與相關申請的交叉參考

本申請在35U.S.C.§119(e)下要求2011年6月8日提交的標題為"Design and Development of Novel Detergents for Use in PCR Systems"的美國臨時專利申請No.61/494,812(將其公開內容通過引用以其全部并入本文)的權益。

領域

本公開涉及用于多種方法包括例如核酸擴增反應，例如聚合酶鏈式反應(PCR)的改性去污劑。還描述了用于制備改性去污劑的方法。

背景

許多廣為人知的重組DNA技術涉及復制或聚合和/或擴增DNA。一個此種實例是聚合酶鏈式反應(PCR)。在PCR過程中，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶存在時在兩個溫度低溫與高溫(例如，55℃與95℃)之間重復地循環(huán)反應。在反應過程中在高溫下花費的總時間取決于循環(huán)的總數、每一個循環(huán)的高溫步驟的持續(xù)時間和斜坡速度(ramp speed)(即，熱循環(huán)儀從一個溫度變成另一個溫度的速度)。雖然用于PCR的DNA聚合酶是高度熱穩(wěn)定的，但它們傾向于在高溫下隨時間變得失活。此外，這些聚合酶還可因被引入具有次優(yōu)濃度的輔因子，或具有次優(yōu)的pH水平，或包括化學或生物抑制劑的存在的反應混合物環(huán)境而變得失活。

在這種條件下穩(wěn)定酶的一種方式是添加穩(wěn)定劑例如表面活性劑。表面活性劑例如去污劑是表面活性化合物，其穩(wěn)定酶的活性形式與其液體環(huán)境之間的界面。例如，通過添加非離子型去污劑例如NP-40或20穩(wěn)定了Taq DNA聚合酶的活性(Bachmann,等人Nuc.Acids Res.18(5)：1309(1990))。然而，在一些應用中，20-穩(wěn)定化的DNA聚合酶具有低的擴增效率或導致非特異性產物的擴增。此外，一些去污劑需要高的濃度。此外，還已知一些去污劑(例如，NP-40)具有毒性。因此存在對改善熱穩(wěn)定DNA聚合酶在溶液中的穩(wěn)定性的去污劑、特別是改善酶穩(wěn)定性而不賦予目前使用的去污劑的任何弊端的去污劑的需要。

附圖概述

本申請中顯示的所有擴增曲線圖解地將核酸擴增表示為作為循環(huán)次數(x-軸)的函數的ΔRn(y-軸)。

圖1.使用根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案擴增的1Kb和3Kb PCR產物進行的不同濃度的新型去污劑Dt1和Dt2的滴定。

圖2.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案，在新型去污劑Dt1和Dt2存在時進行的視紫紅質基因的擴增。

圖3.對于根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案擴增的0.1-1Kb PCR產物，對0.004％和0.0002％的新型去污劑Dt2相較于20進行的比較。

圖4.對于根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案擴增的1-2Kb PCR產物，對0.004％和0.002％的新型去污劑Dt2相較于20進行的比較。

圖5.PCR活性：對于根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案擴增的視紫紅質基因產物進行的新型去污劑Dt2與單獨的Brij-58的比較。

圖6.使用根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案擴增的Rhod-1043靶序列進行的新型去污劑Dt2和Dt4的滴定。

圖7.Dt4與20的比較：根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的β-2微球蛋白(B2M)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、大核糖體蛋白(RPLPO)和葡糖醛酸酶β(GUSB)的擴增。

圖8.Dt4與20(對數標度)的比較：根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的B2M、GAPDH、RPLPO和GUSB的擴增。

圖9.Dt4與20的比較：根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案，通過Cq表示的不同PCR產物的擴增效率。

圖10.Dt1、Dt3、Dt5、Dt6和Dt7與20的比較：根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的擴增。

圖11.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的比較Dt4與Brij-58和20(每一種的0.001％和0.0008％)的活性的次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT1)的擴增反應的擴增曲線。

圖12.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的比較Dt4與Brij-58和20(每一種的0.0006％和0.0004％)的活性的HPRT1的擴增反應的擴增曲線。

圖13.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的比較Dt4與Brij-58和20(每一種的0.001％和0.0008％)的活性的肽基脯氨酰異構酶A(PPIA)的擴增反應的擴增曲線。

圖14.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的比較Dt4與Brij-58和20(每一種的0.0006％和0.0004％)的活性的PPIA的擴增反應的擴增曲線。

圖15.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的比較Dt4與Brij-58和20(每一種的0.0002％和0.0001％)的活性的PPIA的擴增反應的擴增曲線。

圖16.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的比較0.002％Dt4與0.01％和20的活性的B2M的擴增反應的擴增曲線。

圖17.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的比較0.002％Dt4與0.01％和20的活性的GAPDH的擴增反應的擴增曲線。

圖18.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的比較0.002％Dt4與0.01％和20的活性的RPLPO的擴增反應的擴增曲線。

圖19.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案，在兩個月中以約1周的間隔進行的顯示聚合酶在5X緩沖液中的穩(wěn)定性的擴增反應(Cq)(ACTB(肌動蛋白-β)、GAPDH、PPIA和RPLPO的擴增反應)的圖示。

圖20.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案，在兩個月中以約1周的間隔進行的顯示聚合酶在5X緩沖液中的穩(wěn)定性的擴增反應(δRn)(ACTB(肌動蛋白-β)、GAPDH、PPIA和RPLPO的擴增反應)的圖示。

圖21.兩個不同的Dt4批次與20(Cq，RPLPO、ACTB、PPIA、GAPDH、PGK1(磷酸甘油酸酯激酶1)、B2M、GUSB和HPRT1的擴增反應)的比較。根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案，在兩個月中以約1周的間隔進行的顯示聚合酶在5X緩沖液中的穩(wěn)定性的擴增反應(Cq)(ACTB(肌動蛋白-β)、GAPDH、PPIA和RPLPO的擴增反應)的圖示。

圖22.兩個不同的Dt4批次與20(δRn，RPLPO、ACTB、PPIA、GAPDH、PGK1(磷酸甘油酸酯激酶1)、B2M、GUSB和HPRT1的擴增反應)的比較。根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案，在兩個月中以約1周的間隔進行的顯示聚合酶在5X緩沖液中的穩(wěn)定性的擴增反應(Cq)(ACTB(肌動蛋白-β)、GAPDH、PPIA和RPLPO的擴增反應)的圖示。

圖23.根據本文中公開的方法和組合物的某些示例性實施方案進行的多種測定間的Dt4擴增的比較。

概述

本文中提供了用于多種用途(包括但不限于核酸擴增反應)的改性去污劑。在一些實施方案中，提供了通過化學修飾簡單起始材料而合成的離子型和兩性離子型去污劑。觀察了所有中間產物并且使用LC-MS分析對其進行了分析，隨后沒有純化而使用。在一些實施方案中，提供了新型去污劑例如Dt4(下文中描述的)。這類新型去污劑可用于多種方法，包括例如核酸擴增反應例如聚合酶鏈式反應(PCR)。

在某些實施方案中，所述改性去污劑具有下列結構式：

其中：

R¹是H、(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、苯基、取代的苯基，其中取代的芳基或取代的苯基被至少一個(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、或(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代；

R²和R³各自獨立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、CH₂(C₆H₅)或C(CH₃)₃；

R⁴和R⁵各自獨立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、C₆H₅、CH₂(C₆H₅)、C(CH₃)₃、CH₂CH(CH₃)₂、CHCH₂CH(CH₃)₂、CH₂C₆H₅OH、CH₂C＝CH NH(C₆H₅)、CH₂C＝CHN＝CHNH、CH₂COOH、CH₂CONH₂、(CH₂)₂CONH₂、(CH₂)₂COOH、CH₂SH、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN、CH₂OH、CH(OH)CH₃、(CH₂)₂SCH₃、(CH₂)₃NHC(NH₂)＝NH，或者R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；

和，

每一個n獨立地為任何正整數，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

在某些實施方案中，R¹是C₈烷基。在某些實施方案中，R¹是C₁₆烷基。在某些實施方案中，R²和R³各自獨立地選自H和CH₃。在某些實施方案中，R⁴和R⁵各自獨立地選自H、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN，或者，R⁴與R⁵一起形成5-或6-元環(huán)。

還提供的是用于聚合和/或擴增核酸的方法，所述方法包括將靶核酸與至少一種聚合物、引物、dNTP和至少一種式I的新型去污劑混合，和聚合和/或擴增靶核酸。在此種方法的一些實施方案中，使用至少一種引物。在某些實施方案中，提供了包含至少一種聚合酶、dNTP、至少一種引物和至少一種式I的新型去污劑的核酸擴增反應混合物。在一些實施方案中，反應混合物還可包含可檢測標記。在某些實施方案中，所述方法還包括一個或多個用于檢測可檢測標記以定量擴增的核酸的步驟。在某些實施方案中，提供了用于通過在其中包含式I的新型去污劑來在熱循環(huán)過程中抑制聚合酶失活的方法。在某些實施方案中，提供了用于提供具有聚合酶活性的酶和至少一種式I的新型去污劑以及將其組合以在使所述酶的聚合酶活性穩(wěn)定的條件下形成混合物的方法。在某些實施方案中，聚合酶是熱穩(wěn)定的。在某些實施方案中，本文中描述的方法提供了具有與當在常規(guī)(例如，已知的)去污劑例如NP-40和/或20存在時的擴增效率相比較相似(例如，大致相同)或增加的擴增效率的擴增反應。在一些實施方案中，本文中描述的新型去污劑可在擴增反應中替代NP-40和/或20。

