本發(fā)明涉及水生動物營養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種培養(yǎng)及誘導(dǎo)羅非魚腹腔前脂肪細胞的方法。

背景技術(shù)：

自1962年Wolf等人建立了第一個魚類細胞系，即虹鱒魚(Oncorhynchusmykiss)生殖腺細胞系RTG-2以來，魚類細胞培養(yǎng)技術(shù)不斷發(fā)展成熟，從最初的用于魚類病毒的分離、鑒定以及病毒疫苗的制備到目前環(huán)境毒理學(xué)、魚類腫瘤學(xué)、生理學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、遺傳學(xué)和資源保護等方面的應(yīng)用，魚類細胞培養(yǎng)技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用。其主要原因在于，魚類細胞培養(yǎng)作為一種新興技術(shù)有著活體魚養(yǎng)殖無法比擬的獨特優(yōu)勢：(1)成本低；細胞系培養(yǎng)和保存無需較多的人力資源，且細胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化程度高，變異程度低(2)真實性與快速性；離體培養(yǎng)的原代細胞其生理功能接近在體狀態(tài)，且實驗周期短，不受實驗動物生長周期的影響，可短期內(nèi)快速得到實驗結(jié)果。(3)可重復(fù)性好；離體培養(yǎng)細胞，可以精確控制實驗條件，排除其他因素對實驗結(jié)果的干擾，可以有針對性的開展實驗研究。

魚類中脂肪組織是主要的儲能部位，脂肪組織在調(diào)控能量平衡中發(fā)揮了重大作用：既可以作為儲能場所儲存多余的能量，也可以在能量供應(yīng)不足的情況下作為能量來源，釋放脂肪酸提供能量。和哺乳動物類似的是，在魚類中，脂肪組織的產(chǎn)生和脂質(zhì)沉積是受基因，環(huán)境以及飲食因素的共同影響，由此引發(fā)脂肪細胞增殖和分化，從而導(dǎo)致脂肪組織肥大。因此，構(gòu)建脂肪細胞體外培養(yǎng)體系，研究脂肪細胞分化過程，是探討生物體脂質(zhì)代謝規(guī)律的重要手段。而與細胞系相比，原代脂肪細胞是直接從生物體內(nèi)獲得且生長在一個相對簡單的環(huán)境中，更能反映生物體的狀態(tài)。

目前，哺乳動物方面已經(jīng)構(gòu)建了大鼠、人、牛和豬的前體脂肪模型，而魚類脂肪細胞體外培養(yǎng)的研究工作剛開始不久。國外已開展了虹鱒、大西洋鮭、真鯛脂肪細胞培養(yǎng)的研究，而國內(nèi)的工作仍處于起步階段。

羅非魚(Tilapia)原產(chǎn)于非洲，是一種熱帶內(nèi)陸性魚類。其生長快，產(chǎn)量高，耐低氧，適應(yīng)性和抗病力強，在淡咸水中均能生存。目前已成為世界性的主要養(yǎng)殖魚類。隨著羅非魚的市場需求增大，水產(chǎn)養(yǎng)殖也朝著集約化方向發(fā)展，而淡水養(yǎng)殖過程中，養(yǎng)殖戶為了提高羅非魚產(chǎn)量，大量投喂高脂飼料，造成魚類脂肪大量沉積，魚類抗病能力下降，因此，研究羅非魚脂肪組織的發(fā)生和代謝就尤為重要。到目前為止，羅非魚的脂肪細胞培養(yǎng)體系的建立尚未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)羅非魚前脂肪細胞，并誘導(dǎo)其分化為成熟的脂肪細胞的方法。該方法具有快速、可有效保留前細胞活性等優(yōu)點，為研究羅非魚脂代謝提供了新的研究思路和技術(shù)手段。

本發(fā)明中所采用的DMEM/F12培養(yǎng)基的成分為：

本發(fā)明提出了一種增殖培養(yǎng)基，在DMEM/F12培養(yǎng)基中加入10％～15％(體積百分比)的胎牛血清。

優(yōu)選地，加入胎牛血清的體積百分比為15％。

優(yōu)選地，所述增殖培養(yǎng)基可以進一步加入1％(體積百分比)雙抗，其中所述雙抗為100單位的青霉素和100μg鏈霉素。

本發(fā)明提出了一種誘導(dǎo)培養(yǎng)基，包括：在DMEM/F12培養(yǎng)基中加入10～15％(體積百分比)胎牛血清和0.1％～1％(質(zhì)量百分比)牛血清白蛋白，15μg/ml胰島素(insulin)，0.2mM吲哚美辛(Indo)，1μM地塞美松(DEX)，0.5μM1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(IBMX)。

