本申請為2011年1月21日提交的名稱為“抗轉移療法中axl信號傳導的抑制”的中國專利申請no.201180014940.0的分案申請。本發(fā)明要求2010年1月22日提交的美國臨時申請第61/336,478號的優(yōu)先權，所述臨時申請案的內容以引用的方式明確地并入本文。本發(fā)明涉及腫瘤侵襲和轉移，例如經由與axl和/或gas6相關的途徑治療或診斷腫瘤侵襲或轉移。
背景技術：
：侵襲和轉移是癌癥最具隱匿性和生命威脅性的方面。雖然具有極少侵襲或無侵襲的腫瘤可被成功清除，但一旦贅生物變得具有侵襲性，它就可經由淋巴系統(tǒng)和/或血管溝散布到多個部位，并且使完全清除變得非常困難。侵襲和轉移通過兩個過程殺死宿主：局部侵襲以及遠端器官定植和損傷。局部侵襲可通過局部壓迫、局部破壞或妨礙正常器官功能而損害受累組織的功能。然而，癌癥中最顯著的轉折點是形成遠端轉移。此時，患者不再能單獨地用局部療法治愈。轉移過程是一連串涉及多種宿主-腫瘤相互作用的相關連續(xù)步驟。該復雜過程需要細胞進入血管或淋巴循環(huán)中，在遠端血管或淋巴床處停滯，主動外滲到器官間質組織和實質中，并且增殖成次級群落。轉移潛力受局部微環(huán)境、血管生成、基質-腫瘤相互作用、局部組織對細胞因子的加工以及腫瘤和宿主細胞的分子表型的影響。局部微侵襲可在早期發(fā)生，即使遠端散布可能不明顯或可能尚未發(fā)生。腫瘤細胞在原位轉變成侵襲性癌期間穿透上皮基底膜且進入下層間質。一旦腫瘤細胞侵襲下層基質，其便進入淋巴系統(tǒng)和血管進行遠端散布，同時釋放基質片段和生長因子。在從開始轉變成侵襲性癌期間，上皮基底膜的組織、分布和量發(fā)生整體和廣泛的改變。癌癥預防和治療方面的治療工作集中在信號傳導途徑或選擇性調節(jié)蛋白的層面上。蛋白激酶活性、鈣穩(wěn)態(tài)和腫瘤蛋白激活是驅動信號且因此可為治療干預的關鍵調節(jié)位點。信號傳導途徑中調節(jié)侵襲和血管生成的激酶可為轉移的重要調節(jié)因子。生物化學分子靶的最大類別之一是受體酪氨酸激酶(rtk)家族。迄今最常見的受體酪氨酸激酶分子靶是egf和血管內皮生長因子(vegf)受體。較新的激酶分子靶包括iii型rtk家族的c-kit和abl。這些分子的抑制劑已與經典化療劑組合施用。轉移是最終引起發(fā)生大量癌癥病痛和死亡的原因。需要識別和靶向對轉移性癌細胞進行識別且產生針對這些癌細胞的特異性抑制的試劑的分子和功能標志物。本領域的出版物尤其包括li等，oncogene.(2009)28(39):3442-55；ullrich等的美國專利申請20050186571；bearss等的美國專利申請20080293733；sun等，oncology.2004；66(6):450-7；gustafsson等，clincancerres.(2009)15(14):4742-9；wimmel等，eurjcancer.200137(17):2264-74；koorstra等，cancerbiolther.20098(7):618-26；tai等，oncogene.(2008)27(29):4044-55受體酪氨酸激酶axl(也稱作ufo和tyro7)屬于酪氨酸受體家族，這一家族還包括tyro3(sky)和mer(tyrol2)。axl家族的常見配體是gas6(生長停滯特異蛋白6)。人axl是能夠引導894-氨基酸多肽的合成的2,682-bp開放閱讀框。已表征兩種變體mrna，轉錄變體1可以genbanknm_021913.3登錄且轉錄變體2可以nm_001699.4登錄。天然蛋白的多肽序列以seqidno:1提供，且關于氨基酸修飾可特定參考這一序列。gas6/axl的重要細胞功能包括細胞粘附、遷移、吞噬和抑制細胞凋亡。gas6和axl家族受體以組織和疾病特異性方式受到高度調節(jié)。axl的特征在于其獨特的分子結構，因為胞內區(qū)具有受體酪氨酸激酶的典型結構，且胞外域含有纖連蛋白iii和ig基序，類似于鈣粘蛋白型粘附分子。在發(fā)育期間，axl在包括腦在內的多種器官中表達，表明這種rtk涉及間充質和神經發(fā)育。在成體中，axl表達較低，但在多種腫瘤中會恢復高表達水平。迄今為止，gas6是axl的單一激活配體。受體酪氨酸激酶(rtk)通常通過促進受體二聚并且又促進胞漿域內酪氨酸殘基的自身磷酸化的配體而激活。信號傳導蛋白與這些磷酸化酪氨酸殘基的結合接著引起下游信號傳導。axl家族rtk的獨特之處在于其由gas6激活，gas6是維生素k依賴性蛋白家族的成員，它類似于凝血因子而非典型生長因子。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明部分是基于以下發(fā)現(xiàn)，即axl和/或gas6相關途徑與腫瘤侵襲和/或轉移有關。因此，本發(fā)明提供可用于例如經由抑制axl和/或gas6相關途徑來治療腫瘤侵襲和/或轉移的組合物和方法。此外，本發(fā)明提供可用于例如經由檢測axl和/或gas6的活性水平來確定腫瘤變得具有侵襲性和/或轉移性的易發(fā)性或可能性的試劑和方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供可溶性axl變體多肽，其中所述多肽缺乏axl跨膜域，任選地缺乏胞內域并且相對于野生型axl序列包含至少一個氨基酸修飾，且其中所述改變增加axl多肽結合于gas6的親和力。在一些實施方案中，可溶性axl變體多肽包含在野生型axl序列(seqidno:1)的選自由以下組成的組的區(qū)域中的至少一個氨基酸修飾：1)在15-50之間，2)在60-120之間，和3)在125-135之間。在一些其它實施方案中，可溶性axl變體多肽包含在野生型axl序列(seqidno:1)的19、23、26、27、32、33、38、44、61、65、72、74、78、79、86、87、88、90、92、97、98、105、109、112、113、116、118、127或129位的至少一個氨基酸修飾或其組合。在一些其它實施方案中，可溶性axl變體多肽包含選自由以下組成的組的至少一個氨基酸修飾：1)a19t，2)t23m，3)e26g，4)e27g或e27k，5)g32s，6)n33s，7)t38i，8)t44a，9)h61y，10)d65n，11)a72v，12)s74n，13)q78e，14)v79m，15)q86r，16)d87g，17)d88n，18)i90m或i90v，19)v92a、v92g或v92d，20)i97r，21)t98a或t98p，22)t105m，23)q109r，24)v112a，25)f113l，26)h116r，27)t118a，28)g127r或g127e，和29)e129k，以及它們的組合和保守等效物。在一些其它實施方案中，可溶性axl變體多肽包含相對于野生型axl序列(seqidno:1)在以下位置的氨基酸改變：(a)甘氨酸32；(b)天冬氨酸87；(c)纈氨酸92；和(d)甘氨酸127。在一些其它實施方案中，可溶性axl變體多肽包含由絲氨酸殘基置換的甘氨酸32殘基、由甘氨酸殘基置換的天冬氨酸87殘基、由丙氨酸殘基置換的纈氨酸92殘基、或由精氨酸殘基置換的甘氨酸127殘基或其組合或保守等效物。在一些其它實施方案中，可溶性axl變體多肽包含相對于野生型axl序列(seqidno:1)在以下位置的氨基酸改變：(a)谷氨酸26；(b)纈氨酸79；(c)纈氨酸92；和(d)甘氨酸127。在一些其它實施方案中，可溶性axl變體多肽包含由甘氨酸殘基置換的谷氨酸26殘基、由蛋氨酸殘基置換的纈氨酸79殘基、由丙氨酸殘基置換的纈氨酸92殘基、或由谷氨酸殘基置換的甘氨酸127殘基或它們的組合或保守等效物。在一些其它實施方案中，可溶性axl變體多肽至少包含野生型axl多肽(seqidno:1)的氨基酸1-437、19-437、130-437、19-132、1-132。在一些其它實施方案中，可溶性axl變體多肽是包含fc域的融合蛋白。在一個實施方案中，可溶性axl變體多肽對gas6的親和力為至少約1×10-5m。在另一實施方案中，可溶性axl變體多肽對gas6的親和力為至少約1×10-6m。在另一實施方案中，可溶性axl變體多肽對gas6的親和力為至少約1×10-7m。在另一實施方案中，可溶性axl變體多肽對gas6的親和力為至少約1×10-8m。在另一實施方案中，可溶性axl變體多肽對gas6的親和力為至少約1×10-9m、1×10-10m、1×10-11m或1×10-12m。在本文所述的各種實施方案中，可溶性axl變體多肽展現(xiàn)的對gas6的親和力為野生型axl多肽的親和力的至少約2倍。在一些實施方案中，可溶性axl變體多肽展現(xiàn)的對gas6的親和力比野生型axl多肽的親和力強為至少約3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍或30倍。在另一實施方案中，本發(fā)明提供特異性結合于gas6蛋白(seqidno:2)的分離的抗體或其片段。在一些實施方案中，分離的抗體或其片段是單克隆抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體(scfv)或其組合。在一些其它實施方案中，分離的抗體或其片段結合gas6的一個或多個氨基酸區(qū)域中所包含的表位，所述氨基酸區(qū)域選自由r299-t317、v364-p372、r389-n396、d398-a406、e413-h429和w450-m468組成的組。在一些其它實施方案中，分離的抗體或其片段結合選自由以下組成的組的氨基酸區(qū)域中所包含的表位：rmfsgtpvirlrfkrlqpt(seqidno:3)、vgrvtssgp(seqidno:4)、rnlvikvn(seqidno:5)、davmkiava(seqidno:6)、erglyhlnltvggipfh(seqidno:7)和wlngedttiqetvkvntrm(seqidno:8)。在另一實施方案中，本發(fā)明提供治療、減輕或預防哺乳動物患者中的腫瘤轉移或侵襲的方法。在一個實施方案中，所述方法包括對所述患者施用有效劑量的可溶性axl變體多肽或分離的抗gas6抗體或其片段。在另一實施方案中，本發(fā)明提供治療、減輕或預防哺乳動物患者中的腫瘤轉移或侵襲的方法。在一個實施方案中，所述方法包括施用一種或多種選自由以下組成的組的抑制劑：(a)axl活性抑制劑，(b)gas6活性抑制劑，和(c)axl-gas6相互作用抑制劑。在本文所述的各種實施方案中，所述抑制劑是多肽、多核苷酸、小分子、抗體、抗體片段或抗體藥物綴合物。在另一實施方案中，本發(fā)明提供確定腫瘤在受試者體內進行侵襲或轉移的能力的方法。在一個實施方案中，所述方法包括檢測來自具有腫瘤的受試者的生物樣品中axl活性和/或gas6活性的水平；和將所述生物樣品中axl和/或gas6活性的水平與預定水平相比較，其中超出預定水平的增加可指示腫瘤發(fā)生侵襲或轉移的傾向。附圖說明圖1.axl表達與人類乳癌和卵巢癌中的腫瘤進展和轉移相關。a.正常乳房組織(正常)、原發(fā)浸潤性導管癌(1級、2級和3級)和淋巴結轉移(淋巴結)中的axl免疫組織化學染色的代表性圖像。注意，高水平的膜axl染色出現(xiàn)于2級(箭頭)、3級和淋巴結轉移中。正?；蚰[瘤基質中未觀察到axl染色(＊)。b.正常卵巢上皮(箭頭)、ii期、iii期和來源于漿液性腺癌患者的網(wǎng)膜轉移的axl免疫組織化學染色的代表性圖像。注意，正?；|和腫瘤基質對于axl染色呈陰性(＊)。圖2.axl的遺傳失活足以阻斷乳房和卵巢轉移。a.尾靜脈注射shscramble(shscrm)和shaxl(shaxl)mda-231細胞的小鼠的肺中的h&e和axl免疫組織化學染色。照片表示每組5只小鼠。圖形描繪注射shscrm或shaxlmda-231細胞的小鼠的全肺中人gaspdh和axl表達的實時pcr分析(n＝5)。b.注射shscramble(shscrm)和shaxl(shaxl)skov3ip.1細胞后28天對小鼠拍攝的照片。注意，注射shscrm的小鼠在整個腹腔中形成大量轉移(圓圈)。對于shaxl組，顯示具有最大腫瘤負荷的小鼠。右邊的圖形描繪每只小鼠>5mm尺寸的腹膜轉移的平均數(shù)目和最大腫瘤的平均重量。照片表示每組5只小鼠。c.注射shscrm和shaxlovcar-8細胞后34天對小鼠拍攝的照片。注意，注射shscrm的小鼠在整個腹腔中形成大量轉移(圓圈)。右邊的圖形描繪每只小鼠腹膜轉移的平均總數(shù)和平均總腫瘤重量。照片表示每組8只小鼠。圖3.axl的遺傳失活不會影響乳房或卵巢腫瘤細胞的體外增殖或體內生長。a.穩(wěn)定表達scramble對照(shscrm)或axl(shaxl)的shrna靶向序列的mda-231、skov3ip.1和ovcar-8細胞的細胞生長曲線。一式三份進行測量且誤差條線表示s.e.m。b.48天時程內生長的常位mda-231(n＝每組8只小鼠)和皮下skov3ip.1腫瘤(n＝每組4只小鼠)的平均腫瘤體積。誤差條線表示s.e.m。圖4.axl在體外調節(jié)卵巢和乳房腫瘤細胞的侵襲。a.對照(shscrm)和axl缺陷(shaxl)mda-231、skov3ip.1和ovcar-8細胞的膠原蛋白侵襲測定。照片表示每組3個樣品且在細胞接種于膠原蛋白后7天拍攝。注意，與axl缺陷細胞(圓形)相比，在axl野生型細胞(分枝)中觀察到侵襲性表型。圖形顯示膠原蛋白侵襲測定的量化。b.shaxl和shscrmskov3ip.1細胞中mmp-2表達的實時pcr分析。表達值歸一化為18s；n＝3。誤差條線表示s.e.m。星號指示與shscrm相比表達顯著增加或降低，如由斯氏t檢驗(student’st-test)(＊＊,p<0.001)所測定。c.shscrm或shaxlskov3ip.1細胞的mmp-2報告基因測定(n＝6)。d.從血清饑餓skov3ip.1細胞收集的條件培養(yǎng)基中mmp2酶原和活性mmp2活性的明膠酶譜法測定。e.