本發(fā)明一種利用蟬花生產(chǎn)纖溶酶的固體培養(yǎng)基及其生產(chǎn)纖溶酶方法屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種誘導(dǎo)的蟬擬青霉菌產(chǎn)生纖溶酶的固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：血栓性疾病是一類致死率比較高常見疾病，主要包括腦血栓、肺動(dòng)脈栓塞、冠狀動(dòng)脈血、靜脈血栓栓塞、動(dòng)脈粥樣血栓、外周動(dòng)脈血栓等，嚴(yán)重威脅人類健康。血栓疾病治療的方式主要有手術(shù)除栓和藥物除栓，現(xiàn)在主要通過(guò)藥物溶栓的方法進(jìn)行治療。據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界各類血栓疾病患者多達(dá)1500多萬(wàn)人，而且這種疾病正有向低齡化發(fā)展的趨勢(shì)，每年需要大量的溶栓藥物。目前的溶栓藥物根據(jù)作用方式分為兩類，一類是活化體內(nèi)的纖溶酶原，使其轉(zhuǎn)化為纖溶酶發(fā)揮溶栓作用（間接作用）；另一類是對(duì)纖維蛋白具有降解作用，可以直接水解纖維蛋白從而達(dá)到溶栓作用（直接作用）。纖溶酶應(yīng)該具有良好的特異性，即要達(dá)到溶栓的作用，又要副作用小，安全可靠。目前，在動(dòng)物，植物，微生物，海洋微生物中都發(fā)現(xiàn)有天然來(lái)源的纖溶酶，但由于纖溶酶是一種蛋白質(zhì)，往往具有抗原性過(guò)敏反應(yīng)。蟬擬青霉(Paecilomycescicadae)是一種蟲生真菌，屬半知菌類炭角菌科。蟬擬青霉菌可以感染竹蟬的若蟲，形成似花朵狀的子座稱為蟬花，是我國(guó)的一種傳統(tǒng)中藥。其有性階段為Cordycepscicadae。蟬擬青霉不但有許多醫(yī)療保健作用，同時(shí)已經(jīng)有上千年的食用歷史，其安全性得到長(zhǎng)期驗(yàn)證。由于蟬擬青霉已經(jīng)能夠人工培養(yǎng)，為實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)打下了基礎(chǔ)。雖然其他蟲草真菌如冬蟲夏草（Cordycepssinensis）和蛹蟲草（cordycepsmilitaris）中已經(jīng)有纖溶酶的報(bào)道，但在蟬擬青霉中還沒(méi)有報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是針對(duì)上述不足之處提供一種利用蟬花生產(chǎn)纖溶酶的固體培養(yǎng)基及其生產(chǎn)纖溶酶方法。本發(fā)明比較了多種培養(yǎng)基對(duì)蟬擬青霉產(chǎn)生纖溶酶的影響，篩選到了可以高效誘導(dǎo)蟬擬青霉產(chǎn)生纖溶酶的固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。一種利用蟬花生產(chǎn)纖溶酶的固體培養(yǎng)基及其生產(chǎn)纖溶酶方法是采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種利用蟬花生產(chǎn)纖溶酶的固體培養(yǎng)基包括有效成份蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氫鉀、酵母提取物、7水硫酸鎂、瓊脂和水，其有效成份重量份配比蛋白胨10、葡萄糖30、磷酸二氫鉀1、酵母提取物3、7水硫酸鎂0.2、瓊脂15g、水1000。本發(fā)明比較了多種培養(yǎng)基對(duì)蟬擬青霉產(chǎn)生纖溶酶的影響，篩選到了可以高效誘導(dǎo)蟬擬青霉產(chǎn)生纖溶酶的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。用固體培養(yǎng)基發(fā)酵，蟬擬青霉產(chǎn)生纖溶酶優(yōu)選固體培養(yǎng)基重量份配比是：蛋白胨8-15、葡萄糖30、磷酸二氫鉀1、酵母提取物3、7水硫酸鎂0.2、瓊脂15、水1000。培養(yǎng)時(shí)間可延長(zhǎng)到15天，以增加培養(yǎng)時(shí)間。一種利用蟬花生產(chǎn)纖溶酶的固體培養(yǎng)基生產(chǎn)纖溶酶方法，步驟如下：①將蟬擬青霉菌株（B5）接種到直徑9cm的PDA平板上，25℃培養(yǎng)5天。②將配好的上述固體培養(yǎng)基（固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基）經(jīng)121℃滅菌20min,然后倒入直徑9cm的滅菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿倒15mL培養(yǎng)基，冷卻30min,制成固體平板。用挑針挑取1塊約3×3mm2的菌絲塊，接種到配好的上述固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)6-15天。