優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基，包括：在DMEM/F12培養(yǎng)基中加入15％(體積百分比)胎牛血清和0.1％(質(zhì)量百分比)牛血清白蛋白，15μg/ml胰島素(insulin)，0.2mM吲哚美辛(Indo)，1μM地塞美松(DEX)，0.5μM1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(IBMX)。

本發(fā)明還提出了一種對羅非魚前脂肪細胞增殖培養(yǎng)的方法，包括：

用上述增殖培養(yǎng)基重懸細胞；接種于細胞板中，20～30℃、5％CO₂條件下進行培養(yǎng)5-7天。

其中，所述培養(yǎng)的溫度優(yōu)選地為28℃；培養(yǎng)的CO₂濃度為5％；

優(yōu)選地為，每4天換液一次；

接種細胞的濃度范圍為2～3×10⁵個/ml；優(yōu)選地，為2.5×10⁵個/ml

培養(yǎng)5～7天時，細胞長至匯合階段；優(yōu)選地，所述培養(yǎng)的時間為7天。

本發(fā)明還提出了一種誘導(dǎo)羅非魚前脂肪細胞的方法，所述方法包括如下步驟：

a)用上述增殖培養(yǎng)基重懸細胞；接種于細胞板中，20～30℃、5％CO₂條件下進行培養(yǎng)5-7天；

b)更換上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)7～14天。

其中，所述步驟a)中，

所述培養(yǎng)的溫度優(yōu)選地為28℃；培養(yǎng)的CO₂濃度為5％；

優(yōu)選地為，每4天換液一次；

接種細胞的濃度范圍為2～3×10⁵個/ml；優(yōu)選地，為2.5×10⁵個/ml

培養(yǎng)5～7天時，細胞長至匯合階段；優(yōu)選地，所述培養(yǎng)的時間為7天。

其中，所述步驟b)中，

所述誘導(dǎo)的溫度優(yōu)選地為28℃；

所述誘導(dǎo)的時間優(yōu)選地為12天；對細胞進行油紅O染色，顯微鏡下觀察油紅染色結(jié)果，可見誘導(dǎo)成功的羅非魚前脂肪細胞的細胞膜邊緣較為模糊，胞內(nèi)脂滴被染為紅色。

本發(fā)明還提出了一種對羅非魚前脂肪細胞傳代的方法：

1)用上述增殖培養(yǎng)基重懸細胞；接種于細胞板中，20～30℃、5％CO₂條件下進行培養(yǎng)14-20天。

2)用上述增殖培養(yǎng)基將步驟1)培養(yǎng)的前脂肪細胞，用0.12％的胰蛋白酶消化，重懸，以2～3×10⁵個/ml接種，在上述增殖培養(yǎng)基中，20～30℃條件下培養(yǎng)2～3天。

其中，所述步驟1)中，

所述培養(yǎng)的溫度優(yōu)選地為28℃；培養(yǎng)的CO₂濃度為5％；

優(yōu)選地為，每4天換液一次；

接種細胞的濃度范圍為2～3×10⁵個/ml；優(yōu)選地，為2.5×10⁵個/ml

優(yōu)選地，所述培養(yǎng)的時間為2～3，優(yōu)選地為，3天。

本發(fā)明步驟1)中對羅非魚增殖培養(yǎng)的時間為14-20天，若培養(yǎng)低于14天，細胞傳代后無法正常增殖，最終細胞全部死亡。

其中，所述步驟2)中，

所述增殖培養(yǎng)基與步驟1)中增殖培養(yǎng)基組成相同；

所述培養(yǎng)的溫度優(yōu)選地為28℃；培養(yǎng)的CO₂濃度為5％；

優(yōu)選地為，每4天換液一次；

接種細胞的濃度范圍為2～3×10⁵個/ml；優(yōu)選地，為2.5×10⁵個/ml，所述培養(yǎng)2～3天時，細胞長至匯合階段，細胞可長滿細胞板。

本發(fā)明的一個具體實施例包括如下步驟：

(1)將剛剛死亡的羅非魚(700～900g)，剪斷鰓弓；

(2)無菌條件下，快速分離出腸系膜周圍的脂肪組織，直接放入Krebs-Henseleit緩沖液中，清洗三次，剪碎置于離心管中，再加入等體積的消化酶于28℃水浴震蕩消化1h；