在某些實施方案中，本文中描述的所述至少一種新型去污劑在反應混合物中的有效濃度低于常規(guī)去污劑例如NP-40和/或20所需的濃度。在一些這樣的實施方案中，所述至少一種新型去污劑在反應混合物中的有效濃度可直至常規(guī)去污劑例如NP-40和/或20所需的濃度，約為所述濃度，或至少一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍或十倍更少于所述濃度。還提供了用于產生新型去污劑的方法。

在某些實施方案中，本文中提供了包含至少一種式I的新型去污劑的組合物。在某些實施方案中，提供了包含至少一種聚合酶和至少一種式I的新型去污劑的組合物。在一些實施方案中，聚合酶是熱穩(wěn)定的。還提供了包括實施此種方法或制備此種混合物所必需的試劑等的試劑盒。

發(fā)明詳述

本文中提供了用于多種用途(包括但不限于核酸聚合和/或擴增反應)的新型去污劑。在一些實施方案中，提供了使用更簡單的起始材料化學合成的離子型和兩性離子型去污劑。在一些實施方案中，提供了新型去污劑例如Dt1、Dt2、Dt3、Dt4、Dt5、Dt6、Dt7、Dt8、Dt9和Dt10(下文中描述的)。這類新型去污劑可被用于多種方法(包括例如核酸聚合和/或擴增反應例如聚合酶鏈式反應(PCR))中。在一些實施方案中，式I的新型去污劑的一種或多種的存在可穩(wěn)定反應混合物中的聚合酶，減小對反應混合物內的聚合酶的抑制，和/或增加聚合酶的聚合和/或擴增效率。如此，提供了包含至少一種聚合酶和至少一種式I的新型去污劑的反應混合物。此種反應混合物還可包含一種或多種dNTP以及至少一種核酸擴增引物(例如，PCR引物)。

在某些實施方案中，本文中提供了包含至少一種式I的新型去污劑的組合物。在某些實施方案中，提供了包含至少一種聚合酶和至少一種式I的新型去污劑的組合物。在一些實施方案中，聚合酶是熱穩(wěn)定的。還提供了試劑盒，所述試劑盒包括此種反應混合物的組分以及任選地還有實施此種方法或用于制備此種混合物所必需的其它試劑。

本文中描述了新型去污劑及制備和使用所述去污劑的方法。術語“新型去污劑”通常是指式I的去污劑。在某些實施方案中，術語“去污劑”可以指一種或多種新型去污劑，任選地包括一種或多種“常規(guī)去污劑”。如本文中所用，術語“常規(guī)去污劑”是指除本文中描述的式I下的去污劑外的去污劑。在一些實施方案中，術語“去污劑”可僅指新型去污劑，或一種或多種新型去污劑與一種或多種常規(guī)去污劑的組合。類似地，術語“至少一種新型去污劑”的使用可以指一種或多種單獨的、與另一種新型去污劑一起的和/或與一種或多種常規(guī)去污劑一起的新型去污劑。因此，在一些實施方案中，本文中描述的組合物和/或反應混合物還可包含一種或多種常規(guī)去污劑例如但不限于非離子型去污劑、Brij-58、CHAPS、正-十二烷基-b-D-麥芽糖苷、NP-40、十二烷基硫酸鈉(SDS)、X-15、X-35、X-45、X-100、X-102、X-114、X-165、X-305、X-405、X-705、20和/或其它去污劑也可以是適合的，如可由本領域技術人員確定的(關于示例性去污劑，參見，例如，美國專利申請公布No.2008/0145910；美國專利申請公布No.2008/0064071；美國專利No.6,242,235；美國專利No.5,871,975和美國專利No.6,127,155；將其全部通過引用整體并入本文)。其它去污劑也可以是適合的，如將由本領域技術人員確定的。

在某些實施方案中，所述新型去污劑具有下列結構式：

其中：

R¹是H、(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、苯基、取代的苯基，其中取代的芳基或取代的苯基被至少一個(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基或(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代；

R²和R³各自獨立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、CH₂(C₆H₅)或C(CH₃)₃；

R⁴和R⁵各自獨立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、C₆H₅、CH₂(C₆H₅)、C(CH₃)₃、CH₂CH(CH₃)₂、CHCH₂CH(CH₃)₂、CH₂C₆H₅OH、CH₂C＝CHNH(C₆H₅)、CH₂C＝CHN＝CHNH、CH₂COOH、CH₂CONH₂、(CH₂)₂CONH₂、(CH₂)₂COOH、CH₂SH、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN、CH₂OH、CH(OH)CH₃、(CH₂)₂SCH₃、(CH₂)₃NHC(NH₂)＝NH，或者R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；

和，

每一個n獨立地為任何正整數，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。

在某些實施方案中，R¹是C₈烷基。在某些實施方案中，R¹是C₁₆烷基。在某些實施方案中，R²和R³各自獨立地選自H和CH₃。在某些實施方案中，R⁴和R⁵各自獨立地選自H,(CH₂)_nNH,(CH₂)_nN，或者，R⁴與R⁵一起形成5-或6-元環(huán)。

可通過使用更簡單的起始化合物材料制備式I的去污劑以提供新型和/或改性去污劑及其性質。使用LC-MS分析分析了中間產物并且不純化而進行下一個步驟。

用于制備本文中描述的新型去污劑的方法包括順此地將化合物A(如方法1中顯示的)(例如，1個當量)、甲基三苯氧基碘化鏻(例如，4個當量)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(例如，6mL)組合至鋁箔覆蓋的圓底燒瓶(例如，50mL)中。然后，在適當的溫度(例如，室溫)，適當的氣氛(例如，氬氣)下攪拌反應物充足的時間(例如，3天)。在充足的時間(例如，3天)后，可監(jiān)控(例如，使用分析液相色譜/質譜(LC-MS))反應的進展。中間產物模式的出現可確認改性去污劑的形成?？梢苑蛛x或(通常)可以不分離該預期的中間產物(中間產物B)。可向該中間產物添加氨基酸酯鹽酸鹽(例如，2當量)和Et₃N(例如，2當量)?？稍谶m當的溫度(例如，65℃)加熱所述反應混合物適當的時間(例如，3-4天)?？墒褂梅治鯨C-MS監(jiān)控反應的進展。隨后通常使反應混合物冷卻至適當的溫度(例如，室溫)和濃縮(例如，在旋轉蒸發(fā)儀上)至適當的體積(例如，約2mL)。隨后可通過制備HPLC純化濃縮的粗制混合物。隨后可將所需的級分合并和濃縮(例如，在旋轉蒸發(fā)儀上)以提供所需的產物(例如，如在方法1中，以產生離子型去污劑Dt1、Dt3、Dt5、Dt7、Dt9、Dt11和Dt12)。隨后可使該產物經歷水解反應(例如，使用2NNaOH)。隨后可攪拌(例如，在室溫)反應混合物直至全部起始材料被消耗，如通過分析LC-MS確定的。隨后可進行中和(例如，利用安伯來特(Amberlite))以產生兩性離子型終產物(例如，Dt2、Dt4、Dt6、Dt10)或陰離子型終產物(Dt8)。

因此，用于開發(fā)式I的新型去污劑的示例性方法示于下面：

其中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和n是如上文中描述的，X選自H,CH₃,CH₂CH₃,CH₂(C₆H₅)和C(CH₃)₃。式I的新型去污劑可以是例如離子型的(例如，陽離子型、陰離子型、兩性離子型)。使用方法I制造的示例性新型去污劑示于下面：

其中n是如上文中所描述的。在某些實施方案中每一個n獨立地是5、6、7、8、9、10、15、20、25或30。

在某些實施方案中，提供了用于聚合和/或擴增核酸的方法，所述方法包括將靶核酸與至少一種聚合物、引物、dNTP和至少一種式I的新型去污劑混合，以及聚合和/或擴增靶核酸。在某些實施方案中，所述方法可包括至少一種引物。在某些實施方案中，提供了包含至少一種聚合酶、dNTP、至少一種引物和至少一種式I的新型去污劑的核酸擴增反應混合物。在某些實施方案中，所述反應混合物還可包含可檢測的標記。在某些實施方案中，所述方法包括一個或多個用于檢測和/或定量可檢測標記以檢測和/或定量擴增的核酸的步驟。

在某些實施方案中，提供了用于通過在其中包含式I的新型去污劑而在熱循環(huán)過程中抑制聚合酶的失活的方法。在某些實施方案中，提供了用于提供具有聚合酶活性的酶和至少一種式I的新型去污劑，以及將其組合以在使所述酶的聚合酶活性穩(wěn)定化的條件下形成混合物的方法。在某些實施方案中，聚合酶是熱穩(wěn)定的。在某些實施方案中，聚合酶是熱穩(wěn)定的。在某些實施方案中，本文中描述的方法提供了具有與當常規(guī)(例如，已知的)去污劑例如NP-40和/或20存在時的擴增效率相比相似(例如，大致相同)或增加的擴增效率的擴增反應。在一些實施方案中，本文中描述的新型去污劑可在擴增反應中替代NP-40和/或20。

在某些實施方案中，反應混合物中所述至少一種式I的新型去污劑(例如，Dt1、Dt2、Dt3、Dt4、Dt5、Dt6、Dt7、Dt8、Dt9、Dt10、Dt1l和/或Dt 12)的“有效濃度”(例如，將支持擴增反應例如PCR的量)可以比常規(guī)去污劑(例如，NP-40和/或20)所需的有效濃度更高、與其相同或比其更低。在某些此種實施方案中，反應混合物中的所述至少一種新型去污劑(例如，Dt4)的有效濃度可直至常規(guī)去污劑(例如NP-40和/或20)所需的有效濃度，約為此濃度，或至少一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍或十倍更少于此濃度。例如通常將NP-40或20以約0.01％或更低的濃度(例如，如通過從儲液至反應混合物中的稀釋確定的)包含在反應中。在某些實施方案中，可以以比常規(guī)去污劑(例如，相較于0.01％20，對于Dt4為0.002％；圖11-18)更低的濃度(例如，作為百分比(即，w/v或v/v))使用本文中描述的新型去污劑。

