本發(fā)明屬于化學合成、分析化學和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種分子印跡固相萃取膜的制備和應用，具體是一種基于替代模板分子高選擇性孔雀石綠分子印跡膜的制備方法，及所制備膜適用于選擇性分離、萃取和富集水樣、動物源性組織中痕量孔雀石綠及其類似物隱性孔雀石綠。

背景技術(shù)：

在一個完整的樣品分析過程中，前處理時間占用了70％-80％，而分析結(jié)果的誤差有60％以上來源于樣品的前處理步驟。分子印跡技術(shù)的出現(xiàn)改善了傳統(tǒng)固相萃取技術(shù)選擇性差的缺點，是一種基于其本身的特異“孔穴”對某類具有特定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)的專一、精準識別作用的前處理技術(shù)，具有快速高效、抗基質(zhì)干擾強、耐酸耐堿、機械強度高、選擇性好等優(yōu)點，可實現(xiàn)復雜樣品中痕量甚至超痕量目標物的分離和富集。目前基于分子印跡聚合物的樣品前處理受到分析、環(huán)境、醫(yī)藥等領(lǐng)域的關(guān)注，但是存在以下幾個技術(shù)瓶頸仍有待解決：

(1)分子印跡技術(shù)通常采用目標物本身作為模板分子，難以獲得完全除去模板分子的印跡聚合物，存在洗脫和泄漏的不確定性導致檢測“假陽性”的風險。

(2)分子印跡聚合物的通透性差、傳質(zhì)速度慢，對目標物的吸附平衡時間長、洗脫條件要求高的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有前處理技術(shù)的上述不足，提出以一種三苯甲烷類分子作為孔雀石綠的替代模板分子制備分子印跡膜，以解決分子印跡聚合物制備中模板分子價格高和使用中模板分子泄露等問題，同時仍保持了分子印跡的識別能力。現(xiàn)有的分子印跡材料存在印跡位點“包埋”過深，目標分子在分子印跡聚合物上吸附慢、效率低的問題，以具有疏松、多孔、快速滲濾作用的玻璃纖維膜作為底材來制備分子印跡聚合物膜，解決了萃取效率低和萃取容量較小的問題。采用替代模板分子制備的分子印跡聚合物對動物源食品進行處理提取和凈化處理，大大縮短了每個樣品前處理的萃取前處理時間，特異性識別減少了樣品基質(zhì)的影響，使實驗操作簡單、快捷，同時具有操作準確、靈敏度高及重復性好等優(yōu)點。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種三苯甲烷類分子替代孔雀石綠的分子印跡固相萃取膜的制備方法，該方法采用三苯甲烷類物質(zhì)作為模板分子，采用玻璃纖維膜作為底材。具體而言，該方法包括如下步驟：

(1)將三苯甲烷類物質(zhì)、有機單體、有機交聯(lián)劑、有機溶劑、偶氮引發(fā)劑進行超聲混溶處理，得到混合有機溶液；

(2)將所述混合有機溶液置于4℃冰箱靜置6h進行預聚合，預聚合過程完成后取出所述預聚合溶液，通入氮氣數(shù)分鐘后，將所述混合有機溶液倒入反應模具中，同時加入與模具尺寸匹配的底材，通過控制加液量的多少可以獲得不同厚度的夾心結(jié)構(gòu)聚合物膜；

(3)向反應器中通入氮氣，一段時間后，密封反應器，并加熱至50-70℃進行聚合反應，待所述聚合反應結(jié)束后，對得到的分子印跡膜洗滌和除去三苯甲烷類替代模版分子，獲得對孔雀石綠及其類似物隱性孔雀石綠有選擇吸附作用的分子印跡聚合物膜。

在本發(fā)明一個具體的實施方式中，所述底材為玻璃纖維膜或者玻璃纖維氈。

在本發(fā)明一個具體的實施方式中，所述三苯甲烷類物質(zhì)選自選自三苯甲烷，烷基取代的三苯甲烷，堿性綠，酚酞，玫紅，胭脂紅等；其中烷基為C₁-C₆的烷基。