(3)用100目的尼龍膜過濾懸浮的脂肪細胞，除去結(jié)締組織，清洗三次；

(4)加入紅細胞裂解液除去血細胞，用含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞。接種于細胞板中，28℃，5％CO₂條件下進行培養(yǎng)，每4天換液一次，待細胞長至匯合階段，更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

(5)誘導(dǎo)12天后對細胞進行油紅O染色，顯微鏡下觀察油紅染色結(jié)果。

在本發(fā)明的實驗方案中，所述的消化酶是II型膠原酶，濃度是1％。

本發(fā)明的另一個實施例包括，將上述步驟(4)的前脂肪細胞培養(yǎng)14-20天后，用0.12％的胰蛋白酶消化，重懸，以2～3×10⁵個/ml接種，培養(yǎng)2～3天，細胞可長滿細胞板。

本發(fā)明還提出了將所述增殖培養(yǎng)基用于對羅非魚前脂肪細胞增殖培養(yǎng)的應(yīng)用。

本發(fā)明還提出了將所述增殖培養(yǎng)基用于對羅非魚前脂肪細胞增殖培養(yǎng)和誘導(dǎo)中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提出了將所述增殖培養(yǎng)基在對羅非魚前脂肪細胞傳代中的應(yīng)用。

本發(fā)明提出了將所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基用于對羅非魚前脂肪細胞誘導(dǎo)的應(yīng)用。

另外，本發(fā)明所述的實驗方案中，所用的油紅O母液的配制方法為：稱取油紅O粉末350mg，溶于100ml異丙醇中，磁力攪拌過夜，之后通過孔徑大小為0.22μm的濾膜過濾后4℃保存。油紅O染液工作液的配制方法為：油紅O染料母液與超純水按體積比3：2的比例混合，室溫靜置10min，采用孔徑大小為0.22μm的濾膜過濾。

本發(fā)明的有益效果在于：(1)目前，脂肪細胞體外培養(yǎng)模型的研究主要集中在哺乳動物上(例如：大鼠、人和豬)，而魚類脂肪細胞體外培養(yǎng)的工作則處于起步階段；(2)建立了培養(yǎng)羅非魚前脂肪細胞，并誘導(dǎo)其分化為成熟的脂肪細胞，排除了外界環(huán)境和內(nèi)部因素對脂肪細胞脂代謝的影響，為研究羅非魚脂代謝提供了新的研究思路和技術(shù)手段；(3)本發(fā)明通過提取和培養(yǎng)羅非魚腹腔脂肪細胞，建立了熱帶魚脂肪細胞模型，推廣應(yīng)用方便，應(yīng)用前景廣泛；(4)本發(fā)明的方法可以成功地對羅非魚腹腔前脂肪細胞進行體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)，并實現(xiàn)體外傳代培養(yǎng)。

附圖說明

圖1為實施例1中將提取的羅非魚腹腔脂肪細胞接種于細胞板中，28℃，5％CO₂，剛貼壁的前細胞呈現(xiàn)透明圓形，胞內(nèi)無明顯脂滴，均勻分散在細胞板底部，具有增殖和分化功能。中性脂肪細胞中有較為明顯的脂滴，無增殖功能，在培養(yǎng)過程中，可通過細胞換液分離出去。

圖2為實施例1中羅非魚腹腔脂肪細胞培養(yǎng)7天的細胞狀態(tài)，細胞呈梭形并鋪滿整個細胞板板底，中性脂肪細胞大量減少

圖3為實施例1中誘導(dǎo)培養(yǎng)12天，脂肪細胞內(nèi)產(chǎn)生明顯的脂滴，在細胞中呈圓形分布。細胞邊緣模糊化，通過油紅染色可觀察被染色的脂滴，中性脂肪細胞幾乎消失。

圖4為高倍鏡下觀察誘導(dǎo)培養(yǎng)12天的脂肪的細胞形態(tài)，細胞膜邊緣模糊化，可見胞內(nèi)被油紅染為紅色的脂滴，數(shù)量較多，體積較大。

圖5為將長滿的細胞傳代至新的細胞板中，培養(yǎng)2～3天，細胞可鋪滿整個細胞板底。

圖6為使用草魚脂肪細胞誘導(dǎo)劑(草魚誘導(dǎo)培養(yǎng)基)處理12天，細胞分化情況。通過油紅染色，可見細胞中出現(xiàn)的脂滴模糊，無清晰的形態(tài)。中性脂肪細胞幾乎消失。