表達靶向scramble對照(shscrm)或axl(shaxl)的shrna序列的skov3ip.1細胞和用gas6或pi3k抑制劑ly294002(ly)和gas6處理的饑餓skov3ip.1細胞(strve)中ser473處的磷酸化akt(p-akt)、總akt(akt)和axl表達的蛋白質印跡分析。f.用gas6或gas6和pi3k抑制劑ly294002(ly+gas6)處理的饑餓skov3ip.1細胞(strve)的mmp-2報告基因測定。圖5.可溶性axl胞外域療法在體外抑制axl信號傳導和侵襲。a.可溶性axl療法的機制的示意圖?？扇苄詀xl(saxl)充當誘餌受體以抑制內源性axl信號傳導。b.表達靶向scramble對照(shscrm)或axl(shaxl)的shrna序列的mda231、skov3ip.1和ovcar-8細胞和用gas6或pi3k抑制劑ly294002(ly)和gas6處理的饑餓skov3ip.1細胞(strve)中ser473處的磷酸化akt(p-akt)、總akt(akt)和axl表達的蛋白質印跡分析。c.用含有可溶性axl受體(saxl)的條件培養(yǎng)基或對照培養(yǎng)基(-)處理的細胞中磷酸化aktser473表達的蛋白質印跡分析。使所有細胞饑餓48小時且用gas6(+)或媒介物(-)處理。d.用含有對照載體或saxl的條件培養(yǎng)基處理的mda-231細胞中的膠原蛋白侵襲測定。圖6.用可溶性axl受體治療會抑制確知有轉移的小鼠中的轉移性腫瘤負荷。a.可溶性axl受體治療研究的示意圖。向裸小鼠腹膜內(i.p.)注射1×106個skov3ip.1細胞。移植后5天，在小鼠中檢驗到肉眼可見的病變的存在(顯示注射后第5天具有腹膜轉移的小鼠的代表性照片，轉移性病變由圓圈表示)。在第7天，向小鼠注射表達igg2a-fc對照(ad-fc)或可溶性axl受體(ad-saxl)的腺病毒。腺病毒注射后，每3-4天通過蛋白質印跡分析評估血清saxl表達水平。腫瘤細胞移植后第28天，在所有小鼠中評估腫瘤負荷。b.在腫瘤細胞注射后28天，用表達ad-saxl或ad-fc的腺病毒治療的小鼠的代表性照片。轉移性病變由圓圈表示。圖形顯示每組7只小鼠的平均總腫瘤數(shù)目和重量。誤差條線表示s.e.m.。注意，腫瘤數(shù)目和重量的統(tǒng)計差(p＝0.01，斯氏t檢驗)在ad-fc和ad-saxl治療的小鼠之間觀察到(＊)。c.用ad-fc或ad-axl治療的小鼠的腫瘤中mmp-2表達的實時pcr分析。圖7.可溶性axl胞外域療法不會誘導正常組織毒性。a.用對照(fc)或可溶性axl療法(saxl)治療的小鼠的完整的全血細胞計數(shù)(completecbc)和血清化學分析。b.從用fc或saxl治療的小鼠收集的肝臟和腎組織的h&e染色。圖8.說明與轉移的可溶性axl受體抑制作用相關的分子機制的示意圖?？扇苄詀xl受體(saxl)療法充當結合于axl配體gas6的誘餌受體。saxl抑制刺激細胞侵襲和轉移的內源性gas6-axl信號傳導事件。圖9.axl缺陷型乳癌和卵巢癌細胞系的產生。a.一組人類乳癌和卵巢癌細胞系中axl表達的蛋白質印跡分析。熱休克蛋白70(hsp70)用作蛋白負載對照。b.由scramble對照(shscrm)或axl(shaxl)的shrna靶向序列穩(wěn)定轉染的轉移性乳癌細胞系(mda-231)、卵巢癌細胞系(skov3ip.1和ovcar-8)中axl表達的蛋白質印跡分析。注意，shaxl細胞系在axl表達方面顯著降低。圖10.axl不會影響乳房和卵巢腫瘤細胞粘附或存活。a-b.在針對作為化學引誘物的血清的博伊登室遷移測定(boydenchambermigrationassay)中mda-231(a)和skov3ip.1(b)細胞的細胞遷移百分比。c-d.mda-231(a)、skov3ip.1(b)細胞粘附于胞外基質蛋白的情形的分析?？s寫：牛血清白蛋白(bsa)，纖連蛋白(fn)，i型膠原蛋白(coli)，iv型膠原蛋白(coliv)，層粘連蛋白(ln)，纖維蛋白原(fbn)。誤差條線表示平均值的標準誤差。e-f.撤血清后axl野生型和axl缺陷型mda-231腫瘤細胞(e)和skov3ip.1腫瘤細胞(f)的存活分析，如xtt測定所測定。圖11.用可溶性axl受體治療會抑制產生ovcar-8轉移的小鼠中的轉移性腫瘤負荷。a.可溶性axl受體治療研究的示意圖。向裸小鼠腹膜內注射5×106個ovcar-8細胞。移植后14天，在小鼠中檢驗到肉眼可見的病變的存在(顯示注射后第14天具有腹膜轉移的小鼠的代表性照片，轉移性病變由圓圈表示)。在第14天，向小鼠注射表達igg2α-fc對照(ad-fc)或可溶性axl受體(ad-saxl)的腺病毒。通過蛋白質印跡分析評估血清saxl表達水平。腫瘤細胞移植后第34天，在所有小鼠中評估腫瘤負荷。b.在腫瘤細胞注射后28天，用表達ad-saxl或ad-fc的腺病毒治療的小鼠的代表性照片。轉移性病變由圓圈表示。c.圖形顯示每組8只小鼠的平均總腫瘤數(shù)目和重量。誤差條線表示s.e.m.。注意，腫瘤數(shù)目和重量的統(tǒng)計差(p<0.01，斯氏t檢驗)在ad-fc和ad-saxl治療的小鼠之間觀察到(＊)。圖12a和圖12b.axl庫第5輪分選產物結合于gas6。圖12a表示表達野生型axl(a)或從定向進化處理匯集的axl第5輪分選產物(b)的酵母細胞的流式細胞術點圖。數(shù)據(jù)顯示如實例2中所述的解離速率測試后的結合。結合于2nmgas6的水平顯示于左側柱形圖中，4小時無結合步驟后結合于gas6的水平顯示于中間柱形圖中，且6小時無結合步驟后結合于gas6的水平顯示于右側柱形圖中。圖12b表示其細胞表面上特定蛋白的表達呈陽性的細胞(各流式細胞術點圖的右上象限)結合于gas6的水平(y軸)的量化。匯集的第5輪分選產物顯示與野生型axl相比顯著提高的gas6結合。圖13.增強的axl變體與gas6的結合。左圖顯示與野生型axl(綠色圓形)相比，axl突變體s6-1(紅色方形)和s6-2(藍色菱形)針對gas6的平衡結合。突變體s6-1和s6-2展現(xiàn)以顯著較高水平結合于較低濃度的gas6，表明與野生型axl相比這些突變體具有較強的結合親和力。右圖顯示野生型或工程改造過的gas6-axl相互作用的解離動力學。野生型gas6-axl相互作用(“野生型”)隨時間快速解離，而gas6與s6-1(“s6-1”)或s6-2(“s6-2”)之間工程改造過的相互作用顯示顯著增加的結合保持性。圖14.純化過的axls6-1-fc的腹膜內遞送顯示相比野生型axl-fc和axle59r/t77r-fc增強的治療作用。顯示來自3個治療組(axle59r/t77r-fc、野生型axl-fc和axls6-1-fc)的小鼠的尸檢的2個代表性圖像。黑色圓圈指示圖像中可見的轉移性病變，但不一定指示所有轉移位點。野生型axl-fc顯示出對轉移的中度抑制作用(相比陰性對照axle59r/t77r)，而axls6-1顯示出對轉移的幾乎完全抑制作用。圖15.skov3ip.1異種移植模型中轉移的抑制作用。在上部兩個圖形中，同一數(shù)據(jù)集以兩種不同方式提供以指示每個治療組中計數(shù)的轉移性病變的平均數(shù)目。同樣，下部兩個圖形也顯示同一數(shù)據(jù)集，這個數(shù)據(jù)集概述了從每個治療組中的小鼠切除的所有轉移的總重量。與陰性對照e59r/t77r-fc相比，野生型axl-fc抑制轉移的擴散，如病變數(shù)目(上圖)以及總重量(下圖)的減少所指示。axls6-1-fc顯示與野生型axl-fc和axle59r/t77r-fc相比腫瘤負荷顯著減少，如通過病變數(shù)目(上圖)以及總重量(下圖)所評估。這些數(shù)據(jù)表明增強的axls6-1親和力提供與野生型相比改進的治療功效，且axls6-1-fc是用于管理轉移的可行性治療。具體實施方式定義在以下描述中，廣泛利用在細胞培養(yǎng)領域中慣用的多個術語。為了對本說明書和權利要求書以及將要賦予這些術語的范圍有清楚且一致的理解，提供以下定義。轉移性細胞的axl或其配體gas6的“抑制劑”、“活化劑”和“調節(jié)劑”分別用于指使用體外和體內測定針對受體或配體結合或信號傳導所識別的抑制、激活或調節(jié)分子，例如配體、受體、激動劑、拮抗劑和其同系物和模擬物。術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，是指氨基酸殘基的聚合物。這些術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應天然存在氨基酸的人工化學模擬物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在氨基酸聚合物和非天然存在氨基酸聚合物。術語“氨基酸”是指天然存在和合成氨基酸，以及以類似于天然存在氨基酸的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在氨基酸是由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及隨后進行修飾的氨基酸，例如羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指與天然存在氨基酸具有相同的基本化學結構，即.α碳結合于氫、羧基、氨基和r基團的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。此類類似物具有修飾過的r基團(例如正亮氨酸)或修飾過的肽骨架，但保持與天然存在氨基酸相同的基本化學結構。氨基酸模擬物是指具有與氨基酸的一般化學結構不同的結構，但以類似于天然存在氨基酸的方式起作用的化合物。本發(fā)明中用于表示氨基酸的所有單字母都是根據(jù)本領域中常規(guī)使用的公認氨基酸符號來使用，例如a意指丙氨酸，c意指半胱氨酸等。由相關位置之前和之后的單字母表示的氨基酸反映原始氨基酸(所述位置之前)改變?yōu)楦淖兒蟮陌被?位置之后)。例如，a19t意指19位的氨基酸丙氨酸改變?yōu)樘K氨酸。術語“受試者”、“個體”和“患者”在本文中可互換使用，是指正對治療進行評估和/或正接受治療的哺乳動物。在一實施方案中，哺乳動物是人。術語“受試者”、“個體”和“患者”因此涵蓋患有癌癥，包括不限于卵巢或前列腺的腺癌、乳癌、膠質母細胞瘤等的個體，包括已接受切除術(手術)以清除癌組織或為切除術(手術)候選者的個體。受試者可以是人，但也可包括其它哺乳動物，特別是適用作人類疾病的實驗室模型的哺乳動物，例如小鼠、大鼠等。本文所用的術語“腫瘤”是指所有贅生性細胞生長和增殖(無論惡性或良性)，以及所有癌前和癌細胞和組織。術語“癌癥”、“贅生物”和“腫瘤”在本文中可互換使用，是指細胞展現(xiàn)自主、未調節(jié)的生長，使得細胞展現(xiàn)異常生長表型，其特征在于顯著喪失對細胞增殖的控制。一般來說，本申請案中用于檢測、分析、分類或治療的相關細胞包括癌前(例如良性)、惡性、轉移前、轉移性和非轉移性細胞。癌癥的實例包括但不限于卵巢癌、膠質母細胞瘤、乳癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌、肝細胞癌、胃癌、胰腺癌、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、甲狀腺癌、腎癌、癌瘤、黑素瘤、頭頸癌和腦癌。癌癥的“病理學”包括所有危及患者健康的現(xiàn)象。這一病理學包括不限于異?；虿豢煽刂频募毎L、轉移、干擾相鄰細胞的正常功能、以異常水平釋放細胞因子或其它分泌產物、抑制或加重發(fā)炎或免疫反應、瘤形成、初癌、惡性腫瘤、侵襲周圍或遠端組織或器官(諸如淋巴結)等。本文所用的術語“癌癥復發(fā)”和“腫瘤復發(fā)”和其語法變體是指癌癥診斷后贅生性細胞或癌細胞的進一步生長。具體而言，復發(fā)可在癌組織中存在進一步癌細胞生長時發(fā)生?！澳[瘤擴散”同樣在腫瘤細胞散布到局部或遠端組織和器官中時發(fā)生；因此，腫瘤擴散涵蓋腫瘤轉移。“腫瘤侵襲”在腫瘤生長局部擴散開以通過壓迫、破壞或妨礙正常器官功能危及受累組織的功能時發(fā)生。本文所用的術語“轉移”是指癌性腫瘤在未與原始癌性腫瘤的器官直接連接的器官或身體部分中的生長。轉移應理解為包括微轉移，微轉移是未直接連接于原始癌性腫瘤的器官的器官或身體部分中存在不可檢測的量的癌細胞。轉移也可定義為進程的若干步驟，諸如癌細胞從原始腫瘤位點偏離，和癌細胞遷移到和/或侵襲身體其它部分。因此，本發(fā)明預期一種確定未直接連接于原始癌性腫瘤的器官的器官或身體部分中一個或多個癌性腫瘤的進一步生長風險的方法，和/或導致這種生長的進程中的任何步驟。根據(jù)癌癥的性質，獲得適當患者樣品。本文所用的短語“癌組織樣品”是指從癌性腫瘤獲得的任何細胞。就還未轉移的實體腫瘤而言，將通常由手術清除的腫瘤獲得組織樣品且準備通過常規(guī)技術進行測試。該定義涵蓋生物學來源的血液和其它液體樣品、實體組織樣品，例如活檢標本或組織培養(yǎng)物或源于其的細胞和其后代。該定義還包括已在獲得后以任何方式操作，諸如用試劑處理、經過洗滌或富集某些細胞群體(諸如癌細胞)的樣品。該定義還包括已富集特定分子類型(例如核酸、多肽等)的樣品。術語“生物樣品”涵蓋臨床樣品，并且還包括通過手術切除術獲得的組織、通過活檢獲得的組織、培養(yǎng)的細胞、細胞上清液、細胞裂解液、組織樣品、器官、骨髓、血液、血漿、血清等?！吧飿悠贰卑◤幕颊叩陌┘毎@得的樣品，例如從患者的癌細胞獲得的包含多核苷酸和/或多肽的樣品(例如細胞裂解液或包含多核苷酸和/或多肽的其它細胞提取物)；和來自患者的包含癌細胞的樣品。來自患者的包含癌細胞的生物樣品也可包括非癌細胞。術語“診斷”在本文中用于指識別分子或病理狀態(tài)、疾病或病況，諸如識別乳癌、前列腺癌或其它癌癥類型的分子亞型。術語“預后”在本文中用于指預計癌癥可造成的死亡或進展(包括復發(fā)、轉移性擴散和藥物抗性)、贅生性疾病(諸如卵巢癌)的可能性。術語“預計”在本文中用于指基于觀察、經驗或科學推理進行預測或估計的行為。