在本發(fā)明一個具體的實施方式中，上述步驟(1)中，有機單體能與模板分子三苯甲烷類分子形成穩(wěn)定的氫鍵、靜電作用、π-π共軛等非共價鍵作用，從而提高分子印跡聚合物膜的特異吸附性。該有機單體選自甲基丙烯酸、三氟甲基丙烯酸、丙烯酰胺、4-乙烯基苯甲酸、2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸中的一種或多種。

該有機單體的加入的量與模板分子三苯甲烷類分子的摩爾比為(2-6)：1；在具體實施例中，該有機單體與模板分子三苯甲烷類分子的摩爾比為2：1、3：1、4：1、5：1、6：1等。該比例的有機單體能夠減少分子印跡聚合物的非特異吸附性，并增加其表面印跡位點的穩(wěn)定性，從而提高分子印跡膜的選擇性吸附能力。

在本發(fā)明一個具體的實施方式中，上述步驟(1)中有機交聯(lián)劑能使得模板分子-有機單體復合物在聚合反應過程中交聯(lián)，形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)。在具體的實施例中，該有機交聯(lián)劑選自二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、三甲基丙烷三甲基丙烯酸酯中的一種或多種。

該有機交聯(lián)劑的加入的量與有機單體的摩爾比為(3-8)：1；在具體實施例中，該有機交聯(lián)劑與有機單體的摩爾比為3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8:1等。該比例的有機交聯(lián)劑能夠使得分子印跡膜的交聯(lián)度高、理化性質(zhì)穩(wěn)定、機械強度高，減少分子印跡聚合物的非特異吸附性，從而提高分子印跡膜的選擇性吸附能力、萃取容量和富集倍數(shù)。

在本發(fā)明一個具體的實施方式中，上述步驟(1)中有機溶劑能完全溶解聚合體系中的物質(zhì)，且不影響模板分子-有機單體復合物的非共價鍵作用，同時使得分子印跡膜存在適合的孔隙，從而增大其傳質(zhì)速率、分子識別速率和萃取容量。在具體實施例中，該有機溶劑選自甲苯、氯仿、乙腈、二甲基亞砜的一種多種。

在本發(fā)明一個具體的實施方式中，上述偶氮引發(fā)劑能在50-70℃下只形成一種自由基，且分解均勻，為一級反應，不發(fā)生誘導分解，無其他副反應，從而不影響模板-有機單體復合物間的非共價鍵作用，且使得模板-有機單體復合物間進行的聚合反應穩(wěn)定，反應條件較易控制。而且在聚合反應過程中，該偶氮類引發(fā)劑對溶劑和雜質(zhì)不敏感。在具體實施例中，該偶氮引發(fā)劑選自偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈和偶氮二異丁酸二甲酯中的一種或多種。

上述關(guān)于偶氮引發(fā)劑的各實施例中，其用量可以是足量。在另一實施例中，該偶氮引發(fā)劑的添加量與模板分子三苯甲烷類化合物質(zhì)量比為(6-8)：1。在具體實施例中，偶氮引發(fā)劑與模板分子三苯甲烷類化合物的質(zhì)量比為6：1、6.5：1、7：1、7.5：1、8：1等。

為了使得該步驟(1)各反應物充分的混合和溶解，在本發(fā)明具體的實施例中，將各反應物混合后，可以將混合液采用超聲處理，具體的可以采用超聲助溶5-30分鐘。

上述步驟(2)中，在4℃冰箱靜置6h，是為步驟(1)中配制的混合有機溶液提供一個低溫且靜態(tài)的環(huán)境，使得模板分子與有機單體能形成穩(wěn)定的非共價鍵作用，從而提高分子印跡膜的選擇性。

上述向混合有機溶液中通入氮氣是為了除去步驟(1)中配制的混合有機溶液中的氧氣，保證反應順利發(fā)生。

上述向混合有機溶液中投入的玻璃纖維膜，作為表面印跡聚合物的載體，其類型可以選用親水型玻璃纖維膜或疏水型玻璃纖維膜。

上述選用的模具需要經(jīng)過表面處理，使得合成的分子印記聚合物不會發(fā)生粘璧現(xiàn)象。具體的，表面處理方式可以采用化學法，也可以直接在載玻片進行惰性處理。

