒輕輕刮蹭)培養(yǎng)基表面的葡枝根霉孢子，用移液器吸出孢子懸液，使用滅菌過(guò)的擦鏡紙(或者砂芯漏斗、濾紙等)過(guò)濾，去除菌絲，保留孢子，濾過(guò)的液體裝入離心管，離心后，收集沉淀的休眠孢子，去除上清液體。得到的孢子還要用染色體染色法對(duì)其染色體染色，并觀察和確認(rèn)孢子內(nèi)的染色體是單倍體狀態(tài)。

2)葡枝根霉孢子預(yù)處理

用電擊緩沖液重懸孢子沉淀(加入電擊緩沖液的體積應(yīng)能填充滿離心管)，再離心，收集孢子沉淀，去除上清液體。重復(fù)上述步驟兩次后，再次將孢子重懸于電擊緩沖液中，顯微鏡觀察，確認(rèn)孢子懸液中無(wú)菌絲體混雜污染，以及確認(rèn)孢子均未萌發(fā)。最后一次將孢子重懸于電擊緩沖液時(shí)，應(yīng)控制好電擊緩沖液的體積，保持葡枝根霉孢子懸液中孢子濃度為10¹¹個(gè)/ml。

所述電擊緩沖液由終濃度為0.01mmol/L的HEPES和終濃度為0.5mmol/L的甘露醇組成，電擊緩沖液的pH為3.0。

3)使用HDEN法電擊葡枝根霉孢子

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中加入0.6μl的葡枝根霉孢子懸液，及0.1μg紅色熒光蛋白的編碼RNA，混勻，得到孢子與RNA混合物，將容器置于冰上冰浴15min，然后采用Etta Biotech X-Porator H1電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行HDEN法電擊，將帶有矩陣式電極的電擊頭插入孢子與RNA混合物內(nèi)部，通電，使得孢子與RNA混合物內(nèi)部產(chǎn)生電場(chǎng)，電擊之后再將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴15min，然后將孢子和RNA混合物吸出，得到導(dǎo)入外源RNA的休眠的葡枝根霉孢子；

本實(shí)施例電擊參數(shù)如下：電壓1V，脈寬2000000ms，重復(fù)100次，每次間隔5ms。

4)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將上述吸出的孢子和RNA混合物，加入到10倍體積的YPD培養(yǎng)基中，10℃培養(yǎng)25小時(shí)后，用激光共聚焦顯微鏡觀察。

在進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)步驟的同時(shí)，需要制備對(duì)照組：將未電擊的、相同的“孢子和RNA混合物”，加入到另一YPD培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)，然后用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

結(jié)果顯示：對(duì)照組的細(xì)胞無(wú)熒光，樣品組至少90％以上的細(xì)胞有紅色熒光，表明有成功的RNA轉(zhuǎn)化。

實(shí)施例3

葡枝根霉細(xì)胞中表達(dá)黃色熒光蛋白(YFP)：

一、質(zhì)粒構(gòu)建

YFP的核酸序列如SEQ ID NO.9所示，

YFP的蛋白序列如SEQ ID NO.10所示，

采用與實(shí)施例1中GFP相同的引物，并按照同樣的實(shí)驗(yàn)步驟和方法把GFP基因通過(guò)PCR擴(kuò)增，做分子克隆，連接到pGEM-T easy載體上，再做體外轉(zhuǎn)錄，并將所得RNA轉(zhuǎn)化宿主孢子。

二、使用黃色熒光蛋白的編碼RNA在葡枝根霉休眠孢子中表達(dá)黃色熒光蛋白，步驟如下：

1)葡枝根霉培養(yǎng)和孢子收集

在15cm培養(yǎng)皿中，制備固體瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)，在固體瓊脂培養(yǎng)基表面接種葡枝根霉CICC 40325，在溫度40℃，濕度60-85％下，培養(yǎng)3日，讓培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿葡枝根霉孢子。

向培養(yǎng)基表面倒入無(wú)菌水，洗下(震蕩，或者用光滑的無(wú)菌玻璃涂布棒輕輕刮蹭)培養(yǎng)基表面的葡枝根霉孢子，用移液器吸出孢子懸液，使用滅菌過(guò)的擦鏡紙(或者砂芯漏斗、濾紙等)過(guò)濾，去除菌絲，保留孢子，濾過(guò)的液體裝入離心管，離心后，收集沉淀的休眠孢子，去除上清液體。得到的孢子還要用染色體染色法對(duì)其染色體染色，并觀察和確認(rèn)孢子內(nèi)的染色體是單倍體狀態(tài)。