在某些實施方案中，提供了用于聚合和/或擴增核酸的方法，所述方法包括將目標核酸(例如，靶核酸)與至少一種聚合酶、引物、dNTP和至少一種式I的新型去污劑混合，以及聚合和/或擴增所述靶核酸。在某些實施方案中，所述方法包括至少一種引物。在某些實施方案中，提供了核酸擴增反應混合物，所述混合物包含至少一種聚合酶、dNTP、至少一種引物和至少一種式I的改性去污劑。在其它實施方案中，提供了使用此類混合物的方法?？墒褂枚喾N反應和系統(tǒng)中的任一種來擴增靶核酸。

如本文中所用的，術語“擴增(amplification)”、“核酸擴增”或“擴增(amplifying)”是指產生多個拷貝的核酸模板，或產生多個與核酸模板互補的核酸序列拷貝。所述術語(包括術語“聚合”)也可指延伸核酸模板(例如，通過聚合)。擴增反應可以是聚合酶介導的延伸反應例如聚合酶鏈式反應(PCR)。然而，任何已知的擴增反應可適合于本文中描述的用途?？稍诒疚闹惺褂猛ǔＲ庵赴泻怂岬摹爸笖怠痹黾拥男g語“擴增”來描述所選核酸靶序列的數目的線性和指數增加。

術語“擴增反應混合物”和/或“預混合物”可指包含用于擴增靶核酸的各種(一些或全部)試劑的水性溶液。還可使用固體支持物(例如，陣列)來進行這樣的反應。還可按用戶的意愿，以單重或多重形式進行所述反應。這些反應通常包括酶、水性緩沖劑、鹽、擴增引物、靶核酸和核苷三磷酸。取決于上下文，所述混合物可以是完全或不完全擴增反應混合物。用于擴增靶核酸的方法可以是本領域技術人員可得的任何方法。可使用用于增加核酸靶序列的拷貝的任何體外手段。這類手段包括線性、對數和/或任何其它擴增法。雖然本公開通常可將PCR討論為核酸擴增反應，預期本文中描述的改性去污劑在其它類型的核酸擴增反應中應當是有效的，所述其它類型的核酸擴增反應包括聚合酶介導的擴增反應(例如解螺旋酶依賴性擴增(HDA)、重組酶-聚合酶擴增(RPA)和滾鏈擴增(rolling chain amplification)(RCA))和連接酶介導的擴增反應(例如連接酶檢測反應(LDR)、連接酶鏈式反應(LCR)和每種的缺口版本(gap-version))以及核酸擴增反應(例如LDR與PCR)的組合(參見，例如，美國專利6,797,470)。例如，所述改性去污劑可用于例如各種連接介導的反應，其中例如與PCR引物相反，使用連接探針。其它示例性方法包括聚合酶鏈式反應(PCR；參見，例如，美國專利No.4,683,202；4,683,195；4,965,188；和/或5,035,996)、等溫法(使用一種或多種RNA聚合酶(參見，例如，PCT公布No.WO 2006/081222)、鏈置換(參見，例如，美國專利No.RE39007E)、引物分子的部分破壞(參見，例如，PCT公布No.WO 2006/087574))、連接酶鏈式反應(LCR)(參見，例如，Wu,等人,Genomics 4：560-569(1990))和/或Barany,等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189-193(1991))、QβRNA復制酶系統(tǒng)(參見，例如，PCT公布No.WO 1994/016108)、基于RNA轉錄的系統(tǒng)(例如，TAS,3SR)、滾環(huán)擴增(RCA)(參見，例如，美國專利No.5,854,033；美國專利申請公布No.2004/265897；Lizardi等人Nat.Genet.19：225-232(1998)；和/或Baner等人Nucleic Acid Res.,26：5073-5078(1998))以及鏈置換擴增(SDA)(Little,等人Clin.Chem.45:777-784(1999))等等。這些系統(tǒng)，與許多本領域技術人員可獲得的其它系統(tǒng)一起，可適合用于聚合和/或擴增靶核酸以用于本文中描述的用途。

“擴增效率”可指可被定量以測定拷貝數的任何產物(例如，術語可指PCR擴增子、LCR連接產物和/或類似的產物)。特定的去污劑在特定擴增反應中是否按所需起作用可通過進行至少兩個分開的擴增反應來確定，每一個反應分別在去污劑存在和不存在時進行，定量在每一個反應中發(fā)生的擴增。還可在分開的反應混合物中測試去污劑的不同濃度或組合，以確定對擴增效率的影響。擴增和/或聚合效率可通過本領域已知的多種方法來測定，包括但不限于校準稀釋曲線和斜率計算的確定、使用如Hellemans等人,Genome Biology 8:R19(2007)中描述的qBase軟件來確定、使用如由Livak和Schmittgen,Methods 25:402(2001)描述的δδCq(ΔΔCq)計算的確定或通過如由Pfaffl,Nucl.Acids Res.29:e45(2001)描述的方法進行的確定，將全部所述文獻通過引用整體并入本文。

用于聚合和/或擴增核酸的示例性方法包括例如聚合酶介導的延伸反應。例如，聚合酶介導的延伸反應可以是聚合酶鏈式反應(PCR)。在其它實施方案中，核酸擴增反應是多重反應。例如，用于聚合和/或擴增以及檢測適合本文中描述的用途的核酸的示例性方法是商購可得的，如(參見，例如，美國專利No.4,889,818；5,079,352；5,210,015；5,436,134；5,487,972；5,658,751；5,210,015；5,487,972；5,538,848；5,618,711；5,677,152；5,723,591；5,773,258；5,789,224；5,801,155；5,804,375；5,876,930；5,994,056；6,030,787；6,084,102；6,127,155；6,171,785；6,214,979；6,258,569；6,814,934；6,821,727；7,141,377；和/或7,445,900,將其全部通過引用整體并入本文)。通常如下進行測定：使用具有5'-至-3'核酸酶活性的核酸聚合酶、能夠與靶多核苷酸雜交的引物和能夠在相對于所述引物的3’處與所述靶多核苷酸雜交的寡核苷酸探在所述靶多核苷酸上進行核酸擴增。寡核苷酸探針通常包括可檢測標記(例如，熒光報告分子)和能夠淬滅所述報告分子的熒光的淬滅分子。通常，可檢測標記和淬滅分子是單個探針的一部分。隨著擴增進行，聚合酶消化探針以將可檢測標記與淬滅分子分開。在反應過程中監(jiān)控可檢測標記(例如，熒光)，其中標記的檢測對應于核酸擴增的發(fā)生(例如，信號越強，則擴增的量越大)。測定的變化(例如，LNA^TM摻入的測定)在本領域是已知的并且適合用于本文中描述的方法。

適合于本文中描述的用途的另一個示例性系統(tǒng)在置換雜交法中利用雙鏈探針(參見，例如，Morrison等人Anal.Biochem.,18:231-244(1989)；和/或Li,等人Nucleic Acids Res.,30(2,e5)(2002))。在此種方法中，探針通常包括具有不同長度的兩個互補的寡核苷酸，其中一個包括可檢測標記而另一個包括淬滅分子。當未結合至靶核酸時，淬滅劑抑制來自可檢測標記的信號。探針在與靶核酸置換雜交后變得可檢測?？墒褂枚鄠€探針，每一個探針包含不同的可檢測標記，從而可在單一反應中質詢多種靶核酸。

用于聚合和/或擴增以及檢測適用于本文中描述的用途的靶核酸的另外的示例性方法包括“分子信標”，其是單鏈發(fā)夾形狀寡核苷酸探針。在靶序列存在時，探針展開，結合并且發(fā)射信號(例如，熒光)。分子信標通常包括至少4個組件：1)“環(huán)”，其是與靶序列互補的18-30個核苷酸的區(qū)域；2)在環(huán)的任一端發(fā)現的并且彼此互補的兩個5-7個核苷酸的“莖”；3)在5'末端，可檢測標記；和4)在3'末端，當探針以閉合環(huán)形狀存在時(例如，未結合至靶核酸)阻止可檢測標記發(fā)射信號的淬滅部分。因此，在互補靶存在時，信標的“莖”部分分開，從而導致探針與靶雜交。其它類型的分子信標也是已知的并且可適合用于本文中描述的方法。分子信標可用于多種測定系統(tǒng)中。一個此種系統(tǒng)是基于核酸序列的擴增其為用于聚合RNA和/或將其擴增成雙鏈DNA而無需溫度循環(huán)的單步驟等溫過程(single step isothermal process)。NASBA反應通常需要禽成髓細胞瘤病毒(AMV)、逆轉錄酶(RT)、T7RNA聚合酶、RNA酶H和兩個寡核苷酸引物。擴增后，可使用分子信標來檢測擴增的靶核酸。分子信標的其它用途在本領域是已知的，并將適合用于本文中描述的方法。