③將培養(yǎng)好的菌落置于-70℃的冰箱中過(guò)夜，然后取帶培養(yǎng)基的菌絲塊加入等重量的無(wú)菌水中，搗碎后靜置10min,然后10000轉(zhuǎn)高速離心分離5分鐘，取上清液作為纖溶酶粗提液備用。一種利用蟬花生產(chǎn)纖溶酶的固體培養(yǎng)基及其生產(chǎn)纖溶酶方法優(yōu)點(diǎn)：①蟬花已經(jīng)長(zhǎng)期食用，證明對(duì)人體安全可靠，不會(huì)產(chǎn)生不良免疫反應(yīng)；②本培養(yǎng)基配方簡(jiǎn)單，容易配制。③用本培養(yǎng)基，生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)單，只要在合適溫度條件下（23-28℃），靜置培養(yǎng)，纖溶酶即可大量分泌到培養(yǎng)基中。④適用于大量生產(chǎn)。附圖說(shuō)明以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：圖1是以尿激酶的纖溶酶活性制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2是不同誘導(dǎo)成分的液體培養(yǎng)基產(chǎn)生的纖溶酶活性的測(cè)定示意圖。圖中A：蛋白胨；B：酸水解酪蛋白；C：胰蛋白胨；D：淀粉；E：酪蛋白；F：麥芽浸膏；G：奶粉；H：大豆胨；CK：基本培養(yǎng)基。圖3是不同含量的誘導(dǎo)物對(duì)纖溶酶的誘導(dǎo)結(jié)果。具體實(shí)施方式參照附圖1、2、3，一種利用蟬花生產(chǎn)纖溶酶的固體培養(yǎng)基包括有效成份蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氫鉀、酵母提取物、7水硫酸鎂、瓊脂和水，其有效成份重量份配比蛋白胨8-15、葡萄糖30、磷酸二氫鉀1、酵母提取物3、7水硫酸鎂0.2、瓊脂15g、水1000。本發(fā)明比較了多種培養(yǎng)基對(duì)蟬擬青霉產(chǎn)生纖溶酶的影響，篩選到了可以高效誘導(dǎo)蟬擬青霉產(chǎn)生纖溶酶的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。用固體培養(yǎng)基發(fā)酵，蟬擬青霉產(chǎn)生纖溶酶優(yōu)選培養(yǎng)基重量份配比是：蛋白胨10、葡萄糖30、磷酸二氫鉀1、酵母提取物3、7水硫酸鎂0.2、瓊脂15、水1000。培養(yǎng)時(shí)間可延長(zhǎng)到15天，以增加培養(yǎng)時(shí)間。一種利用蟬花生產(chǎn)纖溶酶的固體培養(yǎng)基生產(chǎn)纖溶酶方法，步驟如下：①將蟬擬青霉菌株（B5）接種到直徑9cm的PDA平板上，25℃培養(yǎng)5天。②將配好的上述固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基經(jīng)121℃滅菌20min,然后倒入直徑9cm的滅菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿倒15mL培養(yǎng)基，冷卻30min,制成固體平板。用挑針挑取1塊約3×3mm2的菌絲塊，接種到配好的上述固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)6-15天。③將培養(yǎng)好的菌落置于-70℃的冰箱中過(guò)夜，然后取帶培養(yǎng)基的菌絲塊加入等重量的無(wú)菌水中，搗碎后靜置10min,然后10000轉(zhuǎn)高速離心分離5分鐘，取上清液作為纖溶酶粗提液備用。實(shí)施例1：一種利用蟬花生產(chǎn)纖溶酶的固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法（篩選方法）：1所用的培養(yǎng)基（1）基本培養(yǎng)基：葡萄糖30g、磷酸二氫鉀1g、酵母提取物3g、7水硫酸鎂0.2g、水1000g。水1000g相當(dāng)于水1000mL。（2）纖溶酶固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中分別加入下面不同的誘導(dǎo)成分各10g：蛋白胨（peptone）,酸水解酪蛋白，胰蛋白胨(tryptone),淀粉，酪蛋白（casein）,麥芽浸膏（maltextract）,奶粉，大豆胨（Soytone）,配成成分不同的誘導(dǎo)纖溶酶培養(yǎng)基。最后在以上各種培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂。常規(guī)的高溫滅菌（1.1個(gè)大氣壓，121℃下滅菌20min）。