本發(fā)明涉及真菌拮抗菌篩選領(lǐng)域，具體為一種真菌拮抗菌的快速篩選方法。

背景技術(shù)：

真菌大致分為植物病原真菌、動物致病真菌、環(huán)境污染真菌和食品污染真菌等幾類。對于動物致病真菌，該種真菌在動物體內(nèi)或體表滋生，在體外難以培養(yǎng)，因此對其拮抗菌的研究較少；而對于植物病原真菌、環(huán)境污染真菌和食品污染真菌，其生活環(huán)境相對開放，孢子可大量釋放于環(huán)境中，該類孢子便于收集，因此現(xiàn)實中研究植物病原真菌、環(huán)境污染真菌或食品污染真菌的拮抗菌的較多。

拮抗菌的篩選主要通過平板對峙培養(yǎng)法進(jìn)行篩選，該方法通過將真菌與待測菌分別放置在平板兩側(cè)，通過觀察是否形成抑菌帶從而判斷待測菌是否具有拮抗作用，該方法雖然操作簡單且便于觀察，但由于部分真菌的生長緩慢，因此該方法實驗周期較長，且該實驗過程受外界環(huán)境影響較大，從而制約著拮抗菌的篩選。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對以上不足之處，提供一種真菌拮抗菌的快速篩選方法，通過該方法快速測定待測菌對孢子的萌發(fā)率從而判斷待測菌是否為真菌的拮抗菌，該方法試驗周期短，能快速的篩選出真菌的拮抗菌，滿足了實驗要求。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：本發(fā)明包括以下步驟：

一、收集目標(biāo)真菌的孢子；

二、準(zhǔn)備至少三種培養(yǎng)液：待測菌培養(yǎng)液、對照菌培養(yǎng)液和LB細(xì)菌培養(yǎng)液；

三、配制步驟二中對應(yīng)數(shù)量的相同瓊脂：取瓊脂糖30-50mg置于50ml燒杯中，加入1ml水，100℃水浴加熱10min，使瓊脂融化，取下燒杯并冷卻至35℃；

四、制作步驟三中對應(yīng)數(shù)量的瓊脂基質(zhì)：往每杯將要凝結(jié)的瓊脂中以槍頭分別注射步驟二中準(zhǔn)備的培養(yǎng)液，并輕輕攪拌均勻，使培養(yǎng)液與瓊脂的體積比為2-10％，分別做成待測菌瓊脂基質(zhì)、對照菌瓊脂基質(zhì)和LB菌瓊脂基質(zhì)，所述每種瓊脂基質(zhì)中培養(yǎng)液與瓊脂的體積比相同；

五、分別將步驟四中的每種瓊脂基質(zhì)平鋪于相應(yīng)的載玻片上，厚度約1-2mm，待其凝結(jié)，每種瓊脂基質(zhì)在載玻片上的尺寸相同；

六、制作步驟五中相應(yīng)數(shù)量的孢子平板：在凝結(jié)后的每一瓊脂基質(zhì)上噴灑少量無菌水，并分別加入等量的步驟一中收集的目標(biāo)真菌的孢子，使其粘附于相應(yīng)的瓊脂基質(zhì)上，分別形成待測菌孢子平板、對照菌孢子平板和LB菌孢子平板；

七、將步驟六中每個孢子平板分別置于底部有浸濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，加蓋保濕相同時間；

八、將步驟七中各個培養(yǎng)皿再置于27-30℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)保濕培養(yǎng)；

九、分別于培養(yǎng)后6h、12h、24h，觀察、計數(shù)各個培養(yǎng)皿上的孢子的萌發(fā)率。

由于大部分真菌均通過孢子進(jìn)行傳播，而孢子的萌發(fā)是真菌是否能生長、定殖、入侵的先決條件，因此通過本方法計算真菌孢子的萌發(fā)率從而判斷待測菌對真菌是否具有抑制作用，最后根據(jù)孢子萌發(fā)率的大小來判斷待測菌是否為目標(biāo)真菌的結(jié)抗菌，該方法不像對峙培養(yǎng)法那樣需要等待目標(biāo)真菌生長完整，節(jié)約了試驗時間，大大縮短了真菌拮抗菌的篩選時間。