Scorpions^TM系統(tǒng)是另一種可用于本文中描述的方法的示例性測定形式。Scorpions^TM引物是雙功能分子，其中引物共價地連接至探針，連同可檢測標記(例如，熒光團)和淬滅可檢測標記的熒光的非可檢測的淬滅劑部分。在靶核酸存在時，可檢測標記與淬滅劑分開，這導致從可檢測標記發(fā)射的信號增加。通常，用于擴增反應中的引物包括5'末端的探針元件以及發(fā)夾環(huán)的起始處的“PCR阻斷子”元件(例如，六乙二醇(HEG)單體(Whitcombe,等人Nat.Biotech.17：804-807(1999))。探針通常包括在一端具有可檢測標記并且在另一端具有淬滅劑的自我互補的莖序列。在初始擴增循環(huán)(例如，PCR)中，引物與靶雜交并且因聚合酶的作用而發(fā)生延伸。Scorpions^TM系統(tǒng)可用于使用多個探針來檢查和鑒定點突變，所述多個探針可被差異標記以在探針間進行區(qū)分。使用PCR作為示例，在完成一個延伸循環(huán)后，新合成的靶區(qū)域將被連接至與探針相同的鏈。在第二循環(huán)的變性和退火后，探針與靶雜交。發(fā)夾序列然后與一部分新產生的PCR產物雜交。這引起檢測標記與淬滅劑的分離，從而引起信號的發(fā)射。這樣的標記探針的其它用途在本領域是已知的并將適用于本文中描述的方法。

可用于所公開的核酸擴增反應的核酸聚合酶可以是起作用來進行所需的反應的任何核酸聚合酶，包括例如原核生物、真菌、病毒、噬菌體、植物和/或真核生物核酸聚合酶。如本文中所用，術語“DNA聚合酶”是指使用核酸鏈作為模板從頭合成DNA鏈的酶。DNA聚合酶使用現存的DNA或RNA作為DNA合成的模板，沿著其所讀取的模板鏈催化脫氧核糖核苷酸聚合。新合成的DNA鏈與模板鏈互補。DNA聚合酶僅可將游離核苷酸添加至新形成的鏈的3'-羥基末端。其通過將一磷酸核苷從脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)轉移至正在生長的寡核苷酸鏈的3'-羥基來合成寡核苷酸。這導致新鏈以5'-至-3'方向延長。由于DNA聚合酶僅可添加核苷酸至預先存在的3'-OH基團，以開始DNA合成反應，因此DNA聚合酶需要可向之添加第一核苷酸的引物。適當的引物可包含RNA或DNA的寡核苷酸或其嵌合體(例如，RNA/DNA嵌合引物)。DNA聚合酶可以是天然存在的DNA聚合酶或具有上述活性的天然酶的變體。例如，其可包括具有鏈置換活性的DNA聚合酶、缺乏5'-至-3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶、具有逆轉錄酶活性的DNA聚合酶或具有內切核酸酶活性的DNA聚合酶。

適合的核酸聚合酶還可包括全酶、全酶的功能性部分、嵌合聚合酶或可實現核酸分子的合成的任何經修飾的聚合酶。在本公開中，DNA聚合酶還可包括聚合酶、末端轉移酶、逆轉錄酶、端粒酶和/或多核苷酸磷酸化酶。聚合酶的非限制性實例可包括例如，T7DNA聚合酶,真核生物線粒體DNA聚合酶γ,原核生物DNA聚合酶I、II、III、IV,和/或V；真核生物聚合酶α、β、γ、δ、ε、ε、δ、ι和/或κ；大腸桿菌(E.coli)DNA聚合酶I；大腸桿菌DNA聚合酶IIIα和/或ε亞基；大腸桿菌聚合酶IV、大腸桿菌聚合酶V；水生棲熱菌(T.aquaticus)DNA聚合酶I；嗜熱脂肪芽胞桿菌(B.stearothermophilus)DNA聚合酶I；廣古菌門聚合酶；末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)；釀酒酵母聚合酶4；跨損傷合成聚合酶；逆轉錄酶；和/或端粒酶。可使用的適當的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的非限制性實例包括Taq、Tfl、Tfi、Pfu和Vent^TM DNA聚合酶、具有減小的或不顯著的3'-至-5'外切核酸酶活性的任何經遺傳工程化的DNA聚合酶(例如，SuperScript^TMDNA聚合酶)和/或經遺傳工程化的DNA聚合酶(例如，具有活性位點突變F667Y或F667Y的等同物(例如，在Tth中)的那些DNA聚合酶、ThermoSequenase^TM)、Gold、Therminator I、Therminator II、Therminator III、Therminatorγ(全部可獲得自New England Biolabs、Beverly、MA)，和/或它們的任意衍生物和片段。其它核酸聚合酶也可以是適合的，如本領域技術人員將理解的。

在另一個方面，本公開提供了用于聚合和/或擴增目標核酸序列(例如，靶序列)的反應混合物。在一些實施方案中，所述反應混合物還可包含可檢測標記。所述方法還可包括一個或多個用于檢測可檢測標記以定量所擴增的核酸的步驟。如本文中所用，術語“可檢測標記”是指多種指示擴增的信號分子的任一種。例如，綠和其它DNA結合染料是可檢測標記。此種可檢測標記可包括或可以是例如核酸嵌入劑或非嵌入劑。如本文中所用，嵌入劑是能夠非共價插入雙鏈核酸分子的堆積堿基對之間的試劑或部分。非嵌入劑是不插入雙鏈核酸分子的試劑或部分。核酸結合劑可直接或間接產生可檢測信號?？墒褂美鐭晒夂?或吸光度來直接檢測信號，或可使用例如下述來間接檢測信號，其中可檢測地受到與雙鏈核酸的接近影響的任何部分或配體是適合的，例如連接至核酸結合劑的經取代的標記部分或結合配體。核酸結合劑通常必需在結合至雙鏈核酸時產生可檢測的信號，所述可檢測的信號與當所述試劑在溶液中或結合至單鏈核酸時產生的信號是可區(qū)分的。例如，當嵌入雙鏈DNA時，嵌入劑例如溴化乙錠熒光比當結合至單鏈DNA、RNA時或在溶液中時更強(參見，例如，美國專利No.5,994,056；6,171,785；和/或6,814,934)。類似地，當結合至單鏈核酸時放線菌素D在UV/VIS光譜的紅色部分中發(fā)熒光，當結合至雙鏈核酸時其在UV/VIS光譜的綠色部分中發(fā)熒光。在另一個實例中，已報導光反應補骨脂素4-氨甲基-4-5',8-三甲基補骨脂素(AMT)在長波長顯示減少的吸收，在嵌入雙鏈DNA中后發(fā)熒光(Johnson等人Photochem.&Photobiol,33:785-791(1981)。例如，美國專利No.4,257,774描述了熒光嵌合劑與DNA的直接結合(例如，乙錠(ethidium)鹽、道諾霉素,米帕林和吖啶橙,4',6-二脒基-α-苯基吲哚)。非嵌入劑(例如，本文中描述的小溝結合劑例如Hoechst 33258,偏端霉素,紡綞菌素)也可能是適用的。例如，Hoechst 33258(Searle,等人Nucl.Acids Res.18(13):3753-3762(1990))隨著靶的量的遞增顯示出改變的熒光。小溝結合劑在本文中其它地方被更詳細地描述。

其它DNA結合染料是本領域技術人員可獲得的，并且可單獨使用或與測定系統(tǒng)的其它試劑和/或組分組合使用。示例性DNA結合染料可包括例如吖啶類(例如，吖啶橙、吖啶黃)、放線菌素D(Jain、等人J.Mol.Biol.68:21(1972))、氨茴霉素、BOBO^TM-1、BOBO^TM-3、BO-PRO^TM-1、cbromomycin、DAPI(Kapuseinski等人Nucl.Acids Res.6(112)：3519(1979))、道諾霉素、偏端霉素(例如，偏端霉素D)、美國專利No.7,387,887中描述的染料、玫瑰樹堿、乙錠鹽(例如，溴化乙錠)、熒光香豆素(fluorcoumanin)、熒光嵌合劑(如美國專利No.4,257,774中描述的)、(Cambrex Bio Science Rockland Inc.,Rockland,Me.)、Hoechst 33258(Searle和Embrey,Nucl.Acids Res.18:3753-3762(1990))、Hoechst 33342、胡銨、JO-PRO^TM-1、LIZ染料、LO-PRO^TM-1、米帕林、光輝霉素、NED染料、紡綞菌素、4',6-二脒基-α-苯基吲哚、原黃素、POPO^TM-1、POPO^TM-3、PO-PRO^TM-1、碘化丙啶、多吡啶釕、S5、Gold、綠I(美國專利No.5,436,134和5,658,751)、綠II、藍、綠、43、44、45、藍、11、13、15、16、20、23、噻唑橙(Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,Wis.)、TOTO^TM-3、和(Molecular Probes、Inc.、Eugene、OR)等等。綠I(參見，例如，美國專利No.5,436,134；5,658,751；和/或6,569,927)例如已被用于監(jiān)控PCR反應。其它DNA結合染料也可以是適合的，如本領域技術人員將理解的。