圖7為使用哺乳動物脂肪細胞誘導(dǎo)劑(哺乳動物誘導(dǎo)培養(yǎng)基)誘導(dǎo)處理12天，細胞分化情況。細胞中出現(xiàn)較為清晰的脂滴，圍繞細胞中心呈圓形分布，但數(shù)量和體積較少。

圖8為用含10％胎牛血清的增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天，細胞增殖速度較慢，且無法鋪滿整個板底。

圖9為細胞接種密度低于2～3×10⁵個/ml，培養(yǎng)7天，細胞無法鋪滿整個板底，且細胞數(shù)量不斷減少。

具體實施方式

結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明。本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以下實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護范圍。實施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。

在本發(fā)明中，脂肪組織或脂肪原料均來源于700～900g的羅非魚，若羅非魚體型偏小或是偏瘦，前脂肪細胞的增殖能力會受抑制。實驗時間，選在春秋季節(jié)較佳，冬季氣溫低，羅非魚的脂肪細胞增殖能力也會受抑制。

脂肪細胞誘導(dǎo)分化及檢測

由于前脂肪細胞具有增殖和分化的能力，在一定的條件下對前脂肪細胞進行誘導(dǎo)分化，能得到功能穩(wěn)定的成熟脂肪細胞。

對前脂肪細胞進行誘導(dǎo)的方法是向培養(yǎng)液中加入地塞美松(DEX)、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(IBMX)、吲哚美辛(Indo)以及胰島素(insulin)。因為前細胞膜上胰島素受體很少，所以需加超過生理濃度的胰島素，以其激活細胞膜上的IGF1受體，通過IGF1通路來誘導(dǎo)分化，前脂肪細胞誘導(dǎo)成脂進行檢測。

本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以使用通用的方法和染料對前脂肪細胞誘導(dǎo)成脂進行檢測。最常用的染料是Oil Red(O)，即油紅O。油紅O是一種紅色粉末，分子式為C26H24N4O。油紅O屬于偶氮染料，是很強的脂溶劑和染脂劑，與甘油三酯結(jié)合呈小脂滴狀。脂溶性染料能溶于組織和細胞中的脂類，它在脂類中的溶解度比在溶劑中大。當(dāng)對組織或細胞與染料接觸時，染料則離開染液而溶于組織或細胞內(nèi)的脂質(zhì)(如脂滴)中，使組織或細胞內(nèi)的脂滴呈橘紅色。在顯微鏡下可以清楚地進行成脂染色觀察。用異丙醇將細胞內(nèi)的油紅O溶出，通過檢測OD值，可以將成脂結(jié)果進行定量分析。

實施例1

本實施例以“體外提取和培養(yǎng)羅非魚(Tilapia)腹腔脂肪細胞”示例

1、實驗動物：

剛剛死亡的(也可以是從市場買回的，健康且無體表無損傷)的羅非魚(700～900g)

2、實驗步驟：

(1)剪斷鰓弓放血(若是健康的羅非魚，則需將羅非魚用MS-222麻醉)；

(2)無菌條件下，快速分離出腸系膜周圍的脂肪組織，直接放入Krebs-Henseleit緩沖液中，清洗三次，剪碎置于離心管中，再加入等體積的1％II型膠原酶于28℃水浴震蕩消化1h；

(3)用100目的尼龍膜過濾懸浮的脂肪細胞，除去結(jié)締組織，清洗三次；

(4)加入紅細胞裂解液除去血細胞，用含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，接種于細胞板中，28℃，5％CO₂條件下進行培養(yǎng)，每4天換液一次，待細胞長至匯合階段，更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

(5)誘導(dǎo)12天后對細胞進行油紅O染色，顯微鏡下觀察油紅染色結(jié)果。

本實施例中，步驟(4)中增殖培養(yǎng)基為含15％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。

本實施例中，步驟(4)中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基由含有15％胎牛血清和0.1％牛血清白蛋白的DMEM/F12培養(yǎng)基，然后加入15μg/ml胰島素(insulin)，0.2mM吲哚美辛(Indo)，1μM地塞美松(DEX)，0.5μM1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(IBMX)組成。

本實施例中，所用的油紅O母液的配制方法為：稱取油紅O粉末350mg，溶于100ml異丙醇中，磁力攪拌過夜，之后通過孔徑大小為0.22μm的濾膜過濾后4℃保存。油紅O染液工作液的配制方法為：油紅O染料母液與超純水按體積比3：2的比例混合，室溫靜置10min，采用孔徑大小為0.22μm的濾膜過濾。該工作液不能長效保存，宜現(xiàn)配現(xiàn)用。