在一個實例中，醫(yī)師可預計在手術清除原發(fā)性腫瘤和/或化學療法后一段時間內無癌癥復發(fā)時患者存活的可能性。本文所用的術語“治療”及類似用語是指施用藥劑或進行操作(例如放射、手術操作等)以獲得效果。所述效果就完全或部分預防疾病或其癥狀來說可以是預防性的，和/或就實現(xiàn)疾病和/或疾病癥狀的部分或完全治愈來說可以是治療性的。本文所用的“治療”涵蓋哺乳動物(特別是人)體內任何轉移性腫瘤的任何治療，并且包括：(a)預防疾病或疾病癥狀在可傾向于患有所述疾病但尚未診斷出患有所述疾病(例如包括可與原發(fā)性疾病有關或由原發(fā)性疾病引起的疾病)的受試者中發(fā)生；(b)抑制疾病，即使其發(fā)展停滯；和(c)減輕疾病，即使疾病消退。在腫瘤(例如癌癥)治療中，治療劑可直接減少腫瘤細胞的轉移。治療可指成功治療或改善或預防癌癥的任何指標，包括任何客觀或主觀參數(shù)，諸如緩和；緩解；減少癥狀或使疾病病況更能為患者所忍受；減慢退化或衰退速率；或使退化終點較弱。癥狀的治療或改善可基于客觀或主觀參數(shù)；包括醫(yī)師檢查結果。因此，術語“治療”包括施用本發(fā)明化合物或藥劑以預防或延遲、減輕或停滯或抑制與瘤形成相關的癥狀或病況(例如腫瘤或癌癥)的發(fā)展。術語“治療作用”是指減輕、消除或預防受試者的疾病、疾病癥狀或疾病副作用。在某些實施方案中，“與……組合”、“組合療法”和“組合產物”是指對患者并行施用第一治療劑和本文所用的化合物。當組合施用時，各組分可同時或在不同時間點以任何順序相繼施用。因此，各組分可分別施用，但時間充分接近以便提供所需治療作用。根據(jù)本發(fā)明，第一治療劑可為任何適合的治療劑，例如細胞毒劑。細胞毒劑的一個示例性種類是化學治療劑，例如它們可與治療組合以抑制axl或gas6信號傳導。示例性化學治療劑包括但不限于阿地白介素(aldesleukin)、六甲蜜胺(altretamine)、氨磷汀(amifostine)、天冬酰胺酶、博來霉素(bleomycin)、卡培他濱(capecitabine)、卡波鉑(carboplatin)、卡氮芥(carmustine)、克拉屈濱(cladribine)、西沙必利(cisapride)、順鉑、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷(cytarabine)、氮烯咪胺(dacarbazine，dtic)、放線菌素d(dactinomycin)、多西他賽(docetaxel)、阿霉素(doxorubicin)、屈大麻酚(dronabinol)、倍癌霉素(duocarmycin)、阿法依泊汀(epoetinalpha)、依托泊苷(etoposide)、非格司亭(filgrastim)、氟達拉濱(fludarabine)、氟尿嘧啶、吉西他濱(gemcitabine)、格拉司瓊(granisetron)、羥基脲、伊達比星(idarubicin)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、干擾素α(interferonalpha)、伊立替康(irinotecan)、蘭索拉唑(lansoprazole)、左旋咪唑(levamisole)、甲酰四氫葉酸(leucovorin)、甲地孕酮(megestrol)、美司鈉(mesna)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲氧氯普胺(metoclopramide)、絲裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奧美拉唑(omeprazole)、恩丹西酮(ondansetron)、紫杉醇(paclitaxel，taxoltm)、毛果蕓香堿(pilocarpine)、普魯氯嗪(prochloroperazine)、利妥昔單抗(rituximab)、肥皂草素(saproin)、他莫西芬(tamoxifen)、紫衫酚(taxol)、鹽酸拓撲替康(topotecanhydrochloride)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、長春花堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)和酒石酸長春瑞濱(vinorelbinetartrate)。對于卵巢癌治療，可與axl或gas6信號傳導抑制劑組合的優(yōu)選化學治療劑是紫杉醇(taxoltm)。其它組合療法是放射、手術和激素剝奪(kwon等,proc.natl.acad.sciu.s.a.,96:15074-9,1999)。血管生成抑制劑也可與本發(fā)明方法組合。已知癌癥治療藥物與本發(fā)明藥物組合物的“相伴施用”意指在使得已知藥物與本發(fā)明組合物均具有治療作用的時間施用所述藥物與axl抑制劑。所述相伴施用可包括相對于本發(fā)明化合物的施用并行(即同時)、預先或隨后施用所述藥物。本領域技術人員將不難確定施用特定藥物和本發(fā)明組合物的適當時間選擇、順序和劑量。本文所用的短語“無疾病存活”是指缺乏此類腫瘤復發(fā)和/或擴散，和診斷后患者的命運(關于癌癥對患者壽命的影響)。短語“總體存活”是指診斷后患者的命運，即使患者死因可能不是直接由癌癥影響引起。短語“無疾病存活的可能性”、“復發(fā)風險”和其變體是指癌癥診斷后患者體內腫瘤復發(fā)或擴散的概率，其中所述概率是根據(jù)本發(fā)明方法確定。本文所用的術語“相關”或“與……相關”和類似術語是指兩個事件的情形之間的統(tǒng)計關聯(lián)，其中事件包括數(shù)字、數(shù)據(jù)集等。例如，當事件涉及數(shù)字時，正相關(本文中也稱作“直接相關”)意指隨著一個數(shù)字增加，另一數(shù)字也增加。負相關(本文中也稱作“逆相關”)意指隨著一個數(shù)字增加，另一數(shù)字減少。“劑量單位”是指適合作為單位劑量用于欲治療的特定個體的物理上分立的單元。各單元可含有預定量的活性化合物，所述量經過計算以與所需藥物載體聯(lián)合產生所要治療作用。關于劑量單位形式的規(guī)格可取決于(a)活性化合物的獨特特征和要實現(xiàn)的特定治療作用，和(b)本領域中混配所述活性化合物所固有的限制?！八帉W上可接受的賦形劑”意指適用于制備藥物組合物的通常是安全、無毒和合乎需要的賦形劑，且包括可接受用于獸醫(yī)學使用以及人類藥物使用的賦形劑。所述賦形劑可為固體、液體、半固體或在氣霧劑組合物的情形下為氣態(tài)?！八帉W上可接受的鹽和酯”意指藥學上可接受且具有所需藥理學性質的鹽和酯。此類鹽包括其中化合物中存在的酸性質子能夠與無機或有機堿反應而可形成的鹽。適合的無機鹽包括由堿金屬(例如鈉和鉀、鎂、鈣和鋁)形成的鹽。適合的有機鹽包括由有機堿，諸如胺堿(例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、緩血酸胺、n甲基葡糖胺等)形成的鹽。此類鹽也包括由無機酸(例如鹽酸和氫溴酸)和有機酸(例如乙酸、檸檬酸、順丁烯二酸，以及烷烴-和芳烴-磺酸，諸如甲烷磺酸和苯磺酸)形成的酸加成鹽。藥學上可接受的酯包括由化合物中存在的羧基、磺酰氧基和膦酰氧基形成的酯，例如c1-6烷基酯。當存在兩個酸性基團時，藥學上可接受的鹽或酯可為單酸-單鹽或酯，或二鹽或酯；且類似地，當存在兩個以上酸性基團時，此類基團中的一些或全部可鹽化或酯化。本發(fā)明中所命名的化合物可以未鹽化或未酯化形式存在，或以鹽化和/或酯化形式存在，且此類化合物的命名意圖包括原始(未鹽化和未酯化)化合物和其藥學上可接受的鹽和酯。另外，本發(fā)明中所命名的某些化合物可以一種以上立體異構形式存在，且所述化合物的命名意圖包括所有單一立體異構體和此類立體異構體的所有混合物(外消旋或其它形式)。術語“藥學上可接受的”、“生理學上可耐受的”和其語法變體在指組合物、載體、稀釋劑和試劑時可互換使用且表示這些物質能夠對人施用或施用于人體，而不會產生將禁止施用所述組合物程度的不利生理效應?！爸委熡行Я俊币庵府斒┯糜谑茉囌咭灾委熂膊r足以治療所述疾病的量。詳述根據(jù)本發(fā)明，其提供可溶性axl變體，例如與gas6的結合活性基本上等于或優(yōu)于野生型axl多肽的結合活性的可溶性axl變體多肽。在本發(fā)明的一些實施方案中，將可溶性axl變體多肽用作治療劑。axl蛋白(參考天然序列seqidno:1)包含來自殘基27-128的免疫球蛋白(ig)樣域、來自殘基139-222的第二ig樣域、來自殘基225-332和333-427的纖連蛋白3型域、來自殘基473-894的胞內域(包括酪氨酸激酶域)。779、821和866處的酪氨酸殘基在受體二聚時自體磷酸化且充當胞內信號傳導分子的停泊位點。用以釋放可溶形式的多肽的天然裂解位點位于殘基437-451處。出于本發(fā)明的目的，可溶形式的axl是多肽中足夠以可識別的親和力(例如高親和力)結合gas6的部分，其通常位于信號序列與跨膜域之間，即一般來自約seqidno:1的殘基19-437，但其可包含從約殘基19、25、30、35、40、45、50到約殘基132、450、440、430、420、410、400、375、350到321(例如殘基19-132)的截短型式或主要由所述截短型式組成。在一些實施方案中，可溶形式的axl缺乏跨膜域且任選地缺乏胞內域。本發(fā)明的可溶性axl變體多肽(saxl變體)包括一個或多個在可溶形式的野生型axl內的氨基酸修飾，例如一個或多個增加其對gas6的親和力的氨基酸修飾。根據(jù)本發(fā)明，氨基酸修飾包括本領域中已知或以后發(fā)現(xiàn)的任何天然存在或人造氨基酸修飾。在一些實施方案中，氨基酸修飾包括任何天然存在的突變，例如取代、缺失、添加、插入等。在一些其它實施方案中，氨基酸修飾包括用另一氨基酸(例如，現(xiàn)有氨基酸的保守等效物)置換現(xiàn)有氨基酸。在一些其它實施方案中，氨基酸修飾包括用非天然氨基酸置換一個或多個現(xiàn)有氨基酸，或插入一個或多個非天然氨基酸。在一些其它實施方案中，氨基酸修飾包括至少1、2、3、4、5或6或10個氨基酸突變或改變。在一些示例性實施方案中，一個或多個氨基酸修飾可用于改變可溶形式的axl的性質，例如影響穩(wěn)定性、結合活性和/或特異性等。對克隆基因進行體外誘變的技術是已知的。用于掃描突變的方案的實例可見于gustin等,biotechniques14:22(1993)；barany,gene37:111-23(1985)；colicelli等,molgengenet199:537-9(1985)；和prentki等,gene29:303-13(1984)。用于位點特異性誘變的方法可見于sambrook等,molecularcloning:alaboratorymanual,cshpress1989,第15.3-15.108頁；weiner等,gene126:35-41(1993)；sayers等,biotechniques13:592-6(1992)；jones和winistorfer,biotechniques12:528-30(1992)；barton等,nucleicacidsres18:7349-55(1990)；marotti和tomich,geneanaltech6:67-70(1989)；和zhuanalbiochem177:120-4(1989)。在一些實施方案中，本發(fā)明的saxl變體包括在野生型axl(seqidno:1)的殘基18到130、殘基10到135、殘基15到45、殘基60到65、殘基70到80、殘基85到90、殘基91到99、殘基104到110、殘基111到120、殘基125到130、殘基19到437、殘基130到437、殘基19到132、殘基21到132、殘基21到121、殘基26到132或殘基26到121的一個或多個區(qū)域中的一個或多個氨基酸修飾。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的saxl變體包括一個或多個在野生型axl(seqidno:1)的殘基20到130、殘基37到124或殘基141到212中的一個或多個區(qū)域中的氨基酸修飾。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的saxl變體包括在野生型axl(seqidno:1)的19、23、26、27、32、33、38、44、61、65、72、74、78、79、86、87、88、90、92、97、98、105、109、112、113、116、118、127或129位的一個或多個位置處的一個或多個氨基酸修飾。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的saxl變體包括一個或多個氨基酸修飾，包括但絕不限于1)a19t，2)t23m，3)e26g，4)e27g或e27k，5)g32s，6)n33s，7)t38i，8)t44a，9)h61y，10)d65n，11)a72v，12)s74n，13)q78e，14)v79m，15)q86r，16)d87g，17)d88n，18)i90m或i90v，19)v92a、v92g或v92d，20)i97r，21)t98a或t98p，22)t105m，23)q109r，24)v112a，25)f113l，26)h116r，27)t118a，28)g127r或g127e和29)e129k及其組合。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的saxl變體包括在野生型axl(seqidno:1)的32、87、92或127位的一個或多個氨基酸修飾或其組合，例如g32s；d87g；v92a和/或g127r。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的saxl變體包括在野生型axl(seqidno:1)的26、79、92、127位的一個或多個氨基酸修飾或其組合，例如e26g、v79m；v92a和/或g127e。