本發(fā)明設(shè)計了，所述待測菌為家蠅體內(nèi)分離的銅綠色假單胞菌，所述對照菌為大腸桿菌，所述孢子為禾谷鐮刀菌孢子。

附圖說明

圖1所示為實驗結(jié)果示意圖。

具體實施方式

禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum是一種植物的根部致病菌，可引起穗腐、莖腐、莖基腐和根腐病等病害，是一種重要的植物病原真菌；以下3個實施例均以禾谷鐮刀菌孢子為研究對象，以家蠅體內(nèi)分離的銅綠色假單胞菌為待測菌，以大腸桿菌為對照菌，以LB細(xì)菌為空白參照。

實施例1：

本發(fā)明包括以下步驟：

一、收集禾谷鐮刀菌孢子；

二、準(zhǔn)備三種培養(yǎng)液：待測菌培養(yǎng)液、對照菌培養(yǎng)液和LB細(xì)菌培養(yǎng)液；

三、配制三杯相同瓊脂：取瓊脂糖30mg置于50ml燒杯中，加入1ml水，100℃水浴加熱10min，使瓊脂融化，取下燒杯并冷卻至35℃；

四、制作三種瓊脂基質(zhì)：往每杯將要凝結(jié)的瓊脂中以槍頭分別注射步驟二中準(zhǔn)備的培養(yǎng)液，并輕輕攪拌均勻，使培養(yǎng)液與瓊脂的體積比為2％，分別做成待測菌瓊脂基質(zhì)、對照菌瓊脂基質(zhì)和LB菌瓊脂基質(zhì)，所述三種瓊脂基質(zhì)中培養(yǎng)液與瓊脂的體積比相同；

五、分別將步驟四中的三種瓊脂基質(zhì)平鋪于三個載玻片上，厚度約1mm，待其凝結(jié)，三種瓊脂基質(zhì)在載玻片上的尺寸相同；

六、制作三種孢子平板：在凝結(jié)后的每一瓊脂基質(zhì)上噴灑少量無菌水，并分別加入等量的步驟一中收集的目標(biāo)真菌的孢子，使其粘附于相應(yīng)的瓊脂基質(zhì)上，分別形成待測菌孢子平板、對照菌孢子平板和LB菌孢子平板；

七、將步驟六中三個孢子平板分別置于底部有浸濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，加蓋保濕相同時間；

八、將步驟七中各個培養(yǎng)皿再置于27℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)保濕培養(yǎng)；

九、培養(yǎng)后6h，觀察、計數(shù)各個培養(yǎng)皿上的孢子的萌發(fā)率。

結(jié)果表明：禾谷鐮刀菌孢子在以銅綠色假單胞菌為瓊脂基質(zhì)的孢子萌發(fā)率約為28％；以大腸桿菌為瓊脂基質(zhì)的孢子萌發(fā)率約為84％；以LB菌為瓊脂基質(zhì)的孢子萌發(fā)率約為85％；通過三個數(shù)據(jù)對比，可以明顯的看出銅綠色假單胞菌對禾谷鐮刀菌孢子的萌發(fā)具有顯著的抑制作用。

實施例2：

本發(fā)明包括以下步驟：

一、收集禾谷鐮刀菌孢子；

二、準(zhǔn)備三種培養(yǎng)液：待測菌培養(yǎng)液、對照菌培養(yǎng)液和LB細(xì)菌培養(yǎng)液；

三、配制三杯相同瓊脂：取瓊脂糖40mg置于50ml燒杯中，加入1ml水，100℃水浴加熱10min，使瓊脂融化，取下燒杯并冷卻至35℃；

四、制作三種瓊脂基質(zhì)：往每杯將要凝結(jié)的瓊脂中以槍頭分別注射步驟二中準(zhǔn)備的培養(yǎng)液，并輕輕攪拌均勻，使培養(yǎng)液與瓊脂的體積比為6％，分別做成待測菌瓊脂基質(zhì)、對照菌瓊脂基質(zhì)和LB菌瓊脂基質(zhì)，所述三種瓊脂基質(zhì)中培養(yǎng)液與瓊脂的體積比相同；

五、分別將步驟四中的三種瓊脂基質(zhì)平鋪于三個載玻片上，厚度約1.5mm，待其凝結(jié)，三種瓊脂基質(zhì)在載玻片上的尺寸相同；

六、制作三種孢子平板：在凝結(jié)后的每一瓊脂基質(zhì)上噴灑少量無菌水，并分別加入等量的步驟一中收集的目標(biāo)真菌的孢子，使其粘附于相應(yīng)的瓊脂基質(zhì)上，分別形成待測菌孢子平板、對照菌孢子平板和LB菌孢子平板；