上述步驟(3)中，向反應器中通入氮氣并將其密封，是為了給聚合反應提供一個無氧的環(huán)境，保證反應順利發(fā)生。

上述將混合有機溶液加熱至50-70℃并保持該溫度直至混合有機溶液反應完畢。在該50-70℃下，模板分子-有機單體復合物在交聯(lián)劑、偶氮引發(fā)劑等作用下發(fā)生聚合反應。在一實施例中，該聚合反應的溫度為60℃。

上述聚合反應的時間應該保證聚合反應充分反應直至反應完畢。在一實施例中，反應時間可以控制在6-12h，在具體實施例中，該聚合反應在60℃下持續(xù)反應8h。

上述聚合反應完畢后，對所述分子印跡膜進行洗滌，以除去其表面未參與反應的物質(zhì)以及其他雜質(zhì)等。洗滌方式可以采用超純水、甲醇(色譜純)進行反復清洗，在洗滌過程中可以采用往復式振蕩器和超聲中的一種或兩種相結(jié)合。

上述洗脫模板分子三苯甲烷類分子時，洗脫方式采用甲醇/乙酸、甲醇/氨水、甲醇進行反復清洗，在洗脫過程中可以采用往復式振蕩器和超聲中的一種或兩種相結(jié)合

與傳統(tǒng)的分子印跡聚合物合成技術(shù)相比，上述分子印跡膜制備方法以類似化合物作為替代模板分子，采用偶氮類引發(fā)劑在固定溫度下發(fā)生聚合反應，聚合反應條件簡單，反應穩(wěn)定、易于控制，無副反應產(chǎn)物產(chǎn)生且成本較低。而且，制備的分子印跡聚合物膜理化性質(zhì)穩(wěn)定，對孔雀石綠和隱性孔雀石綠具有較強的特異吸附性，平衡時間短、萃取過程簡單、萃取容量大、傳質(zhì)速率快且富集倍數(shù)高，適用于復雜樣品中痕量濃度的孔雀石綠和隱性孔雀石綠的快速分離、萃取和富集。為實驗室常用的儀器法(如液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀等)聯(lián)用，還可以與快速檢測法(如酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫法和快速檢測試劑盒法等)聯(lián)用，提高結(jié)果的準確度，滿足現(xiàn)場檢測和快速篩查的需求，可望解決目前分析領(lǐng)域中樣品前處理技術(shù)的瓶頸，具有良好的應用前景。

附圖說明

下面將結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明，附圖中：

圖1三苯甲烷類化合物為替代模板分子的分子印跡膜原理示意圖；

圖2分子印跡聚合物制備流程示意圖；

圖3分子印跡聚合膜萃取洗脫過程-洗脫過程示意圖；

圖4非分子印跡聚合膜的10000倍掃描電鏡SEM圖；

圖5分子印跡聚合膜的10000倍掃描電鏡SEM圖；

圖6分子印跡膜(MIP)與非分子印跡膜(NIP)萃取孔雀石綠和隱性孔雀石綠萃取量示意圖；

具體實施方式

實施例1：分子印跡固相萃取膜(MIP)的制備及應用

S01：配置含有三苯甲烷、4-乙烯基苯甲酸、交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮引發(fā)劑偶氮二異丁腈的混合有機溶液：將三苯甲烷1mol、4-乙烯基苯甲酸2mol、交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯6mol、有機溶劑甲苯適量、偶氮引發(fā)劑偶氮二異丁腈6mol進行超聲混溶處理30min，得到混合溶液；

S02：將所述混合有機溶液置于4℃冰箱靜置6h進行預聚，預聚完成后取出所述混合有機溶液，通入氮氣數(shù)分鐘后，將所述混合有機溶液倒入反應模具中，同時加入與模具尺寸匹配的玻璃纖維膜，通過控制加液量的多少可以獲得不同厚度的聚合物膜；

S03：向反應器中通入氮氣，一段時間后，密封反應器，并加熱至60℃進行聚合反應8h，待所述聚合反應結(jié)束后，取下載玻片，對所述分子印跡膜進行洗滌和除去三苯甲烷類替代模版分子獲得孔雀石綠分子印跡膜。