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的saxl變體可進一步被修飾，例如接合于多種其它寡肽或蛋白質以達成多種目的。例如，可關于本發(fā)明的saxl變體進行各種翻譯后或表達后修飾。例如，通過采用適當編碼序列，可提供法尼基化或異戊烯化。在一些實施方案中，本發(fā)明的saxl變體可聚乙二醇化，其中聚氧乙烯基使得血流中的使用期增加。本發(fā)明的saxl變體也可與其它蛋白(諸如igg同型的fc，其可與補體結合)、與毒素(諸如篦麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素等)或與允許靶向靶細胞上的特異性部分的特異性結合劑組合。在一些實施方案中，本發(fā)明的saxl變體是融合蛋白，例如與第二多肽框內融合。在一些實施方案中，第二多肽能夠增加融合蛋白的尺寸，例如使得融合蛋白將不會從循環(huán)中快速清除。在一些其它實施方案中，第二多肽是fc區(qū)的一部分或全部。在一些其它實施方案中，第二多肽是實質上類似于fc的任何適合多肽，例如提供增加的尺寸和/或與ig分子的額外結合或相互作用。在一些其它實施方案中，第二多肽是白蛋白的一部分或全部，例如人血清白蛋白。在一些其它實施方案中，第二多肽適用于處理saxl變體(例如純化saxl變體)或增加saxl變體的體外或體內穩(wěn)定性。例如，本發(fā)明的saxl變體可與免疫球蛋白(igg)的恒定域的部分組合，產生嵌合或融合多肽。這些融合蛋白有助于純化且顯示增加的體內半衰期。一個已報道的實例描述了由人cd4-多肽的前兩個域和哺乳動物免疫球蛋白重鏈或輕鏈的恒定區(qū)的多個域組成的嵌合蛋白。epa394,827；traunecker等,nature,331:84-86,1988。與單獨單體形式的分泌蛋白或蛋白片段相比，具有二硫鍵連接的二聚結構的融合蛋白(由于igg)也可更高效結合和中和其它分子。fountoulakis等,j.biochem.270:3958-3964,1995。在一些其它實施方案中，第二多肽是標記序列，諸如有助于純化融合多肽的肽。例如，標記氨基酸序列可為六組氨酸肽，諸如pqe載體(qiagen,inc.,9259etonavenue,chatsworth,calif.,91311)中提供的標簽等，其中一些可商購獲得。如gentz等,proc.natl.acad.sci.usa86:821-824,1989中所述，例如，六組氨酸便利于純化融合蛋白。另一適用于純化的肽標簽(“ha”標簽)對應于來源于流感血凝素蛋白的表位。wilson等,cell37:767,1984。在一些其它實施方案中，第二多肽是適用于改進本發(fā)明的saxl變體的特征的實體。例如，額外氨基酸(特別是帶電氨基酸)的區(qū)域可添加到多肽的n末端以改進從宿主細胞純化或后續(xù)處理和儲存期間的穩(wěn)定性和持久性。另外，肽部分可添加到本發(fā)明的saxl變體中以有助于純化，且隨后去除，接著最終制備多肽。有助于處理多肽的肽部分的添加是本領域中所熟悉的常規(guī)技術。在另一些實施方案中，本發(fā)明的saxl變體與gas6的結合活性至少等于或優(yōu)于野生型axl。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的saxl變體與gas6的結合活性或親和力比野生型axl的結合活性或親和力大至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或6倍。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的saxl變體與gas6的結合活性或親和力為至少約1×10-6、1×10-7、1×10-8或1×10-9m。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的saxl變體能夠抑制、抑制或競爭野生型axl與gas6在體內、體外或體內和體外的結合。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的saxl變體抑制或競爭如本申請案實例2中所提供的axls6-1、axls6-2和/或axls6-5的結合。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的saxl變體抑制或競爭本申請案實例2中所提供的任何saxl變體的結合。分子結合于gas6的能力可例如通過假定配體結合于測定板上所涂布的gas6的能力來確定。在一個實施方案中，本發(fā)明的saxl變體與gas6的結合活性可通過固定配體(例如gas6)或saxl變體來測定。例如，所述測定可包括將融合于his標簽的gas6固定于ni激活的nta樹脂珠粒。試劑可添加于適當緩沖液中且珠粒在既定溫度下孵育一段時間。在洗滌去除未結合的材料后，結合的蛋白可用例如sds、具有高ph值的緩沖液等釋放且加以分析。在其它實施方案中，本發(fā)明的saxl變體的熱穩(wěn)定性優(yōu)于野生型axl的熱穩(wěn)定性。在一些實施方案中，本發(fā)明的saxl變體的熔融溫度比野生型axl的熔融溫度高至少5℃、10℃、15℃或20℃。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的saxl變體也可包括一個或多個不改變本發(fā)明的saxl變體的一級序列的修飾。例如，此類修飾可包括多肽的化學衍生化，例如乙?；Ⅴ０坊?、羧化等。此類修飾也可包括糖基化修飾，例如通過在多肽的合成和加工期間或在其它加工步驟中修飾多肽的糖基化模式所產生的修飾；例如，通過將多肽暴露于影響糖基化的酶(諸如哺乳動物糖基化或去糖基化酶)所產生的修飾。在一些實施方案中，本發(fā)明的saxl變體包括具有磷酸化氨基酸殘基的saxl變體，例如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的saxl變體包括如下saxl變體，其進一步被修飾以改進其對蛋白水解性降解的抗性或優(yōu)化穩(wěn)定性質或使其更適合作為治療劑。例如，本發(fā)明的saxl變體進一步包括含有不同于天然存在l-氨基酸的殘基(例如d-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸)的saxl變體類似物。d-氨基酸可取代一些或所有氨基酸殘基。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的saxl變體包括至少兩個共價或非共價連接的相同或不同saxl變體。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的saxl變體包括兩個、三個、四個、五個或六個共價連接的相同或不同saxl變體，例如使得其將具有適當尺寸，但能避免不需要的聚集。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的saxl變體可通過本領域中已知或以后發(fā)現(xiàn)的任何適合方式產生，例如由真核細胞或原核細胞產生，體外合成等。當所述蛋白是由原核細胞產生時，其可通過解折疊(例如熱變性、dtt還原等)進一步加工且可進一步使用本領域中已知的方法再折疊。所述多肽可通過體外合成，使用本領域中已知的常規(guī)方法來制備。各種商業(yè)合成裝置均可用，例如由appliedbiosystems,inc.(fostercity,ca,beckman)提供的自動化合成器等。通過使用所述合成器，天然存在的氨基酸可被非天然氨基酸取代。特定序列和制備方法將根據(jù)便利性、經濟學、所需純度等確定。所述多肽也可根據(jù)常規(guī)重組合成方法分離和純化?？芍苽浔磉_宿主的裂解液且可使用hplc、排阻色譜法、凝膠電泳、親和色譜法或其它純化技術純化裂解液。在大多數(shù)情況下，所用組合物相對于與產物制備方法和其純化有關的污染物而言將包含至少20重量％的所需產物，更通常將包含至少約75重量％的所需產物、優(yōu)選至少約95重量％的所需產物，并且為了治療目的，通常將包含至少約99.5重量％的所需產物。通常，這些百分比將基于總蛋白。本領域技術人員熟知的方法可用于構建含有編碼序列和適當轉錄/翻譯控制序列的表達載體。這些方法包括例如體外重組dna技術、合成技術和體內重組/遺傳重組。或者，能夠編碼相關多肽的rna可化學合成。本領域技術人員可容易地利用熟知的密碼子使用表和合成方法來提供任何本發(fā)明多肽的適合編碼序列。直接化學合成方法包括例如磷酸三酯方法，narang等，(1979)meth.enzymol.68:90-99；磷酸二酯方法，brown等，(1979)meth.enzymol.68:109-151；二乙基亞磷酰胺方法，beaucage等，(1981)tetra.lett.,22:1859-1862；和固體支撐方法，美國專利第4,458,066號?；瘜W合成產生單鏈寡核苷酸。它可通過與互補序列雜交，或通過使用單鏈作為模板與dna聚合酶聚合而轉化為雙鏈dna。雖然dna化學合成通常限于約100個堿基的序列，但較長序列可通過較短序列的接合而獲得?；蛘?，可克隆子序列且可使用適當限制酶裂解適當子序列。核酸可以相當高的純度分離和獲得。通常，獲得的核酸(dna或rna形式)將基本上不含其它天然存在的核酸序列，一般為至少約50％純，通常為至少約90％純且通常為“重組的”，例如側接一個或多個在天然存在染色體上通常未締合的核苷酸。本發(fā)明核酸可以線性分子形式或在環(huán)狀分子內提供，且可在自主復制分子(載體)內或在不含復制序列的分子內提供。核酸的表達可自主調節(jié)或由本領域中已知的其它調節(jié)序列調節(jié)?？墒褂帽绢I域中可用的多種技術，諸如轉鐵蛋白聚陽離子介導的dna轉移、用裸核酸或封裝的核酸轉染、脂質體介導的dna轉移、dna涂布的乳膠珠粒的胞內轉運、原生質體融合、病毒感染、電穿孔、基因槍、磷酸鈣介導的轉染等將本發(fā)明的核酸引入適合的宿主細胞中。在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于一種或多種本發(fā)明的saxl變體的體外或體內表達的表達載體，這些載體為組成性的或在一個或多個調節(jié)元件的控制下。在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含一種或多種用于表達本發(fā)明的saxl變體的表達載體(組成性或在一個或多個調節(jié)元件的控制下)的細胞群體。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，其提供特異性結合于gas6蛋白的分離的抗體或其片段。gas6(生長停滯特異6)在結構上屬于血漿維生素k依賴性蛋白家族。gas6與天然抗凝劑蛋白s具有高結構同源性，共享相同模塊組成且具有40％序列同一性。gas6由于與tam家族受體酪氨酸激酶(tyro3、axl和mertk)相互作用而具有生長因子樣性質。人gas6是由介導結合于磷脂膜的富含γ-羧基谷氨酸(gla)的域、四個表皮生長因子樣域和兩個層粘連蛋白g樣(lg)域組成的678個氨基酸的蛋白。人gas6的轉錄變體的序列可分別以nm_001143946.1、nm_001143945.1和nm_000820.2在genbank登錄。gas6采用獨特的作用機制，通過其維生素k依賴性gla(γ-羧基谷氨酸)模塊與含有磷脂酰基絲氨酸的膜相互作用且通過其羧基末端lamg域與tam膜受體相互作用。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的分離的抗體包括對gas6具有可識別的結合特異性的任何分離的抗體。在一些實施方案中，分離的抗體是部分或完全人源化抗體。在一些其它實施方案中，分離的抗體是單克隆或多克隆抗體。在一些其它實施方案中，分離的抗體是嵌合抗體，例如具有來自不同來源的一致區(qū)、可變區(qū)和/或cdr3或其組合。在一些其它實施方案中，分離的抗體是本文所述各種特征的組合。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的分離的抗體的片段包括含有足以提供多肽對gas6的可識別的特異性結合或所述結合所必需的抗體區(qū)域(在抗體支架或非抗體支架的情形下)的多肽。在一些實施方案中，本發(fā)明的分離的抗體的片段包括可變輕鏈、可變重鏈、重鏈或輕鏈的一個或多個cdr或其組合，例如fab、fv等。在一些實施方案中，本發(fā)明的分離的抗體的片段包括含有單鏈抗體(例如scfv)的多肽。在另一些實施方案中，本發(fā)明的分離的抗體的片段包括單獨可變區(qū)或可變區(qū)與fc區(qū)的部分(例如ch1區(qū))的組合。在另一些實施方案中，本發(fā)明的分離的抗體的片段包括微抗體(例如vl-vh-ch3)或雙功能抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明的分離的抗體結合于與axl相互作用的一個或多個氨基酸區(qū)域所包含或提供的表位。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的分離的抗體結合于gas6的一個或多個氨基酸區(qū)域(例如gas6的l295-t317、e356-p372、r389-n396、d398-a406、e413-h429和w450-m468)所包含或提供的表位。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的分離的抗體結合于一個或多個氨基酸區(qū)域，例如lrmfsgtpvirlrfkrlqpt(seqidno:3)、eivgrvtssgp(seqidno:4)、rnlvikvn(seqidno:5)、davmkiava(seqidno:6)、erglyhlnltvgipfh(seqidno:7)和wlngedttiqetvvnrm(seqidno:8)所包含或提供的表位。