七、將步驟六中三個孢子平板分別置于底部有浸濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，加蓋保濕相同時間；

八、將步驟七中各個培養(yǎng)皿再置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)保濕培養(yǎng)；

九、分別于培養(yǎng)后12h，觀察、計數(shù)各個培養(yǎng)皿上的孢子的萌發(fā)率。

結(jié)果表明：禾谷鐮刀菌孢子在以銅綠色假單胞菌為瓊脂基質(zhì)的孢子萌發(fā)率約為6％；以大腸桿菌為瓊脂基質(zhì)的孢子萌發(fā)率約為86％；以LB菌為瓊脂基質(zhì)的孢子萌發(fā)率約為87％；通過三個數(shù)據(jù)對比，可以明顯的看出銅綠色假單胞菌對禾谷鐮刀菌孢子的萌發(fā)具有顯著的抑制作用。

實施例3：

本發(fā)明包括以下步驟：

一、收集禾谷鐮刀菌孢子；

二、準(zhǔn)備三種培養(yǎng)液：待測菌培養(yǎng)液、對照菌培養(yǎng)液和LB細(xì)菌培養(yǎng)液；

三、配制三杯相同瓊脂：取瓊脂糖50mg置于50ml燒杯中，加入1ml水，100℃水浴加熱10min，使瓊脂融化，取下燒杯并冷卻至35℃；

四、制作三種瓊脂基質(zhì)：往每杯將要凝結(jié)的瓊脂中以槍頭分別注射步驟二中準(zhǔn)備的培養(yǎng)液，并輕輕攪拌均勻，使培養(yǎng)液與瓊脂的體積比為10％，分別做成待測菌瓊脂基質(zhì)、對照菌瓊脂基質(zhì)和LB菌瓊脂基質(zhì)，所述三種瓊脂基質(zhì)中培養(yǎng)液與瓊脂的體積比相同；

五、分別將步驟四中的三種瓊脂基質(zhì)平鋪于三個載玻片上，厚度約2mm，待其凝結(jié)，三種瓊脂基質(zhì)在載玻片上的尺寸相同；

六、制作三種孢子平板：在凝結(jié)后的每一瓊脂基質(zhì)上噴灑少量無菌水，并分別加入等量的步驟一中收集的目標(biāo)真菌的孢子，使其粘附于相應(yīng)的瓊脂基質(zhì)上，分別形成待測菌孢子平板、對照菌孢子平板和LB菌孢子平板；

七、將步驟六中三個孢子平板分別置于底部有浸濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，加蓋保濕相同時間；

八、將步驟七中各個培養(yǎng)皿再置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)保濕培養(yǎng)；

九、分別于培養(yǎng)后24h，觀察、計數(shù)各個培養(yǎng)皿上的孢子的萌發(fā)率。

結(jié)果表明：禾谷鐮刀菌孢子在以銅綠色假單胞菌為瓊脂基質(zhì)的孢子萌發(fā)率約為7％；以大腸桿菌為瓊脂基質(zhì)的孢子萌發(fā)率約為83％；以LB菌為瓊脂基質(zhì)的孢子萌發(fā)率約為84％；通過三個數(shù)據(jù)對比，可以明顯的看出銅綠色假單胞菌對禾谷鐮刀菌孢子的萌發(fā)具有顯著的抑制作用。

從上述三個實施例的實驗數(shù)據(jù)可以看出，禾谷鐮刀菌孢子在以銅綠色假單胞菌為瓊脂基質(zhì)的孢子萌發(fā)率很低，可以得出銅綠色假單胞菌就是禾谷鐮刀菌的拮抗菌，如圖1所示：其中銅綠色假單胞菌a、禾谷鐮刀菌b、對照c；上述實施例中的對照菌只取了一種，為了能更快速的找到拮抗菌，可以增加對照菌的種類，那么從步驟二就開始準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量與種類的培養(yǎng)液，由此可以看出該方法能大范圍、一致性對比，不用像以往那樣單獨、逐一進(jìn)行對比，大大縮短了實驗周期，在農(nóng)業(yè)、環(huán)保、食品等行業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景。