2)葡枝根霉孢子預(yù)處理

用電擊緩沖液重懸孢子沉淀(加入電擊緩沖液的體積應(yīng)能填充滿離心管)，再離心，收集孢子沉淀，去除上清液體。重復(fù)上述步驟兩次后，再次將孢子重懸于電擊緩沖液中，顯微鏡觀察，確認(rèn)孢子懸液中無(wú)菌絲體混雜污染，以及確認(rèn)孢子均未萌發(fā)。最后一次將孢子重懸于電擊緩沖液時(shí)，應(yīng)控制好電擊緩沖液的體積，保持葡枝根霉孢子懸液中孢子濃度為10⁴個(gè)/ml。

所述電擊緩沖液由終濃度為100mmol/L的HEPES和終濃度為5000mmol/L的甘露醇組成，電擊緩沖液的pH為7.0。

3)使用HDEN法電擊葡枝根霉孢子

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中加入60000μl的葡枝根霉孢子懸液，及10000μg紅色熒光蛋白的編碼RNA，混勻，得到孢子與RNA混合物，將容器置于冰上冰浴10min，然后采用Etta Biotech X-Porator H1電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行HDEN法電擊，將帶有矩陣式電極的電擊頭插入孢子與RNA混合物內(nèi)部，通電，使得孢子與RNA混合物內(nèi)部產(chǎn)生電場(chǎng)，電擊之后再將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上冰浴10min，然后將孢子和質(zhì)粒混合物吸出，得到導(dǎo)入外源RNA的休眠的葡枝根霉孢子；

本實(shí)施例電擊參數(shù)如下：電壓6000V，脈寬2ms，重復(fù)1次，間隔50000ms。

4)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將上述吸出的孢子和RNA混合物，加入到10倍體積的YPD培養(yǎng)基中，40℃培養(yǎng)24小時(shí)后，用激光共聚焦顯微鏡觀察。

在進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)步驟的同時(shí)，需要制備對(duì)照組：將未電擊的、相同的“孢子和RNA混合物”，加入到另一YPD培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)，然后用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

結(jié)果顯示：對(duì)照組的細(xì)胞無(wú)熒光，樣品組至少90％以上的細(xì)胞有黃色熒光，表明有成功的RNA轉(zhuǎn)化。

實(shí)施例4

本實(shí)施例電擊參數(shù)為：電壓30V，脈寬1000000ms，電擊50次，間隔5000ms，其它同實(shí)施例1。

實(shí)施例5

本實(shí)施例電擊參數(shù)為：電壓3000V，脈寬100ms，電擊5次，間隔25000ms，其它同實(shí)施例1。

本發(fā)明所述的將編碼蛋白質(zhì)的線性RNA導(dǎo)入細(xì)胞、在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)，可以是該細(xì)胞、該物種自身就能編碼能表達(dá)的蛋白質(zhì)，也可以是其它生物物種來(lái)源的蛋白質(zhì)，或者是人工設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)。

所有的外源單鏈編碼蛋白質(zhì)的RNA，都可以用本發(fā)明的方法做轉(zhuǎn)化，不僅限于實(shí)施例所述綠色、紅色或黃色熒光蛋白的編碼RNA。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大學(xué)

<120> 一種在葡枝根霉休眠孢子中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法

<130> 1

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agatgacgtc gctagcatgg tgagcaaggg c 31

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acgcgtcgac ttacttgtac agctcgt 27

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggaattcgc caccatggcc tcctccgagg acgt 34

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcgagctcgt taggcgccgg tggagtgg 28

<210> 5

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 6

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 7

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggcctcct ccgaggacgt catcaaggag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 60

tccgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120

acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180

ctgtcccctc agttccagta cggctccaag gcctacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240

gactacttga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300

gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggcga gttcatctac 360

aaggtgaagc tgcgcggcac caacttcccc tccgacggcc ccgtaatgca gaagaagacc 420

atgggctggg aggcctccac cgagcggatg taccccgagg acggcgccct gaagggcgag 480

atcaagatga ggctgaagct gaaggacggc ggccactacg acgccgaggt caagaccacc 540

tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggcgcctaca agaccgacat caagctggac 600

atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt acgagcgcgc cgagggccgc 660

cactccaccg gcgcctaa 678

<210> 8

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Ala Ser Ser Glu Asp Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val

1 5 10 15

Arg Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val

35 40 45

Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln

50 55 60

Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro

65 70 75 80

Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val

85 90 95

Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser

100 105 110

Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn

115 120 125

Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu

130 135 140

Ala Ser Thr Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu

145 150 155 160

Ile Lys Met Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu

165 170 175

Val Lys Thr Thr Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala

180 185 190

Tyr Lys Thr Asp Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr

195 200 205

Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly

210 215 220

Ala

225

<210> 9

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccttcggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagct accagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtga 720

<210> 10

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

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65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235