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的分離的抗體結合于gas6的l295-t317、e356-p372、r389-n396、d398-a406、e413-h429和w450-m468中的區(qū)域中的至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個氨基酸所包含或提供的表位。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的分離的抗體結合于lrmfsgtpvirlrfkrlqpt(seqidno:3)、eivgrvtssgp(seqidno:4)、rnlvikvn(seqidno:5)、davmkiava(seqidno:6)、erglyhlnltvgipfh(seqidno:7)和wlngedttiqetvvnrm(seqidno:8)的區(qū)域中的至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個氨基酸所包含或提供的表位。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的分離的抗體能夠抑制、抑制或競爭野生型axl或本發(fā)明的saxl變體與gas6之間的結合。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的saxl變體和分離的抗體均可在適合治療用途(例如人類治療)的藥物組合物中提供。在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包括一個或多個本發(fā)明的治療實體，例如針對gas6的saxl變體和/或分離的抗體或其藥學上可接受的鹽、酯或溶劑化物或其任何前藥。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包括一個或多個本發(fā)明的治療實體與另一細胞毒劑(例如另一抗腫瘤劑)的組合。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包括一個或多個本發(fā)明的治療實體與另一藥學上可接受的賦形劑的組合。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的治療實體通常以包含活性治療劑，即，和多種其它藥學上可接受的組分的藥物組合物形式施用。(參見remington'spharmaceuticalscience,第15版,mackpublishingcompany,easton,pa.,1980)。優(yōu)選形式取決于預期的施用模式和治療應用。根據(jù)所需制劑，所述組合物也可包括藥學上可接受的無毒載體或稀釋劑，這些載體或稀釋劑是定義為通常用于配制供動物或人類施用的藥物組合物的媒介物。所選稀釋劑不應影響組合的生物活性。所述稀釋劑的實例是蒸餾水、生理學磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏溶液(ringer'ssolution)、右旋糖溶液和漢克氏溶液(hank'ssolution)。另外，所述藥物組合物或制劑也可包括其它載體、佐劑或無毒、非治療性、非免疫原性穩(wěn)定劑等。在一些其它實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物也可包括大的緩慢代謝的大分子，諸如蛋白質、多糖(諸如殼聚糖)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(諸如乳膠官能化sepharosetm、瓊脂糖、纖維素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂質聚集體(諸如油滴或脂質體)。另外，這些載體可充當免疫刺激劑(即佐劑)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，其提供通過抑制axl信號傳導途徑和/或gas6信號傳導途徑來治療、減輕或預防腫瘤轉移或腫瘤侵襲的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明方法包括抑制axl活性、gas6活性或axl與gas6之間的相互作用。例如，axl或gas6活性可在基因表達水平、mrna加工水平、翻譯水平、翻譯后水平、蛋白激活水平等方面受到抑制。在一些其它實例中，axl或gas6活性可由小分子、生物分子(例如多肽)、多核苷酸、抗體、抗體藥物綴合物等抑制。在一些其它實例中，axl或gas6活性可由一個或多個本發(fā)明的saxl變體或分離的抗體抑制。在其它實施方案中，本發(fā)明方法包括對需要治療的受試者施用治療有效量或有效劑量的本發(fā)明的治療實體，例如axl活性或gas6活性抑制劑或axl與gas6之間相互作用的抑制劑。在一些實施方案中，本文所述的例如用于治療轉移性癌癥的本發(fā)明治療實體的有效劑量視多種不同因素而變，這些因素包括施用方式、靶位點、患者的生理狀態(tài)(無論患者為人或動物)、施用的其它藥物，以及治療是預防性的還是治療性的。通常，患者是人，但也可治療包括轉基因哺乳動物的非人類哺乳動物。治療劑量需要用滴定法測量以優(yōu)化安全性和功效。在一些實施方案中，劑量可在約0.0001到100mg/kg宿主體重的范圍內且更通常在0.01到5mg/kg宿主體重的范圍內。例如，劑量可為1mg/kg體重或10mg/kg體重或在1-10mg/kg的范圍內。一示例性治療方案需要每兩周施用一次或一個月施用一次或每3到6個月施用一次。本發(fā)明的治療實體通常在多種時機施用。單一劑量之間的時間間隔可為每周、每月或每年。時間間隔也可為無規(guī)律的，如通過測量患者體內治療實體的血液水平所指示。或者，本發(fā)明的治療實體可以持續(xù)釋放制劑形式施用，在所述情形下需要不太頻繁的施用。劑量和頻率視患者體內多肽的半衰期而變。在預防性應用中，在較長一段時間內以較低頻率的時間間隔施用較低劑量。一些患者在其余生中繼續(xù)接受治療。在治療性應用中，有時需要以相對較短的時間間隔施用相對較高劑量，直到疾病進展減慢或終止，且優(yōu)選直到患者顯示疾病癥狀的部分或完全改善。因此，可對患者施用預防性方案。在其它實施方案中，本發(fā)明方法包括治療、減輕或預防卵巢癌、乳癌、肺癌、肝癌、結腸癌、膽囊癌、胰腺癌、前列腺癌和/或膠質母細胞瘤的腫瘤轉移或腫瘤侵襲。在一些其它實施方案中，對于預防性應用，對易患疾病或病況或以其它方式處于疾病或病況風險中的患者施用藥物組合物或藥物，其量足以消除或降低所述風險、減輕嚴重性或延遲疾病(包括疾病的生物化學、組織和/或行為癥狀、其并發(fā)癥和在疾病發(fā)展期間呈現(xiàn)的中間病理表型)的開始。在一些其它實施方案中，對于治療性應用，對疑似或已經患有這類疾病的患者施用本發(fā)明的治療實體，其量足以治愈或至少部分停滯疾病的癥狀(生物化學、組織和/或行為，包括其并發(fā)癥和在疾病發(fā)展中呈現(xiàn)的中間病理表型)。適于實現(xiàn)治療或預防性治療的量是定義為治療或預防有效劑量。在預防性和治療性方案中，藥劑通常以若干種劑量施用直到已實現(xiàn)充分反應。通常，反應經過監(jiān)測，并且如果存在癌癥復發(fā)，則給予重復劑量。根據(jù)本發(fā)明，用于治療轉移性癌癥的組合物可通過腸胃外、局部、靜脈內、腫瘤內、口服、皮下、動脈內、顱內、腹膜內、鼻內或肌肉內方式施用。最典型的施用途徑是靜脈內或腫瘤內，不過其它途徑可同樣有效。對于腸胃外施用，本發(fā)明組合物可以物質于含有藥物載體的生理學上可接受的稀釋劑中的溶液或混懸液的可注射劑型施用，所述藥物載體可為無菌液體，諸如水、油、鹽水、甘油或乙醇。另外，例如濕潤劑或乳化劑、表面活性劑、ph緩沖物質等輔助物質可存在于組合物中。藥物組合物的其它組分是石油、動物、植物或合成起源的組分，例如花生油、大豆油和礦物油。一般說來，諸如丙二醇或聚乙二醇的二醇是優(yōu)選的液體載體，尤其對于可注射溶液。抗體可以貯存注射液或植入制劑的形式施用，所述貯存注射液或植入制劑可以允許持續(xù)釋放活性成分的方式進行配制。示例性組合物包含5mg/ml單克隆抗體，其在由50mml-組氨酸、150mmnacl組成的水性緩沖液(用hcl調節(jié)到ph6.0)中配制。組合物通常制備為呈液體溶液或混懸液形式的可注射物；也可制備適合在注射前溶解于或懸浮于液體媒介物中的固體形式。所述制劑也可乳化或封裝于脂質體或微粒子(諸如聚丙交酯、聚乙交酯或用于增強的佐劑效應的共聚物)中，如上文所論述。langer,science249:1527,1990和hanes,advanceddrugdeliveryreviews28:97-119,1997。本發(fā)明藥劑可以貯存注射液或植入制劑的形式施用，所述貯存注射液或植入制劑可以允許持續(xù)或脈動釋放活性成分的方式配制。適合其它施用模式的其它制劑包括口服、鼻內和肺用制劑、栓劑和透皮應用。對于栓劑，粘合劑和載體包括例如聚亞烷基二醇或甘油三酯；此類栓劑可由含有0.5％到10％范圍內、優(yōu)選1％-2％范圍內的活性成分的混合物形成?？诜苿┌ㄙx形劑，諸如藥品級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素和碳酸鎂。這些組合物采用溶液、混懸液、片劑、丸劑、膠囊、持續(xù)釋放制劑或散劑的形式且含有10％-95％、優(yōu)選25％-70％的活性成分。局部應用可引起透皮或皮內遞送?？赏ㄟ^共施用藥劑與霍亂毒素或其解毒衍生物或子單元來促進局部施用。glenn等,nature391:851,1998。共施用可通過以混合物形式或以通過化學交聯(lián)或表達為融合蛋白而獲得的連接分子的形式使用這些組分來實現(xiàn)?；蛘?，透皮遞送可使用皮膚貼片或使用傳遞體來實現(xiàn)。paul等,eur.j.immunol.25:3521-24,1995；cevc等,biochem.biophys.acta1368:201-15,1998。藥物組合物一般配制為無菌、基本上等滲的且完全遵從美國食品與藥物管理局(u.s.foodanddrugadministration)的所有良好制造規(guī)范(goodmanufacturingpractice，gmp)規(guī)章。優(yōu)選地，本文所述的抗體組合物的治療有效劑量將提供治療益處，而不引起實質毒性。本文所述蛋白質的毒性可通過標準藥物程序在細胞培養(yǎng)物或實驗動物中，例如通過測定ld50(群體50％致死的劑量)或ld100(群體100％致死的劑量)來測定。毒性作用與治療作用之間的劑量比是治療指數(shù)。從這些細胞培養(yǎng)物測定和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于配制用于人類時無毒的劑量范圍。本文所述蛋白質的劑量優(yōu)選位于循環(huán)濃度范圍內，這些濃度包括有效劑量而極少具有或不具有毒性。所述劑量可在這一范圍內視所用劑型和所用施用途徑而變。確切制劑、施用途徑和劑量可由個別醫(yī)師根據(jù)患者的病況加以選擇。(參見例如fingl等,1975,thepharmacologicalbasisoftherapeutics,第1章)。包含本發(fā)明組合物(例如可溶性axl變體和其制劑)和使用說明的試劑盒也在本發(fā)明的范圍內。所述試劑盒可進一步含有至少一種額外試劑。試劑盒通常包括指示試劑盒內容物的預期用途的標簽。術語標簽包括提供于試劑盒上或與試劑盒一起提供的任何書面或記錄材料，或其以其它方式隨附于試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，其提供通過檢測和/或測定來自相關受試者的生物樣品中axl活性或gas6活性的水平來確定腫瘤發(fā)生腫瘤侵襲和/或轉移的能力的方法。在一些實施方案中，axl活性或gas6活性的水平是由mrna表達水平、蛋白質表達水平、蛋白質激活水平或對應于axl或gas6活性的任何適合指標直接或間接測量。在一些實施方案中，生物樣品中axl活性或gas6活性的水平進一步與預定水平，例如通過基于來自未產生腫瘤侵襲或腫瘤轉移的腫瘤或來自正常組織的樣品群體建立axl活性或gas6活性的正常水平或范圍所獲得的標準水平相比較。例如，axl活性或gas6活性相較于預定水平或標準水平的增加指示腫瘤發(fā)生腫瘤侵襲或腫瘤轉移的傾向。本說明書中所引用的所有出版物和專利均以引用的方式并入本文，就如同明確且單獨地指出每個單獨出版物或專利以引用的方式并入一般，且以引用的方式并入本文以公開和描述這些出版物所引用的相關方法和/或材料。對任何出版物的引用均是針對其在申請日前的揭示內容且不應解釋為承認本發(fā)明無權先于根據(jù)先前發(fā)明的所述公布。此外，所提供的公布日期可不同于可需要獨立確認的實際公布日期。本領域技術人員在閱讀本發(fā)明時將顯而易見的是，本文所描述和說明的各個實施方案具有分立的組分和特征，這些組分和特征可容易地與其它若干實施方案中任一者的特征分離或與其組合，而不偏離本發(fā)明的范圍和精神。任何所陳述的方法均可以所陳述事件的順序或以邏輯上可能的任何其它順序進行。在下文中，將描述實例以說明本發(fā)明的各部分。實驗實例1axl信號傳導的治療性阻斷會抑制轉移性腫瘤進展但基本上還未研究證實axl為轉移性疾病的治療靶，且更重要的是尚未證實axl靶向的體內關聯(lián)。我們證實axl是人類乳癌和卵巢癌患者體內轉移的標志物，且這些患者體內疾病的嚴重性與原發(fā)性腫瘤中axl蛋白的量相關。最重要的是，我們證實腫瘤轉移可在具有預先存在的轉移的小鼠中通過施用可溶性axl胞外域來治療。在機理方面，抑制具有轉移性疾病的動物體內的axl信號傳導會導致侵襲和mmp活性降低。