對于本文中描述的用途，可將一種或多種可檢測標記和/或淬滅劑連接至一個或多個引物和/或探針(例如，可檢測標記)。當游離或當結合至靶核酸之一時，可檢測標記可發(fā)射信號。當接近另一個可檢測標記時，所述可檢測標記也可發(fā)射信號。也可將所述檢測標記與淬滅劑分子一起使用，從而只有當與淬滅劑分子不足夠靠近時信號才是可檢測的。例如，在一些實施方案中，測定系統(tǒng)可使可檢測標記從淬滅分子釋放。數種可檢測標記中的任意均可被用于標記用于本文中描述的方法的引物和探針。如上所述，在一些實施方案中，可將可檢測標記連接至探針，其可被摻入引物中，或其可另外地結合至擴增的靶核酸(例如，可檢測的核酸結合劑例如嵌入或非嵌入染料)。當使用超過一種可檢測標記時，每一種可檢測標記應當在它們的光譜性質上不同，從而所述標記可彼此相區(qū)分，或從而所述可檢測標記一起發(fā)射不被任一單獨的可檢測標記發(fā)射的信號。示例性可檢測標記包括例如，熒光染料或熒光團(例如，可被光激發(fā)以發(fā)射熒光或磷光的化學基團)、能夠淬滅來自熒光供體染料的熒光信號的“接受者染料”等。合適的可檢測標記可包括例如熒光素(例如，5-羧基-2,7-二氯熒光素；5-羧基熒光素(5-FAM)；5-羥色胺(5-HAT)；6-JOE；6-羧基熒光素(6-FAM)；FITC；6-羧基-1,4-二氯-2',7'-二氯熒光素(TET)；6-羧基-1,4-二氯-2',4',5',7'-四氯熒光素(HEX)；6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基熒光素(JOE)；Alexa熒光團(例如，350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750)；熒光團(例如，492/515、493/503、500/510、505/515、530/550、542/563、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650-X、650/665-X、665/676、FL、FL ATP、F1-神經酰胺、R6G SE、TMR、TMR-X綴合物、TMR-X、SE、TR、TR ATP、TR-X SE)、香豆素類(例如，7-氨基-4-甲基香豆素、AMC、AMCA、AMCA-S、AMCA-X、ABQ、CPM甲基香豆素、香豆素鬼筆環(huán)肽、羥基香豆素、CMFDA、甲氧基香豆素)、鈣黃綠素、鈣黃綠素AM、鈣黃綠素藍、鈣染料(例如，鈣深紅、鈣綠、鈣橙、熒光增白劑)、級聯(Cascade)藍、級聯黃；Cy^TM染料(例如，3、3.18、3.5、5、5.18、5.5、7)、藍綠色GFP、環(huán)AMP Fluorosensor(FiCRhR)、熒光蛋白(例如，綠色熒光蛋白(例如，GFP.EGFP)、藍色熒光蛋白(例如，BFP、EBFP、EBFP2、藍銅礦、mKalama1)、藍綠色熒光蛋白(例如，ECFP、Cerulean、CyPet)、黃色熒光蛋白(例如，YFP、Citrine、Venus、YPet)、FRET供體/接受者對(例如，熒光素/四甲基羅丹明、IAEDANS/熒光素、EDANS/dabcyl、熒光素/熒光素、FL、熒光素/QSY7和QSY9)、和LysoSensor^TM(例如，藍DND-22、藍-白DPX、黃HCK-123、綠DND-26、紅DND-99、LysoSensor^TM藍DND-167、LysoSensor^TM綠DND-189、LysoSensor^TM綠DND-153、LysoSensor^TM黃/藍DND-160、LysoSensor^TM黃/藍10,000MW葡聚糖)、Oregon綠(例如，488、488-X、500、514)；羅丹明(例如，110、123、B、B 200、BB、BG、B extra、5-羧基四甲基羅丹明(5-TAMRA)、5GLD、6-羧基羅丹明6G、麗絲胺、麗絲胺羅丹明B、Phallicidine、鬼筆環(huán)肽、紅、Rhod-2、ROX(6-羧基-X-羅丹明)、5-ROX(羧基-X-羅丹明),磺基羅丹明B can C,磺基羅丹明G Extra,TAMRA(6-羧基四甲基羅丹明)、四甲基羅丹明(TRITC),WT)、德克薩斯紅、德克薩斯紅-X、VIC和例如美國專利申請公布No.2009/0197254(通過引用整體并入本文)中描述的其它標記等等，如本領域技術人員已知的。還可使用其它的可檢測標記(參見，例如，美國專利申請公布No.2009/0197254(通過引用整體并入本文))，如本領域技術人員已知的。任意這些系統(tǒng)和可檢測標記，以及許多其它系統(tǒng)和可檢測標記可被用于檢測經擴增的靶核酸。

一些可檢測的標記可以是基于序列的(在本文中也稱為“基因座特異性可檢測標記”)，例如5'核酸酶探針。此種探針可包含一個或多個可檢測標記。各種可檢測標記在本領域中是已知的，例如本文中描述的探針(也參見美國專利No.5,538,848(通過引用整體并入本文))各種莖-環(huán)分子信標(參見，例如，美國專利No.6,103,476和5,925,517以及Tyagi和Kramer,Nature Biotechnology 14:303-308(1996))、無莖或線性信標(參見，例如，PCT公布No.WO 99/21881；美國專利No.6,485,901)、PNA Molecular Beacons^TM(參見，例如，美國專利No.6,355,421和6,593,091)、線性PNA信標(參見，例如，Kubista等人,SPIE 4264:53-58(2001))、非FRET探針(參見，例如，美國專利No.6,150,097)、探針(美國專利No.6,548,250)、莖-環(huán)和雙體(duplex)Scorpions^TM探針(Solinas等人，Nucleic Acids Research 29:E96(2001)和美國專利No.6,589,743)、凸環(huán)探針(美國專利No.6,590,091)、假結探針(美國專利No.6,589,250)、cyclicons(美國專利No.6,383,752)、MGB Eclipse^TM探針(Epoch Biosciences)、發(fā)夾探針(美國專利No.6,596,490)、肽核酸(PNA)點亮(light-up)探針(Svanvik,等人Anal Biochem 281:26-35(2001))、自我裝配納米顆粒探針、二茂鐵修飾的探針，例如在美國專利No.6,485,901；Mhlanga等人,Methods 25:463-471(2001)；Whitcombe等人，Nature Biotechnology.17:804-807(1999)；Isacsson等人，Molecular Cell Probes.14:321-328(2000)；Svanvik等人,Anal Biochem.281:26-35(2000)；Wolffs等人，Biotechniques 766:769-771(2001)；Tsourkas等人,Nucleic Acids Research.30:4208-4215(2002)；Riccelli等人，Nucleic Acids Research 30:4088-4093(2002)；Zhang等人，Acta Biochimica et Biophysica Sinica(Shanghai).34:329-332(2002)；Maxwell等人，J.Am.Chem.Soc.124:9606-9612(2002)；Broude等人，Trends Biotechnol.20:249-56(2002)；Huang等人，Chem Res.Toxicol.15：118-126(2002)；和Yu等人，J.Am.Chem.Soc.14：11155-11161(2001)中所描述的；(www.qiagen.com)、(French,等人Mol.Cell.Probes 15:363-374(2001))、置換探針(Li,等人Nucl.Acids Res.30:e5(2002))、HybProbes(Cardullo,等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8790-8794(1988))、MGB Alert(www.nanogen.com)、Q-PNA(Fiandaca,等人Genome Res.11:609-611(2001))、(www.Promega.com)、LUX^TM引物(Nazarenko,等人Nucleic Acids Res.30:e37(2002))、DzyNA引物(Todd,等人Clin.Chem.46:625-630(2000))?？蓹z測標記還可包含淬滅可檢測標記的熒光的非可檢測淬滅劑部分，包括例如黑洞淬滅劑(Biosearch)、Iowa淬滅劑(IDT)、QSY淬滅劑(Molecular Probes)以及Dabsyl和磺酸Dabsyl/羧酸淬滅劑(Epoch)?？蓹z測標記還可包含兩個探針，其中例如熒光團在一個探針上，淬滅劑在另一個探針上，其中兩個探針一起在靶上的雜交淬滅信號，或其中在靶上的雜交通過熒光的變化改變信號特征。示例性的系統(tǒng)還可包括FRET、水楊酸/DTPA配體系統(tǒng)(參見，例如，Oser等人Angew.Chem.Int.Engl.29(10)：1167(1990))、置換雜交、同源探針和/或歐洲專利No.EP 070685和/或美國專利No.6,238,927中描述的測定。可檢測標記還可包含具有SO₃而非羧酸基團的熒光素染料的磺化衍生物、熒光素的亞磷酰胺形式、Cy5的亞磷酰胺形式(例如可獲自Amersham)。上述所有參考資料均通過引用整體并入本文。

其它實施方案提供了用于通過在其中包含式I的新型去污劑來在熱循環(huán)過程中抑制聚合酶的失活的方法。還提供了用于提供具有聚合酶活性的酶和至少一種式I的新型去污劑，以及將它們組合以在使所述酶的聚合酶活性穩(wěn)定化的條件下形成混合物的方法。聚合酶可以是本領域技術人員可獲得的任何聚合酶，包括但不限于本文中描述的那些。在某些實施方案中，所述聚合酶是熱穩(wěn)定的。

本文中描述的去污劑和方法可用于檢測和/或定量多種來自測試樣品的靶核酸。靶核酸是測定系統(tǒng)被設計來鑒定或檢測其在測試樣品中的存在(或不存在)和/或對其進行定量的任何核酸。此類核酸可包括例如感染性試劑的那些(例如，病毒、細菌、寄生物等)、疾病過程例如癌癥、糖尿病等的那些，或用于測免疫免疫應答。示例性的“測試樣品”包括各種類型的樣品，例如生物學樣品。示例性的生物學樣品包括例如，體液(例如，血液、唾液和脊髓液)、組織樣品、食物(例如，肉)或飲料(例如，乳)產品等。經表達的核酸可包括例如其表達(或其缺少)與醫(yī)學病況例如感染性疾病(例如，細菌、病毒、真菌、原生動物感染)或癌癥相關的基因。本文中描述的方法還可用于檢測藥物、食物或飲料產品中的污染物(例如，細菌、病毒、真菌和/或原生動物)。本文中描述的方法還可用于在野生型等位基因的存在下檢測稀有的等位基因(例如，在10⁶-10⁹個野生型等位基因的存在下的1個突變等位基因)。所述方法可用于例如檢測最小殘留疾病(例如，緩解過程中稀少的殘余癌細胞，特別是p53基因或先前在腫瘤內鑒定的其它腫瘤抑制基因中的突變)和/或測量突變負荷(例如，存在于正常組織例如血液或尿中的特定體細胞突變的頻率)。