S04：分子印跡聚合物膜的應用，取5g標準魚樣品(其中孔雀石綠的含量0.2ng/g)，加入1.4ml 0.1M乙酸鈉(ph4.8)和0.6ml 1M對甲苯磺酸，渦旋30s加入10ml乙腈，渦旋(或震蕩)5min加入2g無水硫酸鎂和4.5g中性氧化鋁，渦旋30s離心5min，取全部上清液(過膜)，約10ml，加入50μl氧化劑，靜置2min加入20ml超純水，放入膜片，置于往復式振蕩儀低速振蕩萃取15min取出膜片，80℃下烘干5-10min，0.5-1ml乙腈/乙酸(9:1，v/v)洗脫，正反各5次，收集洗脫液(300-500μl)，采用液相色譜測得孔雀石綠的含量為1.8ng/g，回收率90％。

實施例2分子印跡固相萃取膜(MIP)的制備及應用

S01：配置含有三苯甲烷、三氟甲基丙烯酸、交聯(lián)劑二乙烯基苯、偶氮引發(fā)劑偶氮二異庚腈的混合有機溶液：將三苯甲烷1mol、三氟甲基丙烯酸3mol、交聯(lián)劑二乙烯基苯12mol、有機溶劑氯仿適量、偶氮引發(fā)劑偶氮二異庚腈7mol進行超聲混溶處理30min，得到混合溶液；

S02：將所述混合有機溶液置于4℃冰箱靜置6h進行預聚，預聚完成后取出所述混合有機溶液，通入氮氣數(shù)分鐘后，將所述混合有機溶液倒入反應模具中，同時加入與模具尺寸匹配的玻璃纖維膜，通過控制加液量的多少可以獲得不同厚度的聚合物膜；

S03：向反應器中通入氮氣，一段時間后，密封反應器，并加熱至60℃進行聚合反應8h，待所述聚合反應結(jié)束后，取下載玻片，對所述分子印跡膜進行洗滌和除去三苯甲烷替代模版分子獲得孔雀石綠分子印跡膜。

S04：分子印跡聚合物膜的應用，取5g標準魚樣品(其中孔雀石綠的含量0.2ng/g)，加入1.4ml 0.1M乙酸鈉(ph4.8)和0.6ml 1M對甲苯磺酸，渦旋30s加入10ml乙腈，渦旋(或震蕩)5min加入2g無水硫酸鎂和4.5g中性氧化鋁，渦旋30s離心5min，取全部上清液(過膜)，約10ml，加入50μl氧化劑，靜置2min加入20ml超純水，放入膜片，置于往復式振蕩儀低速振蕩萃取15min取出膜片，80℃下烘干5-10min，0.5-1ml乙腈/乙酸(9:1，v/v)洗脫，正反各5次，收集洗脫液(300-500μl)，采用液相色譜測得孔雀石綠的含量為1.85ng/g，回收率92.5％。

實施例3分子印跡固相萃取膜(MIP)的制備及應用

S01：配置含有酚酞、丙烯酰胺、交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮引發(fā)劑偶氮二異丁酸二甲酯的混合有機溶液：將酚酞1mol、丙烯酰胺3mol、交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯12mol、有機溶劑乙腈適量、偶氮引發(fā)劑偶氮二異丁酸二甲酯7mol進行超聲混溶處理30min，得到混合溶液；

S02：將所述混合有機溶液置于4℃冰箱靜置6h進行預聚，預聚完成后取出所述混合有機溶液，通入氮氣數(shù)分鐘后，將所述混合有機溶液倒入反應模具中，同時加入與模具尺寸匹配的玻璃纖維膜，通過控制加液量的多少可以獲得不同厚度的聚合物膜；

S03：向反應器中通入氮氣，一段時間后，密封反應器，并加熱至60℃進行聚合反應8h，待所述聚合反應結(jié)束后，取下載玻片，對所述分子印跡膜進行洗滌和除去酚酞替代模版分子獲得孔雀石綠分子印跡膜。