我們的發(fā)現(xiàn)表明，通過施用可溶性axl胞外域抑制腫瘤細胞中的axl信號傳導級聯(lián)足以抑制轉移性腫瘤進展。在這項研究中，測試axl是否為針對人類癌癥中的轉移的關鍵因子和axl信號傳導的治療性阻斷是否可為轉移性疾病的有效治療。我們利用遺傳和治療方法來直接評估axl在轉移性乳癌和卵巢癌的起始和進展中的作用。axl是人類癌癥中腫瘤進展和轉移的標志物。我們首先比較正常組織、來自乳癌或卵巢癌患者的原發(fā)性腫瘤和轉移中的axl表達。在100％的正常相鄰乳癌標本中，乳房上皮細胞顯示針對axl的擴散細胞質和細胞核染色，假定axl是膜結合受體，所述染色被認為是背景染色(n＝27，圖1a)。然而，在原發(fā)性乳房腫瘤中，腫瘤上皮中的膜axl染色在25％(1/4)的1級、76％(10/13)的2級和100％(18/18)的3級標本中存在(圖1a和表1)。另外，axl在88％(8/9)的淋巴結轉移中表達。在漿液性卵巢癌標本中，首先在正常卵巢表面上皮(ose)中檢查axl表達，因為大多數(shù)卵巢腫瘤被認為是源自這些細胞。在保持正常ose的卵巢癌患者樣品中，axl在0％(0/5)的標本中表達(圖1b)。相比之下，在原發(fā)性腫瘤上皮中的膜axl染色存在于66％(6/9)的ii期和83％(53/64)的iii期患者樣品中(圖1b和i)。另外，來自諸如網(wǎng)膜和腹膜等常見轉移性位點的腫瘤樣品顯示分別在75％(24/32)和90％(27/30)標本中的高axl表達(圖1b和表i)。這些發(fā)現(xiàn)表明原發(fā)性腫瘤中的axl表達與晚期疾病和轉移性腫瘤中所顯示的轉移相關。此外，這些數(shù)據(jù)顯示源自人類乳癌和卵巢癌的轉移表達高水平的axl。axl是針對腫瘤轉移的關鍵因子。為了檢查axl在轉移中的功能作用，我們利用遺傳方法來抑制乳房和卵巢轉移的小鼠模型中的axl。為此，我們篩檢一組人類乳癌和卵巢癌細胞系進行axl蛋白表達以便識別具有高axl表達水平的轉移性細胞系。類似于臨床發(fā)現(xiàn)，axl在大多數(shù)轉移性乳房(nci-adr-res、mda-231、hs578t、bt-549)和卵巢(skov3、ovcar-8、es-2、mesov、heya8)細胞系中高度表達，而axl在具有低轉移潛力的細胞系(mcf7、mda-mb435、t47d、igrov1、ovcar-3；圖9)中以不可檢測的量或低含量表達。axl缺陷型轉移性乳房(mda-231)和卵巢(skov3ip.1和ovcar-8)細胞系是使用先前所述的axlshrna靶向序列產生的。蛋白質印跡分析確認與表達scramble對照shrna靶向序列(shscrm，圖9b)的細胞相比，表達shaxl靶向序列的細胞表達少于5％的axl蛋白。為了直接評估axl在乳房腫瘤轉移的晚期的作用，注射axl-野生型(shscrm)和axl-缺陷型(shaxl)mda-231細胞到裸小鼠的尾靜脈中并且在第28天評價肺中的腫瘤負荷。肺的顯微鏡評價顯示，5只注射shrnascramble(shscrm)mda-231細胞的小鼠中的5只小鼠均產生轉移性病灶，這些病灶針對axl染色呈陽性(圖2a)。相比之下，5只注射shrnaaxl(shaxl)的小鼠中沒有一只小鼠在組織評價時產生肺轉移(圖2a)。為了量化這些小鼠的肺中的腫瘤負荷，我們針對人類gapdh進行實時pcr分析。圖2a表明，注射shscrmmda-231細胞的小鼠的肺表達高水平的人類gapdh，表明存在源自mda-231細胞的轉移性病變。此外，注射shscrm的小鼠在肺中表達人類axl，表明存在axl陽性腫瘤細胞(圖2a)。相比之下，注射shaxl腫瘤細胞的小鼠不在肺中表達人類gapdh或axl。這些發(fā)現(xiàn)表明，axl的遺傳失活足以完全抑制這一模型中肺轉移的形成。為了確定axl的遺傳失活是否影響卵巢癌細胞體內轉移的能力，使用卵巢癌的腹膜異種移植模型來比較shscrm和shaxlskov3ip.1細胞形成轉移的能力。這一模型再現(xiàn)了人類卵巢轉移的腹膜散布，其中小鼠在腹膜注射skov3ip.1細胞后快速產生進行性疾病，這一疾病由腹水和多于100個附著于腸系膜、隔膜、肝和其它腹膜表面的小的轉移性病變組成(圖3b)。skov3ip.1腹膜轉移中axl表達的免疫組織化學分析顯示，類似于人類卵巢轉移，axl在skov3ip.1轉移性病變中高度表達，表明這是用以研究axl在卵巢轉移中的作用(數(shù)據(jù)未顯示)的相關模型系統(tǒng)。在腹膜注射shscrm和shaxl細胞后28天，shscrm小鼠呈現(xiàn)嚴重腹水和發(fā)病的征兆，使得我們有必要處死小鼠且研究注射shscrm和shaxl的小鼠之間腫瘤負荷的改變。雖然注射shscrm細胞的小鼠發(fā)展腹水和超過100個腹膜轉移，但注射shaxl細胞的小鼠產生極少轉移(圖2b)。尺寸大于5mm的腹膜轉移的平均數(shù)目從注射shscrm的小鼠中的13.4+/-4.3顯著降到注射shaxl的小鼠中的0.8+/-0.5(圖2b)。同樣，這些腫瘤的平均重量從注射shscrm的小鼠中的236+/-74mg顯著降到注射shaxl的小鼠中的39.2+/-18mg(圖2b)。給予這些發(fā)現(xiàn)以支持的是，ovcar-8細胞中axl表達的敲低顯著抑制總的卵巢腹膜腫瘤質量和腫瘤數(shù)目(圖2c)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明axl是針對乳房和卵巢腫瘤轉移的關鍵因子?？紤]到axl在體內形成轉移中的重要作用，接下來我們設法確定axl是否特異性調節(jié)轉移，或axl是否在腫瘤細胞增殖和生長的調節(jié)中起到一般作用。為了解決這些問題，我們進行體外增殖測定，其中在10-14天時間內在axl野生型(shscrm)與axl缺陷型(shaxl)細胞之間對總細胞數(shù)計數(shù)。我們發(fā)現(xiàn)在shscrm與shaxlmda-231、skov3ip.1或ovcar-8細胞之間細胞生長曲線無顯著差異(圖3)。同樣，觀察到在shscrm與shaxl細胞之間常位mda-231或皮下skov3ip.1腫瘤生長無顯著差異(圖3)。這些發(fā)現(xiàn)表明，axl不為體內腫瘤細胞增殖或皮下生長所需?？傊覀兊陌l(fā)現(xiàn)表明axl特異性調節(jié)乳房和卵巢腫瘤中的腫瘤轉移。axl調節(jié)腫瘤細胞侵襲。為了確定axl介導的轉移的潛在機制，我們采用無偏差的方法且直接比較axl在與轉移級聯(lián)相關的關鍵細胞功能(包括增殖、侵襲、遷移、粘附和存活)中的作用。我們發(fā)現(xiàn)shaxlmda-231、skov3ip.1和ovcar-8細胞在通過i型膠原蛋白侵襲的能力方面嚴重受損(圖4a)。我們還觀察到shaxl細胞中細胞遷移的適度減少，但未能發(fā)現(xiàn)撤血清后粘附于ecm蛋白或存活方面的差異，表明axl主要影響轉移級聯(lián)中的侵襲。在分子水平上，mmp-9近期已被識鑒定為乳癌細胞中axl介導的侵襲的效應物。因此，我們研究mmp-9表達或活性是否也在axl缺陷型卵巢腫瘤細胞中改變。雖然skov3ip.1細胞不表達mmp-9，但我們發(fā)現(xiàn)mmp-2在這些細胞中高度表達且shaxl細胞中的mmp-2mrna顯著減少(圖4b)。mmp-2熒光素酶報告基因測定顯示，與shscrm細胞相比shaxl細胞中的mmp-2啟動子活性顯著降低，表明axl在轉錄水平下調節(jié)mmp-2(圖4c)。明膠酶譜法測定顯示，與shscrmskov3ip.1細胞相比shaxl細胞中分泌mmp-2的蛋白的水平顯著降低(圖4d)?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明axl在人類卵巢癌細胞中作為mmp-2表達和活性的上游調節(jié)子的作用。接下來我們設法說明axl介導的mmp-2表達中所涉及的信號傳導途徑。已報道由gas6激活axl以直接誘導包括pi3k、ras、mapk、src和plc在內的多種胞內信號傳導途徑。在這些途徑中，已證實pi3k信號傳導途徑可調節(jié)卵巢癌細胞中的mmp-2表達和侵襲。為了確定pi3k信號傳導是否受skov3ip.1細胞中axl損失影響，我們針對axl-野生型和axl-缺陷型skov3ip.1細胞中ser473處的磷酸化akt(p-akt)進行蛋白質印跡分析。我們發(fā)現(xiàn)與shscrmskov3ip.1細胞相比，顯著抑制shaxl細胞中的p-akt表達(圖4e)。另外，饑餓skov3ip.1細胞的gas6刺激引起pi3k依賴性誘導p-akt，因為用pi3k抑制劑ly294002治療會完全消除gas6誘導的p-akt表達(圖4e)。為了確定pi3k途徑是否牽涉于axl介導的mmp-2表達，我們在gas6和ly294002存在下進行mmp-2熒光素酶報告基因測定。gas6刺激后mmp-2啟動子活性的誘導完全由ly294002治療性阻斷，表明gas6/axl信號傳導通過pi3k信號傳導事件調節(jié)mmp-2表達(圖4f)。axl的治療抑制顯著抑制小鼠體內的轉移性腫瘤進展。我們的發(fā)現(xiàn)迄今表明axl是針對轉移的關鍵因子，且支持以下假設，即治療性阻斷可為轉移性疾病的有效治療。為了檢驗這一假設，我們利用可溶性axl胞外域作為抑制axl信號傳導的治療策略?？扇苄詀xl胞外域在功能上充當誘餌受體且先前已顯示體外和體內以納摩爾級親和力結合gas6(圖5a)。我們首先檢查用可溶性axl胞外域治療是否足以抑制轉移性腫瘤細胞中的axl信號傳導和侵襲。pi3k/akt信號傳導在多種細胞類型中由axl調節(jié)。發(fā)現(xiàn)pi3k/akt信號傳導在skov3ip.1細胞中由gas6/axl信號傳導調節(jié)且用可溶性axl胞外域(saxl)治療能夠減少gas6治療的skov3ip.1細胞中的pi3k/akt激活(圖5b和c)。同樣，用saxl治療膠原蛋白中的mda-231細胞足以急劇減少細胞侵襲，表明saxl治療影響體外axl信號傳導和侵襲(圖5d)。接下來我們檢查saxl治療是否將影響卵巢癌的高度轉移性模型中的轉移性腫瘤進展。我們首先在裸小鼠中確立skov3ip.1轉移性病變(第1天)且在確認肉眼可見的病變后在第7天開始用saxl治療。saxl療法是使用腺病毒系統(tǒng)遞送，在所述系統(tǒng)中，在注射后長達28天內肝釋放全身產生的saxl蛋白到小鼠血清中(圖6a)。在第28天對腫瘤負荷進行肉眼觀察分析，顯示與用fc對照療法治療的小鼠相比，接受saxl療法的小鼠的腫瘤負荷顯著(p<0.01)減少。在skov3ip.1腫瘤模型中，與fc治療的小鼠相比，用saxl治療的小鼠中的總腫瘤重量和腫瘤數(shù)目減少63％(圖6b)。同樣，在ovcar-8模型中，總腫瘤重量和腫瘤數(shù)目分別顯著減少47％和42％(圖11)。通過實時pcr分析檢查skov3ip.1腫瘤中的mmp2表達水平且發(fā)現(xiàn)與用fc對照治療的小鼠相比，用saxl治療的小鼠的腫瘤中的mmp2水平顯著降低(圖6c)。這些結果表明，單一藥劑axl療法足以顯著減少產生疾病的小鼠中的轉移性腫瘤負荷。此外，這些發(fā)現(xiàn)表明axl對轉移性腫瘤生長的治療作用可涉及至少部分通過調節(jié)mmp活性來抑制侵襲?？紤]到靶向mmp的先前抗轉移抑制劑已顯示出對正常組織毒性具有顯著影響，我們在用saxl療法治療21天的小鼠中對正常組織毒性進行全面分析。在用saxl或fc療法治療的裸小鼠中，我們未觀察到行為、肉眼可見的或用顯微鏡可見的異常(圖7)。侵襲和遷移是有助于腫瘤轉移的發(fā)病機理的重要細胞固有性質。已推測靶向這些過程的治療劑可為抑制轉移的適用策略且可對患有轉移性疾病的患者提供臨床益處。在這份報告中，顯示受體酪氨酸激酶axl是管理腫瘤細胞侵襲和轉移的關鍵因子。最重要的是，顯示使用可溶性axl受體治療性阻斷axl信號傳導足以顯著抑制患有預先存在的轉移性疾病的小鼠體內的轉移性腫瘤進展。在機理方面，我們的研究表明可溶性axl療法至少部分通過抑制mmp活性和侵襲而抑制腫瘤轉移。最后，我們證實axl在來自人類卵巢癌和乳癌患者的轉移和晚期原發(fā)性腫瘤中高度表達，這凸顯了我們的研究在臨床上的重要性。本文中已證實axl是針對人類癌癥轉移的關鍵因子且axl信號傳導的治療性阻斷是轉移性疾病的有效治療。此處，我們證實axl在來自乳癌和卵巢癌患者的轉移和晚期原發(fā)性腫瘤中高度表達。我們在遺傳學方面證實，axl對于使用裸小鼠模型使用疾病起始轉移性乳癌和卵巢癌至關重要。最重要的是，我們已培養(yǎng)出高度特異性和無毒可溶性axl受體作為抗axl療法且證實可溶性axl受體療法足以顯著抑制患有預先存在的轉移性疾病的小鼠體內的轉移性腫瘤進展。我們的發(fā)現(xiàn)表明，抑制腫瘤細胞中的axl信號傳導級聯(lián)可阻斷轉移性疾病的起始和進展。我們的數(shù)據(jù)暗示axl為晚期和轉移性乳癌和卵巢癌的治療靶且提示抗axl療法可控制轉移性疾病的起始和進展。mmp在腫瘤細胞侵襲和轉移的調節(jié)中起重要作用。然而，腫瘤細胞誘導mmp活性的機理仍不清楚。mmp表達在人類癌癥中增加且與腫瘤進展和不良患者存活相關。人類癌癥中很少見mmp中的基因擴增和激活突變，表明其它因子負責增強癌癥中的mmp表達。我們的數(shù)據(jù)證明，mmp-2表達在人類卵巢癌細胞中由axl在轉錄水平下調節(jié)。雖然axl調節(jié)mmp-2表達的確切機理還未確定，但我們證實藥理學抑制pi3k途徑會在gas6刺激的細胞中誘導mmp-2啟動子活性，這表明對pi3k途徑的作用(圖8)。重要的是，我們的結果表明axl的治療性阻斷可為抑制腫瘤中的mmp活性的有效且無毒策略。廣譜mmp抑制劑在癌癥試驗中未成功，這部分是由于高水平的正常組織毒性。我們的發(fā)現(xiàn)表明，預計的抗axl療法的副作用很小。在小鼠中未觀察到與可溶性axl胞外域療法的腺病毒介導的遞送有關的任何正常組織毒性。