還提供了用于進行本文中描述的方法的試劑盒。如本文中所用，術語“試劑盒”是指相關組分(通常是一種或多種化合物或組合物)的包裝套件。所述試劑盒可包括一對用于聚合和/或擴增至少一種來自樣品的靶核酸的寡核苷酸、一種或多種新型去污劑(例如，和/或常規(guī)去污劑，或包含所述去污劑的任一種的混合物)、生物催化劑(例如，DNA聚合酶)和/或用可檢測標記物標記的相應的一種或多種探針。試劑盒還可包括含有待用于對照反應的預確定的靶核酸的樣品。試劑盒還可任選地包括儲液、緩沖劑、酶、可檢測標記或檢測所需的試劑、可用于完成擴增反應的試管、膜等。在一些實施方案中，包括了多個引物組。在一個實施方案中，試劑盒可包括如下的一種或多種：例如緩沖劑(例如，Tris)、一種或多種鹽(例如，KCl)、甘油、dNTP(dA,dT,dG,dC,dU)、重組BSA(牛血清白蛋白)、染料(例如，ROX被動參照染料)、一種或多種去污劑(例如，Dt4)、一種或多種熱起始PCR機制、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和/或明膠(例如，魚或牛來源)。還包括本領域技術人員將理解的特定系統(tǒng)和試劑盒的其它實施方案。

為了更清楚和簡明地描述和指出本公開的主題，為特定術語提供了下列定義，所述術語用于下列描述和所附權利要求中。貫穿本說明書，特定術語的舉例說明應當被認為是非限制性的實例。

除非上下文明確地另有所指，否則單數形式“一個/一種(a)”、“一個/一種(an)”和“該(the)”包括復數指代物。如本文中所用，近似語言在整個說明書和權利要求中可被用于修飾可允許變化而不導致與其相關的基本功能的變化的任何定量表示。因此，由術語例如“約”修飾的值將不限于所指定的精確值。必要時，提供了范圍，且那些范圍包含其間的所有亞范圍。

在本公開中，除非明確地另有所指，否則單數的使用可包括復數，如本領域技術人員根據本公開將理解的，單數是唯一的功能性實施方案。因此，例如，“一個/一種(a)”可意指超過一個/一種，“一個實施方案”可意指該描述用于多個實施方案。用語“和/或”表示簡寫方式，其顯示特定的組合以組合、及交替分開地被設想。

將理解，在本教導中討論的溫度、濃度、時間等之前存在隱含的“約”，從而微小和非實質性的偏差在本文中的本教導的范圍內。此外，“包含”、“含有”、“包括”、“包含有”、“包括”、“包括的”、“包括”、“包括有”和“含有”的使用無意是限制性的。要理解，前述一般描述和詳細描述僅僅是示例性和解釋性的而不限制本發(fā)明。

除非上面的說明書中明確指出，否則上面說明書中引述“包含”各種組分的實施方案也被理解為“由所引述的組分組成”或“基本上由所引述的組分組成”；說明書中引述“由各種組分組成”的實施方案也理解為“包含”或“基本上由所引述的組分組成”；說明書中引述“基本上由各種組分組成”的實施方案也理解為“由所引述的組分組成”或“包含”所引述的組分(該可互換性不應用于這些術語在權利要求中的使用)。

如本文中所用，術語“核苷酸”或“核苷酸堿基”是指核苷磷酸。其包括但不限于天然核苷酸、合成核苷酸、經修飾的核苷酸或替代置換部分或通用核苷酸(例如，肌苷)。核苷磷酸可以是一磷酸核苷、二磷酸核苷或三磷酸核苷。核苷磷酸中的糖部分可以是戊糖例如核糖，磷酸酯化位點可對應于連接至核苷的戊糖的C-5位置的羥基。核苷酸可以是但不限于脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)或核糖核苷三磷酸(NTP)。核苷酸可使用按字母順序的字母(字母名稱)表示。例如，A表示腺苷(即，包含核堿基腺嘌呤的核苷酸)，C表示胞苷，G表示鳥苷，T表示胸苷，U表示尿苷以及I表示肌苷。N代表任意核苷酸(例如，N可以是A,C,G,T/U或I中的任意)。還可使用天然存在和合成的類似物，包括例如次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、2-硫脲嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N4-甲基胞嘧啶、5,N4-ethencytosine、4-氨基吡唑[3,4-d]嘧啶和6-氨基-4-羥基[3,4-d]嘧啶等等。寡核苷酸的核苷酸單元還可具有交聯功能(例如烷化劑)。

如本文中所用，術語“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指核苷酸的寡聚物或其衍生物。所述寡聚物可以是DNA、RNA或其類似物(例如，硫代磷酸類似物)。寡聚物還可包括經修飾的堿和/或主鏈(例如，經修飾的磷酸連接或經修飾的糖部分)。賦予寡聚物穩(wěn)定性和/或其它優(yōu)勢的合成主鏈的非限制性實例可包括硫代磷酸連接、肽核酸、鎖定核酸(Singh,等人Chem.Commun.4:455-456(1998))、木糖核酸和/或其類似物。寡核苷酸可以是任意長度“n”。例如，n可以是1、2、4、6、8、12、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40等核苷酸數目中的任意。多核苷酸結構(N)_n代表由n數目的核苷酸N組成的寡核苷酸(例如，(I)₈代表具有序列IIIIIIII的寡核苷酸；或(A)₁₂代表具有序列AAAAAAAAAAAA的寡核苷酸)。其它類型的寡核苷酸或多核苷酸也是適合使用的，如本領域技術人員由本公開將理解的。

如本文中所用，術語“核酸”是指核苷酸或其衍生物的聚合物。如本文中所用，術語“靶核酸”是指希望在核酸擴增反應中被擴增的核酸。例如，靶核酸包括核酸模板。

如本文中所用，術語“序列”是指寡核苷酸或核酸的核苷酸序列。貫穿本說明書，每當寡核苷酸/核酸由字母的序列表示時，核苷酸從左至右以5'至3'的順序。例如，由序列(I)n(A)n(其中n＝1、2、3、4等)表示的寡核苷酸代表其中5'末端核苷酸是肌苷并且3'末端核苷酸是腺苷的寡核苷酸。

如本文中所用，術語“反應混合物”是指試劑或試劑溶液的組合，其被用于進行化學分析或生物測定。在一些實施方案中，所述反應混合物包含用于進行核酸(DNA)合成/擴增反應的所有必需組分。如上所述，這樣的反應混合物可包括至少一個適于聚合和/或擴增目標核酸序列的擴增引物對和至少一種去污劑。如上所述，適當的反應混合物還可包括含有進行擴增反應所需的組分(例如，通常不包括引物對)的“預混合物”?？蓪⑺鲱A混合物與一種或多種去污劑組合以形成反應混合物。本文中還涉及反應混合物的其它實施方案，如本領域技術人員將理解的。

如本文中所用，術語“試劑溶液”或“適于進行DNA合成反應的溶液”是指通常用于進行擴增反應或DNA合成的任何或所有溶液。它們包括但不限于在DNA擴增方法中使用的溶液、在PCR擴增反應中使用的溶液等。適于DNA合成反應的溶液可包含緩沖劑、鹽和/或核苷酸。其還可包含待擴增的引物和/或DNA模板。一種或多種試劑溶液通常被包含在本文中描述的反應混合物或預混合物中。

如本文中所用，術語“引物”或“引物序列”是指與靶核酸序列(例如，待擴增的DNA模板)雜交以引發(fā)核酸合成反應的短的線性寡核苷酸。引物可以是RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或嵌合序列(例如，包含RNA和DNA)。引物可包含天然、合成或經修飾的核苷酸。引物長度的上限和下限被經驗性地確定。引物長度的下限是在核酸擴增反應條件下與靶核酸雜交后形成穩(wěn)定的雙鏈體所需的最小長度。非常短的引物(通常少于3個核苷酸長)在這樣的雜交條件下不與靶核酸形成熱動力學上穩(wěn)定的雙體。上限通常由在靶核酸中除預先確定的核酸序列外的區(qū)域中具有雙體形成的概率來確定。一般地，適合的引物長度在例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40(等)核苷酸長度的約任意的范圍內。

如本文中所用，“烷基”是指任選地線性或分支的碳氫化合物，其可以是完全飽和的、單或多不飽和的。此外，如本文中所用，術語“烷基”還包括在碳氫化合物鏈片段的一個或多個碳原子處的一個或多個置換。

如本文中所用，“芳基”是指具有單環(huán)或多個稠環(huán)的芳香族部分，其中的每一個任選地和獨立地被H、鹵素、氰基、疊氮基、磺酸、磺酸的堿鹽或銨鹽、羧酸的生物相容性鹽、硝基、烷基、全氟烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基或烷基酰氨基取代。

如本文中所用，“取代的”是指其中一個或多個氫原子被一個或多個非氫原子、官能團或部分替代的分子。例如，未取代的氮是-NH₂，而經取代的氮是-NHCH₃。示例性的取代基包括但不限于鹵素，例如氟和氯、烷基、烯烴、炔烴、硫酸鹽、磺基、磺酸鹽、氨基、銨、酰胺基、腈基、烷氧基、苯氧基、芳基、苯基、多環(huán)芳基和雜環(huán)。

某些實施方案在下面的實施例中被進一步描述。這些實施方案僅作為示例被提供，并且無意以任何方式限制權利要求的范圍。

實施例

新型去污劑的開發(fā)