本實施例中，生長狀態(tài)良好的細胞外觀透明，立體感強，且有觸足伸出。

本實施例中，誘導(dǎo)分化成功的細胞，其內(nèi)部出現(xiàn)大量脂滴，其他細胞器幾乎消失，細胞膜模糊化。

3、實驗結(jié)果

(1)如圖1所示，將提取的羅非魚腹腔脂肪細胞接種于細胞板，于28℃，5％CO₂培養(yǎng)。此時提取的前脂肪細胞剛貼壁時間短，鏡下顯示的為圓形細胞。

(2)如圖2所示，羅非魚腹腔脂肪細胞培養(yǎng)7天，前脂肪細胞可鋪滿整個細胞板。脂肪細胞在生長過程中，不斷伸展遷移，呈現(xiàn)出梭形結(jié)構(gòu)。

(3)如圖3所示，誘導(dǎo)培養(yǎng)12天，脂肪細胞內(nèi)產(chǎn)生明顯脂滴，油紅染色后，鏡下可觀察到細胞內(nèi)被染為紅色的脂滴。

(4)圖4為高倍鏡下觀察誘導(dǎo)培養(yǎng)12天的脂肪細胞的細胞形態(tài)，被油紅染成紅色的即為胞內(nèi)脂滴。

本發(fā)明通過提取和培養(yǎng)羅非魚腹腔脂肪細胞，體外誘導(dǎo)為成熟脂肪細胞，以研究羅非魚脂肪細胞增殖分化過程。為研究羅非魚脂代謝提供一個新的技術(shù)手段。

實施例2

實驗步驟(1)～(3)同實施例1；

步驟(4)中，加入紅細胞裂解液除去血細胞，用含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，接種于細胞板中，28℃，5％CO₂條件下進行培養(yǎng)，每4天換液一次，培養(yǎng)14～20天；

(5)將所述培養(yǎng)的前脂肪細胞，用0.12％的胰蛋白酶消化，重懸，以2～3×10⁵個/ml接種在增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2～3天，細胞可長滿細胞板。

本實施例中，傳代成功的細胞，可不斷增殖，2～3天即可長滿整個細胞板底。

圖5為將步驟(4)培養(yǎng)的細胞傳代至新的細胞板中，以2～3×10⁵個/ml接種，培養(yǎng)2～3天，細胞可鋪滿整個細胞板底。

實施例3

其他條件同實施例1，當(dāng)步驟(4)～(5)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基為草魚誘導(dǎo)培養(yǎng)基時，細胞產(chǎn)生的脂滴不明顯，如圖6所示為草魚誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)12天時，通過油紅染色，可見細胞中出現(xiàn)的脂滴模糊，細胞中幾乎看不到清晰的脂滴產(chǎn)生。中性脂肪細胞幾乎消失。

所述草魚誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成為15％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，胰島素20μg/ml，地塞米松1μmol/L，三碘甲腺原氨酸10nmol/L。

實施例4

其他條件同實施例1，當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為哺乳動物誘導(dǎo)培養(yǎng)基時，誘導(dǎo)處理12天，其結(jié)果如圖7所示，細胞中產(chǎn)生脂滴，較為明顯，圍繞細胞中心在胞內(nèi)呈圓形分布，但脂滴體積和數(shù)量較少。

其中，所示哺乳動物誘導(dǎo)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，其組成為：10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，15μg/ml胰島素，0.2mM吲哚美辛，1μM DEX，0.5μM IBMX。

實施例5

其他條件同實施例1，步驟(4)中增殖培養(yǎng)基為10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天，細胞增殖狀況如圖8所示；細胞增殖速度較慢，且無法鋪滿整個板底。

圖2為含15％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)7天時，細胞的增殖狀況。由圖8和圖2相比可知，含15％的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞增殖速度比含10％胎牛血清時的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞快。

實施例6

其他條件同實施例1，步驟(5)中接種密度低于或高于2～3×10⁵個/ml，細胞的增殖受到抑制。圖9為接種密度低于2～3×10⁵個/ml的密度接種的細胞，培養(yǎng)7天的結(jié)果。細胞稀疏，細胞無法持續(xù)增殖而鋪滿整個板底，且細胞數(shù)量不斷減少。

本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以上實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護范圍。