此外，種系axl和gas6基因敲除小鼠可存活且為表型正常的成體，這表明axl或gas6不為發(fā)展或正常組織功能所需。我們證實單一藥劑axl療法足以抑制轉移性卵巢癌的高度轉移性模型中的轉移性腫瘤進展。這些發(fā)現(xiàn)對于治療卵巢癌具有重要的臨床意義。在美國，每年約有14,600人死于卵巢癌。目前，尚無fda批準的生物制劑用于治療卵巢癌，不過avastin(靶向vegf的mab)和tarceva(小分子egfr激酶抑制劑)在臨床試驗中用于治療晚期和復發(fā)性卵巢癌。卵巢癌的標準療法包括疾病的最佳減滅手術，繼而是細胞毒性鉑-紫杉烷組合療法。即使有這些努力，仍有80％的診斷患有卵巢癌的患者發(fā)展復發(fā)性疾病且這些患者中僅有30％在診斷后存活5年。我們的數(shù)據(jù)顯示，axl療法是用于治療晚期和復發(fā)性卵巢癌的有效佐劑療法。研究中所用的轉移性卵巢腫瘤進展模型類似手術減滅后人類患者體內復發(fā)性疾病的發(fā)展。我們發(fā)現(xiàn)axl療法能夠減少產生疾病的小鼠體內的轉移性腫瘤負荷達63％。在疾病進展期間產生的新的轉移性病變顯著減少。這一觀察結果與我們的發(fā)現(xiàn)一致，顯示axl主要影響腫瘤細胞侵襲而非細胞增殖或生長。合起來，我們的結果表明axl療法主要用作抗轉移劑且可最有效作為與當前細胞毒劑的組合療法?？傊琣xl是針對轉移的關鍵因子且axl信號傳導的阻斷在轉移中具有治療益處。這些研究為轉移性疾病的抗axl療法提供了重要的臨床前數(shù)據(jù)。方法細胞系。卵巢skov3、skov3ip.1和heya8細胞是以贈品獲自dr.gordonmills(mdandersoncancercenter)。卵巢es-2和mesov細胞是來自dr.branimirsikic(stanforduniversity)的贈品。mda-231、ovcar-3和mcf-7細胞是購自atcc。igrov-1和ovcar-8細胞是購自nci-frederickdctd腫瘤細胞系庫。在37℃下，在5％co2孵育器中，將細胞在補充有10％熱滅活胎牛血清和1％青霉素和鏈霉素的適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)。來自乳癌和卵巢癌細胞系的nci60小組的細胞團由dr.giovanimelillo(nci-frederick)提供。患者和組織微陣列。人類乳房組織微陣列購自usbiomax(br1002)。卵巢人類組織微陣列是獲自斯坦福大學病理學系(stanforduniversitypathologydepartment)?？偣?3個石蠟包埋的腫瘤樣品是獲自1995-2001年間斯坦福醫(yī)院(stanfordhospital)先前未治療的卵巢癌患者。這些原發(fā)性卵巢腫瘤樣品組裝到由每個患者兩個樣品組成的組織微陣列中。來自腹膜的另外30個腫瘤樣品也在此微陣列中進行評價。所有患者均具有漿液性卵巢癌，且根據(jù)國際婦產科學聯(lián)盟(internationalfederationofgynecologyandobstetrics)標準獲得分期信息。所有標本和其相應的臨床信息均根據(jù)由斯坦福大學倫理審查委員會批準的協(xié)議收集。其它可購得的腫瘤微陣列用于檢查來自網(wǎng)膜的32個轉移性病變(usbiomax)。axl免疫組織化學。在標準免疫組織化學方法后，將石蠟包埋的組織載玻片用二甲苯去除石蠟，再水合且暴露。axl一級抗體(randdsystems)以1:500稀釋度使用。所有樣品的陰性對照均使用二級抗體單獨進行?？乖?抗體復合物是使用vectastainabc系統(tǒng)(vectorlaboratories)和針對過氧化物酶的dab底物試劑盒(vectorlaboratories)根據(jù)制造商協(xié)議來目測。載玻片用蘇木精復染。根據(jù)對axl表達呈陽性的細胞的百分比在顯微鏡下對腫瘤細胞膜上的axl染色評分(0是不存在，1是針對不良品質樣品，2是針對5-60％且3是針對61-100％)。報告基因測定。由1659bpmmp-2啟動子驅動的mmp-2報告基因質粒是贈品。shscrm和shaxlskov3ip.1細胞中的熒光素酶活性是通過dual-glo熒光素酶測定試劑(promega)測定且在monolight2010照度計(analyticalluminescencelaboratory)中測量。將螢火蟲熒光素酶活性歸一化為renilla活性。一式三份進行測定且重復兩次。瞬時和逆轉錄病毒轉染。瞬時dna轉染用lipofectamine2000(invitrogen)根據(jù)制造商說明進行。將0.1μgmmp-2cdna(openbiosystems)轉染到6孔皿中。sirna：靶向axl或對照的sirna序列購自dharmacon。所有sirna轉染均使用dharmaconsmartpools與dharmafect1轉染試劑根據(jù)制造商的方案(dharmacon,lafayette,co)進行。shrna：用于axlrna的特定降解的寡核苷酸合成為先前所述的5’-gatttggagaacacactga-3’。將scramble序列用作非靶向shrna5’-aattgtactacacaaaagtac-3’。將這些寡核苷酸克隆到rnai-readypsirenretroq(bdbioscience)載體中且skov3ip.1、mda-231和ovcar-8細胞通過這些載體進行逆轉錄病毒轉導。在嘌呤霉素(sigma)中選擇受感染細胞且通過蛋白質印跡分析測試多克隆群體的降低的axl表達水平。質粒。對應于氨基酸1-451的axl胞外域從人類axlcdna(openbiosystems)擴增且克隆到cmv驅動的padd2腺病毒穿梭載體中。在hct116細胞中，使用lipofectamine2000(invitrogen)根據(jù)制造商用對照載體或axl1-451進行瞬時dna轉染。轉染后48-72小時收集條件培養(yǎng)基。粘附測定。skov3ip.1shscrm和shaxl細胞用5umcmfda(molecularprobes)熒光標記。使用非酶促細胞解離緩沖液(gibco)洗滌和分離細胞。將細胞(5×10e5)接種到96孔板中且用50μg/μl膠原蛋白i型(bdbioscience)預涂布。在37℃下孵育60分鐘后，小心洗滌細胞5次。使用熒光分光光度計測量熒光活性(激發(fā)，494nm；發(fā)射，517nm)。skov3ip.1粘附于膠原蛋白i型。將skov3ip.1shscrm和shaxl細胞用5μmcmfda(molecularprobes)熒光標記。使用非酶促細胞解離緩沖液(gibco)洗滌和分離細胞。將細胞(5×10e5)一式三份接種到96孔板中且用50μg/μl膠原蛋白i型(bdbioscience)預涂布。在37℃下孵育60分鐘后，小心洗滌細胞5次。使用熒光分光光度計測量熒光活性(激發(fā)，494nm；發(fā)射，517nm)。mda-231粘附于ecm蛋白。mda-231shscrm和shaxl(0.5×10^6)細胞一式三份接種到含有包括層粘連蛋白、膠原蛋白i和iv、纖連蛋白和纖維蛋白原的ecm蛋白陣列的孔中。將細胞在37℃下孵育1小時且在pbs中洗滌。根據(jù)制造商的方案(cellbiolabs)在od560下染色和量化粘附細胞。遷移測定。如先前所述體外檢查細胞遷移。簡言之，對細胞進行24小時血清剝奪且一式三份接種(2.5×104個細胞)到未涂布的插入物(bdbiosciences)上，移到含有fbs作為化學引誘物的室中且孵育24小時。去除非侵襲細胞后，固定膜底部的細胞，染色且計數(shù)。對每個膜的5個區(qū)域進行計數(shù)。遷移％如下確定：(在shaxl細胞中遷移的細胞的平均數(shù)目/在shscrm細胞中遷移的細胞的平均數(shù)目)×100。一式三份進行實驗且重復3次。膠原蛋白侵襲測定。如先前所述進行膠原蛋白侵襲測定。簡言之，將533個細胞接種到48孔板上的膠原蛋白i型中。將細胞在標準培養(yǎng)基或添加有條件對照培養(yǎng)基或saxl-條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天且拍攝照片。通過膠原蛋白侵襲是通過計算每20x區(qū)域呈現(xiàn)分枝表型的腫瘤細胞的百分比來量化。對每個樣品3個區(qū)域計數(shù)。一式三份進行實驗且重復2次。明膠底物酶譜法。使skov3ip.1shscrm和shaxl細胞血清饑餓48小時。將25,000個細胞接種到96孔板中且24小時后收集條件培養(yǎng)基。將等體積的條件培養(yǎng)基在非還原性條件下在10％酶譜凝膠(invitrogen)上跑膠。電泳后，在2.5％(v/v)tritonx-100中洗滌凝膠以去除sds且在50mmtris-hcl、5mmcacl2和0.1％tritonx-100(ph7.8)洗滌，并且在37℃下孵育過夜。用溶解于40％甲醇和10％冰乙酸中的0.25％(w/v)庫馬斯亮藍(coomassiebrilliantblue)r250將酶譜染色30分鐘。在40％甲醇和10％冰乙酸中使凝膠變色。一式兩份進行實驗且重復3次。細胞增殖測定。對于單層生長曲線，將細胞(50,000個)一式三份接種到60mm皿中。每3天，使細胞胰蛋白酶化，使用細胞計數(shù)器(庫爾特計數(shù)器(coultercounter))計數(shù)，且再接種50,000個細胞并計數(shù)。xtt存活測定。細胞活力通過先前所述的xtt測定來測量。簡言之，用含有0.3mg/mlxtt和2.65μg/mln-甲基二苯并吡嗪甲基硫酸鹽的無酚紅培養(yǎng)基孵育用血清滋養(yǎng)或血清饑餓的細胞(0、3、6和7天)。使96孔板返回37℃孵育器中并保持1到2小時。通過測量450nm下的吸光度量化xtt的代謝。蛋白分離和蛋白質印跡分析。在9m尿素、0.075mtris緩沖液(ph7.6)中收集蛋白裂解液。蛋白裂解液使用bradford測定來量化且使用標準方法進行還原性sds-page。用針對axl的抗體(randd系統(tǒng))、α微管蛋白(fitzgerald抗體)、akt(細胞信號傳導)、磷酸化akt(細胞信號傳導)探測蛋白質印跡。對于gas6刺激，使細胞血清饑餓24小時。接著用25umpi3k抑制劑(ly294002，biomolresearchlaboratory)或含有axl胞外域的100l條件培養(yǎng)基處理細胞4小時，隨后用400ng/mlgas6處理15分鐘。為分析小鼠血清中的saxl表達，通過凝膠電泳分析來自每個樣品的1.5l血清。腺病毒的產生和制備。使對應于氨基酸1-451的axl胞外域從axlcdna(openbiosystems)擴增且通過同源重組克隆到e1-e3-ad菌株5的e1區(qū)域中，隨后在293細胞中制備腺病毒且進行cscl梯度純化，如先前所述。如先前所述進行saxl腺病毒的制備和純化。表達鼠類igg2-fc免疫球蛋白片段的陰性對照的產生和制備先前已有描述。作為腹膜異種移植物的skov3ip.1和ovcar-8細胞的生長。所有涉及動物和其管理的程序均由斯坦福大學的機構動物管理與使用委員會(institutionalanimalcareandusagecommittee)根據(jù)機構和nih準則批準。將對照和axlskov3ip.1和ovcar-8細胞分別以0.5mlpbs中的1×106和5×106個細胞腹膜內注射到雌性裸小鼠中。處死后，量化腹水，對轉移性病變計數(shù)，將所有可見的病變切開并清除以稱取腫瘤重量。將skov3ip.1和ovcar-8親本細胞分別以0.5mlpbs中的1×106和5×106個細胞腹膜內注射到雌性裸小鼠中。腫瘤細胞注射后7(skov3ip.1)或14(ovcar-8)天，將0.1mlpbs中的saxl或對照(1.9×108個腺病毒pfu)注射到小鼠的尾靜脈中。處死后，量化腹水，對轉移性病變計數(shù)，將所有可見的病變切開并清除以稱取總腫瘤重量。組織毒性研究。將skov3ip.1親本細胞分別以0.5mlpbs中的1×106和5×106個細胞腹膜內注射到雌性裸小鼠中。腫瘤細胞注射后7天，將0.1mlpbs中的saxl或對照(1.9×108個腺病毒pfu)注射到小鼠的尾靜脈中。第28天，處死小鼠。收集血液且由斯坦福大學的比較醫(yī)學系(departmentofcomparativemedicine)進行綜合代謝小組和cbc分析。從包括肝、腎、腦和脾在內的所有主要器官收集組織樣品，固定于10％福馬林中，包埋于石蠟中，切片且用蘇木精和曙紅復染。體內尾靜脈轉移測定。將對照和axlshrnamda-231細胞以0.1mlpbs中的5×105個細胞靜脈內注射到裸小鼠的尾靜脈中。注射后4周，處死小鼠。對用蘇木精和曙紅染色的福馬林固定、石蠟包埋的肺的代表性切片進行肺病灶的顯微鏡評價。由委員會認證的藥理學者確認對具有最少四個具有最大細胞核且對axl表達呈陽性的人類細胞的肺病灶的正確鑒定。小鼠肺中的腫瘤負荷通過從全肺分離的rna中人類gapdh和axl表達的實時pcr分析來量化。作為常位腫瘤的mda-231細胞的生長。mda-231細胞在6周大的雌性裸(nu/nu)小鼠中在將0.1mlpbs中的107個細胞皮內注射到乳房脂肪墊中后作為皮下常位腫瘤生長。在38天時程內用測徑器測量腫瘤。使用下式計算體積：寬度2×長度×0.5。作為皮下腫瘤的skov3ip.1細胞的生長。將0.1mlpbs中的5,000,000個細胞皮下植入到6周大的雌性裸(nu/nu)小鼠的肋腹中。在45天時程內用測徑器測量腫瘤。使用下式計算體積：寬度2×長度×0.5。rna和實時pcr分析。rna是使用trizol根據(jù)制造商的方案(invitrogen)從細胞和組織分離。cdna是使用針對逆轉錄-pcr的superscript第一鏈合成系統(tǒng)(invitrogen)從2μgdnase(invitrogen)處理的rna合成而來。