使用下面描述的方法1開發(fā)了新型去污劑Dt1、Dt2、Dt3、Dt4、Dt5、Dt6、Dt7、Dt8、Dt9、D10、Dt11和Dt12：

其中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和n是如上文中所描述的，X選自H、CH₃、CH₂CH₃、CH₂(C₆H₅)和C(CH₃)₃。式I的新型去污劑可以是例如離子性的(例如，陽離子性、陰離子性、兩性離子性)。

如方法1中所示，將化合物A(1個當量)、甲基三苯氧基碘化鏻(4個當量)和N,N-二甲基甲酰胺(6mL)順次添加至50mL鋁箔覆蓋的圓底燒瓶中。然后使反應在室溫下于氬氣氛下攪拌3天。3天后，使用分析LC-MS監(jiān)控反應的進展。中間產物模式的出現將確認其形成。不分離該預期的中間產物(中間產物B)。向從先前步驟獲得的該中間產物添加氨基酸酯鹽酸鹽(2個當量)和Et₃N(2個當量)。將反應混合物在65℃下加熱3-4天。使用分析LC-MS監(jiān)控反應的進展。使反應混合物冷卻至室溫，然后在旋轉蒸發(fā)儀上使其濃縮至約2mL。通過制備型HPLC純化濃縮的粗制混合物。合并所有所需的級分，并將其在旋轉蒸發(fā)儀上濃縮以提供所需的產物(離子性去污劑Dt1、Dt3、Dt5、Dt7、Dt9、Dt11、Dt12)。然后使該產物經歷使用2N NaOH的水解反應。在室溫下攪拌反應混合物直至全部起始材料被消耗，如在分析LC-MS上觀察到的，隨后用中和以提供如下所示的最終兩性離子性產物Dt2、Dt4、Dt6、Dt10和陰離子性產物：

其中n是如上文中描述的。在某些實施方案中，每一個n獨立地是5、6、7、8、9、10、15、20、25或30。

測試Dt1和Dt2支持通過聚合酶的核酸擴增的能力。在0.1％NP-40和0.1％20(對照反應)，Dt1或Dt2存在下使用Taq聚合酶通過PCR擴增1kb和3kb的兩個不同的核酸靶標(分別為Rhod-1043和Rhod-3637)。如圖1中顯示的，Dt1和Dt2以與20相當的方式支持擴增反應。當以0.008％至0.0006％的濃度被包括在50μl反應中時，Dt1支持1kb擴增子(Rhod-1043)和3Kb擴增子(Rhod-3637)的擴增。當以0.04％至0.0001％(在0.0008％時觀察到一些擴增)的濃度被包含在50μl反應中時，Dt2支持1kb擴增子(Rhod-1043)和3Kb擴增子(Rhod-3637)的擴增。

還使用視紫紅質基因引物擴增約4Kb擴增子(Rhod-3920、Rhod-4181和Rhod-4089)(圖2；“儲液B”：20mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.1mM EDTA、50％甘油、1mM DTT、蒸餾水)來測試Dt1。PCR條件是94℃進行2分鐘；35個循環(huán)(在94℃進行15秒，在60℃進行30秒，在72℃進行4分鐘30秒)；在72℃下延伸10分鐘。當以0.008％至0.001％的濃度被包含在50μl反應中時，Dt1支持Rhod-3920和Rhod-4181的擴增。當以0.008％至0.001％的濃度被包含在50μl反應中時，Dt1支持Rhod-4089的擴增。

圖3顯示出0.004％和0.002％Dt1在擴增0.1至1Kb的擴增子方面與0.004％20相當。圖4顯示出0.004％和0.002％Dt1在擴增1-2kb的擴增子方面與0.004％20相當。

圖5提供了Brij-58與Dt1的比較。如其中所示，Dt1(0.04％至0.006％)以與Brij-58(0.04％至0.0004％)或20(0.002％)相當的方式支持擴增。數據顯示這不是由于用于修飾的Brij-58起始材料的污染。

圖6比較Dt1與Dt2的活性。如其中顯示的，這兩種改性去污劑都支持擴增。當以0.04％至0.001％的濃度包含在反應混合物中時，Dt1被顯示支持擴增。當以0.04％至0.006％的濃度包含在反應混合物中時，Dt2被顯示支持擴增。

圖7和8提供Dt4與20之間在擴增4個不同靶標(B2M、GAPDH、RPLPO和GUSB)方面的比較。如其中顯示的，在0.01％Dt4或0.01％20存在時的擴增提供了相似的結果。

圖9提供了Dt4與20之間在擴增各種不同靶標方面的比較。如其中顯示的，在Dt4或20存在時的擴增提供了相似的結果。

圖10闡釋了在Dt1、Dt3、Dt5、Dt6和Dt7的存在下擴增的結果。如其中所顯示的，擴增得到了每一種去污劑的支持，雖然在這些實驗的反應條件下，Dt4是最高水平，其次是Dt1。Dt5和Dt7顯示相似的活性，隨后是Dt6。

圖11-15顯示在擴增HPRT1或PPIA方面比較不同濃度時Dt4與Brij-58和20的活性的擴增曲線。如其中所示，在所有所測試的濃度(0.001％至0.0001％)中，Dt4以與Brij-58和20相當的方式支持擴增反應。

圖16-18闡釋了Dt4在不同的反應中可以以比20更低的濃度被使用(例如，0.002％Dt4相較于0.01％20)。

圖19和20顯示Dt4在“5X”緩沖液(Tris(pH 8.0)、KC1和BSA)中，在至少2個月中是穩(wěn)定的(例如，其保持其支持擴增的能力)。

圖21和22提供了兩個Dt4不同批次相對于20支持不同靶標擴增的能力的比較。

圖23闡釋了Dt4在多種測定中支持擴增。

將本公開中引述的所有參考資料通過引用整體并入本文。雖然已在優(yōu)選實施方案方面描述了某些實施方案，應理解對于本領域技術人員可產生變化和修飾。因此，所附權利要求意欲覆蓋在下列權利要求的范圍內的所有此類等同變化。

本說明書還包括下列內容：

1.式I的化合物：

其中：

R¹是H、(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、苯基、取代的苯基，其中所述取代的芳基或取代的苯基被至少一個(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、或(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代；

R²和R³各自獨立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、CH₂(C₆H₅)或C(CH₃)₃；

R⁴和R⁵各自獨立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、C₆H₅、CH₂(C₆H₅)、C(CH₃)₃、CH₂CH(CH₃)₂、CHCH₂CH(CH₃)₂、CH₂C₆H₅OH、CH₂C＝CHNH(C₆H₅)、CH₂C＝CHN＝CHNH、CH₂COOH、CH₂CONH₂、(CH₂)₂CONH₂、(CH₂)₂COOH、CH₂SH、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN、CH₂OH、CH(OH)CH₃、(CH₂)₂SCH₃、(CH₂)₃NHC(NH₂)＝NH，或者R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；和

每一個n獨立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

2.實施方式1的化合物，其中：

R¹是(C₈-C₁₆)烷基或(C₈-C₁₆)取代的烷基；

R²和R ³各自獨立地為H或CH₃；

R⁴和R⁵各自獨立地為H、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN，或者，R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；和

每一個n獨立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

3.實施方式1的化合物，其中所述化合物選自：

4.一種包含聚合酶和至少一種式I的化合物的組合物：

其中：

R¹是H、(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、苯基、取代的苯基，其中取代的芳基或取代的苯基被至少一個(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、或(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代；

R²和R³各自獨立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、CH₂(C₆H₅)或C(CH₃)₃；

R⁴和R⁵各自獨立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、C₆H₅、CH₂(C₆H₅)、C(CH₃)₃、CH₂CH(CH₃)₂、CHCH₂CH(CH₃)₂、CH₂C₆H₅OH、CH₂C＝CHNH(C₆H₅)、CH₂C＝CHN＝CHNH、CH₂COOH、CH₂CONH₂、(CH₂)₂CONH₂、(CH₂)₂COOH、CH₂SH、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN、CH₂OH、CH(OH)CH₃、(CH₂)₂SCH₃、(CH₂)₃NHC(NH₂)＝NH，或者R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；和

每一個n獨立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

5.實施方式4的組合物，其中：

R¹是(C₈-C₁₆)烷基或(C₈-C₁₆)取代的烷基；

R²和R³各自獨立地為H或CH₃；

R⁴和R⁵各自獨立地為H、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN，或者，R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；和

每一個n獨立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

6.實施方式4的組合物，其中所述化合物選自：

7.實施方式4的組合物，其中所述聚合酶是熱穩(wěn)定的。

8.包括儲備或反應組合物的試劑盒，所述組合物包含聚合酶和至少一種式I的化合物：

其中：

R¹是H、(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、苯基、取代的苯基，其中取代的芳基或取代的苯基被至少一個(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、或(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代；

R²和R³各自獨立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、CH₂(C₆H₅)或C(CH₃)₃；

R⁴和R⁵各自獨立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、C₆H₅、CH₂(C₆H₅)、C(CH₃)₃、CH₂CH(CH₃)₂、CHCH₂CH(CH₃)₂、CH₂C₆H₅OH、CH₂C＝CHNH(C₆H₅)、CH₂C＝CHN＝CHNH、CH₂COOH、CH₂CONH₂、(CH₂)₂CONH₂、(CH₂)₂COOH、CH₂SH、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN、CH₂OH、CH(OH)CH₃、(CH₂)₂SCH₃、(CH₂)₃NHC(NH₂)＝NH，或者R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；和

每一個n獨立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

9.實施方式8的試劑盒，其中：

R¹是(C₈-C₁₆)烷基或(C₈-C₁₆)取代的烷基；

R²和R³各自獨立地為H或CH₃；

R⁴和R⁵各自獨立地為H、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN，或者，R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；和