S04：分子印跡聚合物膜的應用，取5g標準魚樣品(其中孔雀石綠的含量0.2ng/g)，加入1.4ml 0.1M乙酸鈉(ph4.8)和0.6ml 1M對甲苯磺酸，渦旋30s加入10ml乙腈，渦旋(或震蕩)5min加入2g無水硫酸鎂和4.5g中性氧化鋁，渦旋30s離心5min，取全部上清液(過膜)，約10ml，加入50μl氧化劑，靜置2min加入20ml超純水，放入膜片，置于往復式振蕩儀低速振蕩萃取15min取出膜片，80℃下烘干5-10min，0.5-1ml乙腈/乙酸(9:1，v/v)洗脫，正反各5次，收集洗脫液(300-500μl)，采用液相色譜測得孔雀石綠的含量為1.86ng/g，回收率93.0％。

實施例4：分子印跡固相萃取膜(MIP)的制備及應用

S01：配置含有堿性品紅、甲基丙烯酸、交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮引發(fā)劑偶氮二異丁酸二甲酯的混合有機溶液：將堿性品紅1mol、甲基丙烯酸3mol、交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯12mol、有機溶劑氯仿適量、偶氮引發(fā)劑偶氮二異丁酸二甲酯7mol進行超聲混溶處理30min，得到混合溶液；

S02：將所述混合有機溶液置于4℃冰箱靜置6h進行預聚，預聚完成后取出所述混合有機溶液，通入氮氣數(shù)分鐘后，將所述混合有機溶液倒入反應模具中，同時加入與模具尺寸匹配的玻璃纖維膜，通過控制加液量的多少可以獲得不同厚度的聚合物膜；

S03：向反應器中通入氮氣，一段時間后，密封反應器，并加熱至60℃進行聚合反應8h，待所述聚合反應結(jié)束后，取下載玻片，對所述分子印跡膜進行洗滌和除去堿性品紅替代模版分子獲得孔雀石綠分子印跡膜。

S04：分子印跡聚合物膜的應用，取5g標準魚樣品(其中孔雀石綠的含量0.2ng/g)，加入1.4ml 0.1M乙酸鈉(ph4.8)和0.6ml 1M對甲苯磺酸，渦旋30s加入10ml乙腈，渦旋(或震蕩)5min加入2g無水硫酸鎂和4.5g中性氧化鋁，渦旋30s離心5min，取全部上清液(過膜)，約10ml，加入50μl氧化劑，靜置2min加入20ml超純水，放入膜片，置于往復式振蕩儀低速振蕩萃取15min取出膜片，80℃下烘干5-10min，0.5-1ml乙腈/乙酸(9:1，v/v)洗脫，正反各5次，收集洗脫液(300-500μl)，采用液相色譜測得孔雀石綠的含量為1.85ng/g，回收率92.5％。

對比例1：

制備分子印跡固相萃取膜時，采用孔雀石綠本身作為模板分子，其他操作同實施例1。

采用液相色譜測得孔雀石綠的含量為0.190ng/g，回收率95％。

實施例5不同加標濃度下分子印跡固相萃取膜(MIP)和非分子印跡固相萃取膜(NIP)的萃取量

配置三組空白萃取環(huán)境(含有10ml乙腈和20ml超純水)，加標濃度分別為1、2、5ng/ml，放入膜片，置于往復式振蕩儀低速振蕩萃取15min取出膜片，80℃下烘干5-10min，0.5-1ml乙腈/乙酸(9:1，v/v)洗脫，正反各5次，收集洗脫液(300-500μl)，采用液相色譜測得孔雀石綠和隱性孔雀石綠的含量。

其中，附圖6為不同加標濃度下測得的洗脫液中孔雀石綠和隱性孔雀石綠的濃度。在三個加標濃度下，MIP對于孔雀石綠和隱性孔雀石綠的萃取量均大于NIP，且MIP對孔雀石綠的富集倍數(shù)大于14(富集倍數(shù)＝洗脫液的濃度/加標濃度)，對隱性孔雀石綠的富集倍數(shù)大于6，說明本專利所制備的分子印跡固相萃取膜對孔雀石綠和隱性孔雀石綠均有較好的特異吸附性。