（3）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potatodextroseagar,PDA）：將馬鈴薯200g切成小塊，加水煮沸15min，然后2層紗布過(guò)濾后，棄去馬鈴薯塊，在過(guò)濾液中加入葡萄糖20g、瓊脂20g中加蒸餾水定容至1000mL；然后進(jìn)行常規(guī)的高溫滅菌（1.1個(gè)大氣壓，121℃下滅菌20min）。2蟬擬青霉中纖溶酶的固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)：①將蟬擬青霉菌株（B5）接種到直徑9cm的PDA平板上，25℃培養(yǎng)5天。②用挑針挑取1塊約3×3mm2的菌絲塊，分別接種到各種配好的固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)6天。③將培養(yǎng)好的菌落置于-70℃的冰箱中過(guò)夜，然后取帶培養(yǎng)基的菌絲塊0.5g轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中,加入0.5mL無(wú)菌水，搗碎后靜置10min,然后10000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清液作為纖溶酶粗提液備用。3纖維蛋白凝固平板的制備：①配制50mMTris–HCl緩沖液(pH7.8)：1.稱量1.21gTris于100ml燒杯中；2.加入約80ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙猓?.加入約0.5ml的濃鹽酸調(diào)PH至7.84.定容到200ml5.高溫高壓滅菌后，室溫保存。②將0.25g纖維蛋白原溶解到50mL配好的Tris–HCl緩沖液中，配成0.5%w/v的纖維蛋白原溶液。③纖溶蛋白平板的制備：0.1g瓊脂糖加入5ml水中滅菌，冷卻到約45℃時(shí)，然后再加入凝血酶溶液0.1mL，加入5mL纖維蛋白原溶液，混合均勻后倒平板，平板放置3h左右后打孔點(diǎn)樣。4以尿激酶的纖溶酶活性制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用無(wú)菌pH7.5的Tris-Hcl溶解適量尿激酶標(biāo)準(zhǔn)樣品，用生理鹽水稀釋濃度為20U/mL，40U/mL，60U/mL，80U/mL，lOOU/mL的尿激酶溶液。一個(gè)板放置在85℃，孵育30min，另一個(gè)放在室溫半小時(shí)后，同時(shí)打孔。分別吸取10μL尿激酶溶液測(cè)酶活。于37℃恒溫孵育18h觀察并測(cè)量透明圈的垂直直徑，計(jì)算其平均值（表1），以平均直徑的乘積作為縱坐標(biāo)，尿激酶濃度為橫坐標(biāo)，用Excel建立酶活力與溶圈直徑之間的回歸方程，制作尿激酶的纖溶酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1尿激酶的纖溶酶活性在纖溶平板上產(chǎn)生的透明圈的面積纖溶酶活性(U/mL)纖溶平板直徑的平方（mm2)100301.4480241.7860201.7040141.302052.0300得到的回歸方程為：y=0.417x-62.54。y為透明圈直徑的平方，x為纖溶酶酶活單位。5蟬擬青霉纖溶酶活性的檢測(cè)：將2,3部分得到的酶粗提液各10μL，在4部分制備的纖維蛋白平板上測(cè)定纖溶酶的活性，量出透明圈直徑，（圖1）根據(jù)回歸方程計(jì)算各種培養(yǎng)基誘導(dǎo)蟬花產(chǎn)生纖溶酶的結(jié)果如下表：表2不同誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn)生的纖溶酶活性篩選培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)成分固體培養(yǎng)基酶活(U/mL)蛋白胨45.1222酸水解酪蛋白0胰蛋白胨38.25502淀粉1.63006酪蛋白0麥芽浸膏26.0467奶粉1.63006大豆胨37.65502篩選結(jié)果表明，對(duì)蟬花產(chǎn)生纖溶酶的效果，蛋白胨的誘導(dǎo)能力最好，其次是胰蛋白胨。實(shí)施例2：qianrongm纖溶酶活性(U/mL)利用蟬花生產(chǎn)纖溶酶的固體培養(yǎng)基的誘導(dǎo)成分的優(yōu)化：1所用的培養(yǎng)基（4）基本培養(yǎng)基：葡萄糖30g、磷酸二氫鉀1g、酵母提取物3g、7水硫酸鎂0.2g、水1000g。水1000g相當(dāng)于水1000mL。（5）纖溶酶固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中分別加入蛋白胨和胰蛋白胨。蛋白胨（peptone）的測(cè)試含量梯度是7個(gè)，分別是5g、7.5g、10g、12.5g、15g、17.5g、20g；胰蛋白胨(tryptone)的測(cè)試含量梯度是7個(gè)，分別是5g、7.5g、10g、12.5g、15g、17.5g、20g。按照以上成分配成成分不同的誘導(dǎo)纖溶酶培養(yǎng)基。