每一個n獨立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

10.實施方式8的試劑盒，其中所述化合物選自：

11.實施方式8的試劑盒，其中所述聚合酶是熱穩(wěn)定的。

12.試劑盒，其包含含有聚合酶和至少一種實施方式1的化合物的組合物。

13.試劑盒，其包含含有聚合酶和至少一種實施方式3的化合物的組合物。

14.用于增加聚合酶的效率的方法，所述方法包括下列步驟：

a)將靶核酸與至少一種聚合酶、至少一種引物、dNTP和至少一種實施方式1的化合物混合；

b)擴增所述靶核酸。

15.實施方式14的方法，其中所述增加的效率與當聚合酶在NP-40或20而非所述化合物存在時的效率相同。

16.實施方式14的方法，其中所述增加的效率比當聚合酶在NP-40或20而非所述化合物存在時的效率更大。

17.實施方式14的方法，其中所述去污劑的有效濃度為至少一倍至十倍更少于常規(guī)去污劑所需的濃度。

18.實施方式17的方法，其中所述常規(guī)去污劑是NP-40或20。

19.實施方式17或18的方法，其中所述去污劑在5X緩沖液中至少2個月是穩(wěn)定的。

20.用于檢測樣品中的靶核酸的方法，所述方法包括下述步驟：

a)形成反應混合物，其包含至少一種聚合酶、至少一種引物、dNTP、至少一種實施方式1的化合物和可檢測標記；

b)擴增所述靶核酸；和

c)檢測從所述可檢測標記產生的指示所述靶核酸在所述樣品中的存在和/或量的信號。

21.用于在熱循環(huán)過程中抑制聚合酶的失活的方法，所述方法包括在熱循環(huán)過程中使所述聚合酶與實施方式1的化合物接觸。

22.實施方式21的方法，其中所述聚合酶失活的抑制與當聚合酶在NP-40或20而非所述化合物存在時的聚合酶失活的抑制相同。

23.實施方式21的方法，其中所述聚合酶失活的抑制比當聚合酶在NP-40或20而非所述化合物存在時聚合酶失活的抑制更大。

24.一種方法，其包括組合具有聚合酶活性的酶和實施方式1的化合物以在使所述酶的所述聚合酶活性穩(wěn)定化的條件下形成混合物。

25.實施方式24的方法，其中所述穩(wěn)定化與當聚合酶在NP-40或20而非所述化合物存在時聚合酶活性的穩(wěn)定化相同。

26.實施方式24的方法，其中所述穩(wěn)定化大于當聚合酶在NP-40或20而非所述化合物存在時的聚合酶活性的穩(wěn)定化。

27.實施方式14-26的任一項的方法，其中所述聚合酶是熱穩(wěn)定的。

28.一種核酸擴增反應混合物，其包含：

a)至少一種聚合酶；

b)dNTP；和

c)至少一種實施方式1的化合物。

29.實施方式28的反應混合物，其中所述聚合酶是熱穩(wěn)定的。

30.一種用于聚合靶核酸的方法，其包括下述步驟：

a)使所述靶核酸與反應混合物中的至少一種聚合酶和至少一種實施方式1的化合物組合；和

b)聚合所述靶核酸。

31.一種用于聚合靶核酸的方法，其包括下述步驟：

a)使所述靶核酸與反應混合物中的至少一種聚合酶和至少一種實施方式3的化合物組合；和

b)聚合所述靶核酸。

32.一種用于擴增靶核酸的方法，其包括下述步驟：

a)使所述靶核酸與作為反應混合物的一部分的至少一種聚合酶和至少一種實施方式1的化合物組合；和

b)聚合所述靶核酸。

33.一種用于擴增靶核酸的方法，其包括下述步驟：

a)使所述靶核酸與作為反應混合物的一部分的至少一種聚合酶和至少一種實施方式3的化合物組合；和

b)聚合所述靶核酸。

34.實施方式30-33的任一項的方法，其中所述反應混合物還包含至少一種核酸引物和dNTP。

35.實施方式30-33的任一項的方法，其中檢測所述靶核酸的聚合或擴增。

36.實施方式35的方法，其中使用可檢測標記來檢測所述靶核酸的聚合或擴增。

37.實施方式36的方法，其中所述可檢測標記是引物或探針的一部分。

38.實施方式35的方法，其中定量所述靶核酸的聚合或擴增。

39.實施方式30-33的任一項的方法，其中所述聚合酶選自T7DNA聚合酶、真核生物線粒體DNA聚合酶γ、原核生物DNA聚合酶I、原核生物DNA聚合酶II、原核生物DNA聚合酶III、原核生物DNA聚合酶IV、原核生物DNA聚合酶V、真核生物聚合酶α、真核生物聚合酶β、真核生物聚合酶γ、真核生物聚合酶δ、真核生物聚合酶ε、真核生物聚合酶ε、真核生物聚合酶δ、真核生物聚合酶ι、真核生物聚合酶κ；大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA聚合酶IIIα亞基、大腸桿菌DNA聚合酶IIIε亞基、大腸桿菌聚合酶IV、大腸桿菌聚合酶V、水生棲熱菌DNA聚合酶I、嗜熱脂肪芽胞桿菌DNA聚合酶I、廣古菌門聚合酶、末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)、釀酒酵母聚合酶4、跨損傷合成聚合酶、逆轉錄酶、熱穩(wěn)定聚合酶和端粒酶。

40.實施方式39的方法，其中所述熱穩(wěn)定聚合酶選自Taq DNA聚合酶、Tfi DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和Vent^TMDNA聚合酶、具有減小的3’-至-5’外切核酸酶活性的聚合酶、SuperScript^TMDNA聚合酶、遺傳工程的DNA聚合酶、具有活性位點突變F667Y的聚合酶、具有活性位點F667Y的等同物的聚合酶、Tth聚合酶、ThermoSequenase^TM、Therminator I、Therminator II、Therminator III、Therminatorγ、它們的衍生物和片段。

41.實施方式40的方法，其中所述熱穩(wěn)定的聚合酶是Taq DNA聚合酶。

42.實施方式40的方法，其中所述熱穩(wěn)定的聚合酶是Tfl DNA聚合酶。

43.一種用于檢測樣品中的靶核酸的方法，所述方法包括：

a)形成反應混合物，其包含至少一種聚合酶、至少一種引物、dNTP和至少一種實施方式1的化合物以及可檢測標記；

b)擴增所述靶核酸；和

c)檢測從所述可檢測標記產生的指示所述靶核酸在所述樣品中存在的信號。

44.實施方式43的方法，其使用實施方式3的化合物。

45.一種方法，其用于通過在熱循環(huán)過程中使聚合酶與實施方式1的化合物接觸來在熱循環(huán)過程中抑制聚合酶的失活。

46.實施方式45的方法，其使用實施方式3的化合物。

47.一種方法，其包括在使酶的聚合酶活性穩(wěn)定化的條件下，使具有聚合酶活性的所述酶與實施方式1的所述化合物組合以形成混合物。

48.實施方式47的方法，其使用實施方式3的化合物。

49.一種核酸擴增反應混合物，其包含至少一種聚合酶、dNTP、至少一種引物和至少一種實施方式1的化合物。

50.實施方式49的反應混合物，其使用實施方式3的化合物。

51.用于產生改性去污劑的方法，其包括：

a)順次地組合化合物A、甲基三苯氧基碘化鏻和N,N-二甲基甲酰胺以產生混合物；

b)在適當的溫度，適當的氣氛下攪拌所述混合物充足的時間以產生中間產物混合物；

c)向所述中間產物混合物添加氨基酸酯鹽酸鹽和Et₃N；

d)將c)的混合物冷卻至適當的溫度并且將其濃縮以產生粗制濃縮混合物；

e)通過制備型HPLC分級分離所述粗制濃縮混合物；和

f)混合并且濃縮所需的級分以分離所述改性去污劑。

52.實施方式51的方法，其還包括使步驟(f)的級分經歷水解。

53.實施方式51或52的方法，其還包括中和所述產物。

54.實施方式53的方法，其中使用中和所述產物。

55.實施方式51-54的任一項的方法，其中所述改性去污劑是式I的去污劑：

其中：

R¹是H、(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、苯基、取代的苯基，其中取代的芳基或取代的苯基被至少一個(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、或(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代；

R²和R³各自獨立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、CH₂(C₆H₅)或C(CH₃)₃；

R⁴和R⁵各自獨立地是H、CH₃、CH(CH₃)₂、C₆H₅、CH₂(C₆H₅)、C(CH₃)₃、CH₂CH(CH₃)₂、CHCH₂CH(CH₃)₂、CH₂C₆H₅OH、CH₂C＝CHNH(C₆H₅)、CH₂C＝CHN＝CHNH、CH₂COOH、CH₂CONH₂、(CH₂)₂CONH₂、(CH₂)₂COOH、CH₂SH、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN、CH₂OH、CH(OH)CH₃、(CH₂)₂SCH₃、(CH₂)₃NHC(NH₂)＝NH，或者R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；和

每一個n獨立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

56.實施方式55的方法，其中：

R¹是(C₈-C₁₆)烷基或(C₈-C₁₆)取代的烷基；

R²和R³各自獨立地是H或CH₃；

R⁴和R⁵各自獨立地是H、(CH₂)_nNH、(CH₂)_nN，或者，R⁴與R⁵一起形成任選地被至少一個(C₁-C₃₀)烷基、(C₁-C₃₀)取代的烷基、(C₁-C₃₀)雜烷基、(C₁-C₃₀)取代的雜烷基取代的5-或6-元環(huán)；和

每一個n獨立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

57.實施方式55的方法，其中所述改性去污劑選自：