使用sybrgreenpcrmastermix(appliedbiosystems)對1μlcdna進行pcr擴增。以下引物對用于擴增特異靶基因：18sfwd:5-gcccgaagcgtttactttga-3rev:5-tccattattcctagctgcggtatc-3；axlfwd:5-gtgggcaacccagggaatatc-3rev:5-gtactgtcccgtgtcggaaag；gapdh5-atggggaaggtgaaggtcg-3rev:5-ggggtcattgatggcaacaata-3；mmp-2fwd:5-gccccagacaggtgatcttg-3rev5-gcttgcgagggaagaagttgt-3。在prism7900序列檢測系統(tǒng)(appliedbiosystems)上進行pcr擴增。所用熱循環(huán)分布是在50℃下變性2分鐘且在95℃下變性10分鐘，隨后是在95℃下變性15秒且在60℃下變性1分鐘的循環(huán)。使用18s歸一化mrna。相對mrna表達水平是使用相對標準曲線方法根據(jù)制造商的說明(appliedbiosystems)來確定。統(tǒng)計學分析。使用費希爾精確測試(fisher’sexacttest)來測試axl表達與腫瘤形成和轉移之間的關聯(lián)。所有其它統(tǒng)計學測試均使用斯氏t檢驗進行。p值<0.05的值被認為具有統(tǒng)計學顯著性?？s寫：gas6，生長停滯特異基因6；mmp-2，基質金屬蛋白酶；eoc，上皮卵巢癌；ecm，胞外基質；akt，v-akt鼠類胸腺瘤病毒致癌基因同系物。表1.axl染色與腫瘤參數(shù)的統(tǒng)計學分析各值表示為n(％)。對于腫瘤細胞，膜染色評分為0，不存在；1，不能評分；2，5到60％陽性；3，61到100％陽性。實例2我們證實與未治療的對照相比，通過使用腺病毒表達系統(tǒng)在小鼠中過度表達野生型可溶性axl來抑制gas6配體結合于細胞axl可使得腫瘤負荷減少，如通過腫瘤數(shù)目和尺寸所測量，這進一步凸顯了在臨床前小鼠模型中gas6和axl作為抑制轉移進展的關鍵靶和有效策略的重要性。本文提供工程改造過的axl胞外域的可溶性變體，其對配體gas6具有高親和力，從而使其螯合所述配體并減弱內源性axl信號傳導。工程改造過的變體與野生型axl相比具有大大提高的對gas6的親和力。axl的胞外域包含兩個igg樣域和兩個纖連蛋白樣域。主要的gas6結合位點在ig1域中且次要的gas6結合位點在ig2域中。為進一步增強主要結合位點的親和力，我們對與axlswissprot條目p30530對應的具有斷點19-132的ig1域進行工程改造。突變體庫是通過使用標準分子生物學技術對axl受體的ig1域進行易錯pcr而產生的。該庫使用酵母表面呈現(xiàn)來表達且通過熒光激活的細胞分選(facs)進行篩檢以分離對可溶性gas6展現(xiàn)出增強的結合親和力的突變體。在我們的庫篩檢方法中，突變體蛋白庫經過多輪分選，其中連續(xù)各輪可減小庫的大小，同時強化所需突變體蛋白性質，其在這種情形下對gas6的結合親和力較高。為了獲得對gas6具有顯著較強親和力的axl突變體，在后來的各輪分選中使用“解離速率”分選。對于解離速率分選，首先將蛋白突變體庫與可溶性gas6一起孵育，接著用緩沖液洗滌以從溶液中去除未結合的gas6。接下來，突變體庫在室溫下在過量可溶性競爭者存在下孵育2、4、6、12或24小時。過量競爭者用于螯合從酵母呈現(xiàn)的axl解離的gas6，使無結合步驟不可逆。使用facs收集保持結合于gas6的突變型axl蛋白。0、4和6小時的解離速率步驟后通過匯集的第5輪分選產物分析與gas6的結合，顯示這些產物與野生型axl相比在持久結合于gas6方面展現(xiàn)顯著改進(參見圖12)。條線圖量化了來自點圖的數(shù)據(jù)，表明庫成員的顯著改進。這些產物的定序識別了axlig1域內關于匯集的第5輪分選產物所觀察到的賦予增強的針對gas6的親和力的若干突變(圖12和表2)。第6輪分選進一步強化來自第5輪分選產物的3種特定克隆物。表2顯示axl序列內的獨特氨基酸突變，這些突變含于第5輪和第6輪分選產物中。在這個表格中，頂行中的殘基數(shù)目指示野生型axl中的氨基酸殘基。第二行指示在野生型axl中的既定位置可見的殘基。在隨后各行中，指定既定突變體中存在的氨基酸突變。突變體內不存在針對特定殘基的氨基酸(例如表2中的空白區(qū)或空白單元)表示這個氨基酸殘基不是從野生型殘基突變而來。氨基酸殘基的標準單字母名稱的使用是本領域技術人員充分了解的。顯示來自分選5和6產物的獨特序列，以及與野生型axl相比匯集的克隆物的結合性質，表明匯集的第5輪分選產物在gas6結合方面存在實質性改進。使用這種定向進化方法分離的突變體包括表3中所示的氨基酸取代。表3.使用定向進化分離的突變體26323374798792127wt-axlegnsvdvgaxls6-1sgaraxls6-2gmaeaxls6-5snga根據(jù)由sasaki等(emboj2006)所報道的gas6-axl復合物的晶體結構，上文所示的所有突變(除e26g、g32s、n33s和g127r/e外)均位于axl與gas6之間的結合界面處。選擇來自第6輪分選的個別突變體axls6-1和axls6-2進行進一步研究。進行野生型axl、axls6-1和axls6-2的平衡結合滴定以比較野生型或突變型axl蛋白與gas6的相互作用的親和力。將數(shù)據(jù)擬合為四點s形曲線且取中點作為平衡結合常數(shù)kd。突變體axls6-1和axls6-2展現(xiàn)與野生型axl相比在gas6結合親和力方面存在實質性改進(圖13和表4)。野生型axl對gas6的結合親和力(kd)為2.4±1.2×10-9m；axls6-2對gas6的結合親和力(kd)為1.89±0.37×10-10m；且axls6-1對gas6的結合親和力(kd)為1.12±0.23×10-10m。對于axls6-1和axls6-2，這個gas6結合親和力分別是野生型axl的22倍和12.8倍(表4)。表4.野生型和突變型axl蛋白對gas6的結合親和力(kd)。我們還使用可變溫度圓二色性掃描來研究野生型和突變型axl蛋白的熱穩(wěn)定性。這項技術監(jiān)測折疊蛋白的二次結構元件隨溫度展開的情形。監(jiān)測每種蛋白隨溫度變化的橢圓度且將數(shù)據(jù)擬合為標準兩態(tài)展開曲線。熔融溫度(tm)是展開曲線的中點。野生型axl展現(xiàn)41.3±0.6℃的熔融溫度；axls6-1展現(xiàn)54.0±0.9℃的熔融溫度(熱穩(wěn)定性比野生型axl高大約13℃)；axls6-2展現(xiàn)41.55±0.02℃的熔融溫度(熱穩(wěn)定性與野生型axl大致類似)(表5)。表5.如通過可變溫度圓二色性掃描所測定的野生型和突變型axl蛋白的熱穩(wěn)定性。實例3可溶性axl變體體外抑制轉移性腫瘤進展gas6-axl信號傳導已牽涉包括乳癌、肺癌以及結腸癌和(近期通過此處提供的工作)卵巢癌在內的實體腫瘤的多種侵襲性形式的進展中。雖然已在axl表達與疾病階段和患者預后之間觀察到不同關聯(lián)，但很多情況下未證實axl為用于治療轉移的治療靶。在實例1中，我們證實axl確實是人類乳癌和卵巢癌患者體內轉移的標志物，原發(fā)性腫瘤上的axl表達水平與所述疾病的嚴重性相關。這些結果表明，拮抗gas6-axl信號傳導途徑可提供用于治療轉移性疾病的治療窗。如實例1中所概述，為了驗證axl為治療靶的潛力，在人類卵巢癌的侵襲性小鼠模型中使用腺病毒遞送來施用可溶形式的axl野生型胞外域。我們證實與對照相比，腫瘤轉移在接受可溶性axl治療的小鼠中顯著減少。這些數(shù)據(jù)表明，使用可溶性axl拮抗腫瘤細胞中的gas6-axl信號傳導可抑制所述疾病的轉移性進展?；谶@些結果，我們證實工程改造過的對gas6的親和力較高的axl突變體作為抗轉移劑引起較大功效，且治療上更相關的遞送可溶性axl的模式仍產生顯著結果。在這項研究中，我們使用實驗1中所概述的相同人類卵巢癌模型且對具有預先存在的轉移性疾病的小鼠腹膜內施用純化過的可溶性axl(saxl)變體。我們測試野生型axl和axls6-1(工程改造過的高親和力突變體)且均與一種axl形式e59r/t77r比較，在e59r/t77r中消除gas6結合。我們的結果突出顯示，增強的axls6-1親和力引起較大的治療功效，因為通過所有轉移性病變的數(shù)目和總重量所評估的腫瘤負荷減少相比野生型axl和axle59r/t77r陰性對照均顯著降低。這些發(fā)現(xiàn)進一步驗證axl和gas6為用于抑制轉移的治療靶且支持工程改造過的高親和力axl突變體s6-1為gas6-axl信號傳導系統(tǒng)的有效拮抗劑。雖然實例1顯示saxl的腺病毒遞送會產生治療功效，但這種遞送方法臨床上不相關且因此證實純化過的saxl的遞送將產生類似結果。野生型axl、axls6-1和axle59r/t77r融合于小鼠igg2a的片段可結晶區(qū)(fc)以便改進藥物動力學。這三種axl融合(axl-fc)變體之間的唯一差別是見于axlig1域中的突變，這些突變概述于表6a中。編碼axl-fc蛋白的dna是使用ecori和sali限制位點克隆到cmv驅動的padd2腺病毒穿梭載體中。編碼這三種axl突變體的padd2質粒是使用來自lifetechnologies的freestyle表達試劑盒，如制造商所述獨立轉染到hek293細胞中。使用蛋白a親和色譜法，隨后使用尺寸排阻色譜法從培養(yǎng)物上清液純化蛋白質。表6.為評估axl-fc突變體抑制體內轉移的能力，使用如實例1中所概述的相同的人類卵巢癌的腹膜異種移植模型。此模型再現(xiàn)了人類卵巢癌轉移的腹膜散布，因為skov3ip.1細胞施用后4周，小鼠快速發(fā)展由腹水和許多(>100個)小的轉移性病變組成的高度侵襲性疾病。此模型是人類卵巢癌的極準確的表示，因為大多數(shù)患者在診斷時患有明顯轉移性疾病。小鼠注射skov3ip.1細胞且使腫瘤接種7天。在第7天，我們將小鼠隨機分成3個研究組且開始野生型axl-fc、s6-1-fc或e59r/t77r-fc的施用性治療。一周兩次將溶解于磷酸鹽緩沖鹽水中的純化過的蛋白質以10mg/kg的劑量施用于小鼠，歷時3周，總計6劑。在第28天，將所有小鼠處死且進行尸檢以評估總體腫瘤負荷，如通過可見的轉移性病變的數(shù)目以及所有病變的總重量所測量。治療組之間存在顯著差別且代表性圖像顯示于圖14中。接受e59r/t77r-fc陰性對照治療的小鼠具有平均86.3±21.9個腹膜轉移。對于接受野生型axl-fc的小鼠，這一數(shù)字降到48.1±6.9，而對于工程改造過的axl組中的小鼠(s6-1-fc)，平均僅觀察到8.3±1.6個轉移性病變(圖15(上圖))。對每只小鼠切除所有可見的病變且合起來稱重以評估總體轉移性腫瘤負荷。工程改造過的axl治療組(s6-1-fc)又顯示最顯著的反應，因為e59r/t77r-fc、野生型fc和s6-1-fc治療組各自展現(xiàn)567±92、430±36和188±55mg的腫瘤負荷，圖15(下圖)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)進一步驗證axl為用于治療轉移的治療靶且顯示中和axl的配體gas6是一種有效的抗轉移治療策略。重要的是，不展現(xiàn)與gas6的可檢測結合的包含axl-fc融合體的蛋白質(axle59r/t77r-fc)無法預防腫瘤轉移；以中等親和力結合于gas6的包含axl-fc融合體的蛋白質(野生型axl-fc)顯示輕微抑制腫瘤轉移；以極強親和力結合于gas6的包含axl-fc融合體的蛋白質(axls6-1-fc)顯示顯著抑制腫瘤轉移?？傊?，這表明gas6與axl的相互作用的表位在腫瘤轉移中至關重要且通過axls6-1-fc蛋白有效抑制gas6上的這一表位可顯著抑制腫瘤轉移。因而，axls6-1-fc蛋白或任何有效阻斷gas6-axl相互作用的蛋白質均是有希望用于轉移性疾病的治療候選物。此外，也顯示直接施用純化過的可溶性axl蛋白是一種可行的治療方法，在臨床上驗證了這種方法。用于實例3的方法細胞系。將卵巢skov3ip.1在37℃下，在5％co2孵育器中，在補充有10％胎牛血清和1％青霉素和鏈霉素的適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)。axl-fc融合體。將全長axl突變體、氨基酸19-440接種到cmv驅動的padd2腺病毒穿梭載體中與lgg2afc區(qū)形成直接融合體。使用來自lifetechnologies的freestyle表達試劑盒，如制造商所述實現(xiàn)人類胚胎腎(hek)293細胞的瞬時dna轉染。5天后使用蛋白a親和色譜法和尺寸排阻色譜法從培養(yǎng)物上清液純化fc-融合蛋白。純化過的蛋白質放置于磷酸鹽緩沖鹽水溶液中而無任何額外添加劑或載體。skov3ip.1腹膜異種移植物。所有涉及動物和其管理的程序均由斯坦福大學的機構動物管理與使用委員會根據(jù)機構和nih準則批準。對6周大的雌性裸小鼠腹膜內注射1×106個skov3ip.1細胞。施用細胞后7天，將小鼠隨機分成3個用s6-1-fc、野生型axl-fc或e59r/t77r-fc治療的組。純化過的可溶性axl-fc蛋白經腹膜內注射以10mg/kg的劑量一周施用2次。給藥持續(xù)3周，之后處死小鼠。進行尸檢，其中對轉移性病變計數(shù)且接著切除以合起來稱重。腫瘤負荷是通過每只小鼠的所有患病組織的總病變數(shù)目和總體重量來確定。統(tǒng)計學分析：使用斯氏t檢驗且所報道的誤差為平均值的標準誤差(sem)。p值<0.01的值被認為具有顯著性。雖然前述發(fā)明已通過說明和舉例相當詳細地描述以達成清晰了解的目的，但本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明的教導顯而易見的是，可在不偏離所附權利要求的精神或范圍的情況下進行某些改變和修改。當前第1頁12