最后在以上各種培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂。常規(guī)的高溫滅菌（1.1個(gè)大氣壓，121℃下滅菌20min）。（6）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potatodextroseagar,PDA）：將馬鈴薯200g切成小塊，加水煮沸15min，然后2層紗布過(guò)濾后，棄去馬鈴薯塊，在過(guò)濾液中加入葡萄糖20g、瓊脂20g中加蒸餾水定容至1000mL；然后進(jìn)行常規(guī)的高溫滅菌（1.1個(gè)大氣壓，121℃下滅菌20min）。2蟬擬青霉中纖溶酶的固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)：①將蟬擬青霉菌株（B5）接種到直徑9cm的PDA平板上，25℃培養(yǎng)5天。②用挑針挑取1塊約3×3mm2的菌絲塊，分別接種到各種配好的固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)6天。③將培養(yǎng)好的菌落置于-70℃的冰箱中過(guò)夜，然后取帶培養(yǎng)基的菌絲塊0.5g轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中,加入0.5mL無(wú)菌水，搗碎后靜置10min,然后10000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清液作為纖溶酶粗提液備用。3纖維蛋白凝固平板的制備：②配制50mMTris–HCl緩沖液(pH7.8)：1.稱量1.21gTris于100ml燒杯中；2.加入約80ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙猓?.加入約0.5ml的濃鹽酸調(diào)PH至7.84.定容到200ml5.高溫高壓滅菌后，室溫保存。②將0.25g纖維蛋白原溶解到50mL配好的Tris–HCl緩沖液中，配成0.5%w/v的纖維蛋白原溶液。③纖溶蛋白平板的制備：0.1g瓊脂糖加入5ml水中滅菌，冷卻到約45℃時(shí)，然后再加入凝血酶溶液0.1mL，加入5mL纖維蛋白原溶液，混合均勻后倒平板，平板放置3h左右后打孔點(diǎn)樣。4以尿激酶的纖溶酶活性制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用無(wú)菌pH7.5的Tris-Hcl溶解適量尿激酶標(biāo)準(zhǔn)樣品，用生理鹽水稀釋濃度為20U/mL，40U/mL，60U/mL，80U/mL，lOOU/mL的尿激酶溶液。一個(gè)板放置在85℃，孵育30min，另一個(gè)放在室溫半小時(shí)后，同時(shí)打孔。分別吸取10μL尿激酶溶液測(cè)酶活。于37℃恒溫孵育18h觀察并測(cè)量透明圈的垂直直徑，計(jì)算其平均值（同表1），以平均直徑的乘積作為縱坐標(biāo)，尿激酶濃度為橫坐標(biāo)，用Excel建立酶活力與溶圈直徑之間的回歸方程，制作尿激酶的纖溶酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線（同圖1）。得到的回歸方程為：y=0.417x-62.54。y為透明圈直徑的平方，x為纖溶酶酶活單位。5蟬擬青霉纖溶酶活性的檢測(cè)：將2,3部分得到的酶粗提液各10μL，在4部分制備的纖維蛋白平板上測(cè)定纖溶酶的活性，量出透明圈直徑，根據(jù)回歸方程計(jì)算各種培養(yǎng)基誘導(dǎo)蟬花產(chǎn)生纖溶酶的結(jié)果如下表：表3蛋白胨不同含量（1000g水中）對(duì)蟬花產(chǎn)生纖溶酶活性的誘導(dǎo)結(jié)果蛋白胨纖溶酶活性(U/mL)胰蛋白胨纖溶酶活性(U/mL)5g30.2125g20.4467.5g40.4247.5g32.22310g45.12210g38.22512.5g45.02412.5g36.22215g43.63615g34.11217.5g40.12217.5g31.55620g30.22620g26.224根據(jù)結(jié)果，以誘導(dǎo)物含量為橫坐標(biāo)，以誘導(dǎo)產(chǎn)生的纖溶酶活性為縱坐標(biāo)，制作曲線圖如圖3.由圖3可知，以蛋白胨為誘導(dǎo)物，在8-15g范圍內(nèi)（1000g水中）,可以得到較好的誘導(dǎo)結(jié)果。從上述圖表中可以看出，用固體培養(yǎng)基發(fā)酵，蟬擬青霉產(chǎn)生纖溶酶最好的培養(yǎng)基配方是：蛋白胨8-15g、葡萄糖30g、磷酸二氫鉀1g、酵母提取物3g、7水硫酸鎂0.2g、瓊脂15g、水1000g。培養(yǎng)時(shí)間可延長(zhǎng)到15天，以增加培養(yǎng)時(shí)間。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3