本發(fā)明涉及一種RNA的提取方法，特別涉及一種人全血凍存樣本RNA的提取方法。

背景技術(shù)：

當(dāng)前，人全血是臨床上最容易獲得的樣本之一，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究、特別是臨床診斷治療研究。只有從人全血提取高質(zhì)量的總RNA，才能進(jìn)行RT-PCR、基因測(cè)序等進(jìn)一步檢測(cè)。但是從人全血提取高質(zhì)量的總RNA存在很大的技術(shù)難點(diǎn)。人體外周血中無(wú)核細(xì)胞和有核細(xì)胞的比例約500:1，大量紅細(xì)胞的存在會(huì)影響有核細(xì)胞中的RNA的提取。受實(shí)驗(yàn)時(shí)間空間的限制，拿到人全血樣本后,有時(shí)不方便馬上提取RNA,需要凍存全血樣本，再選擇合適的時(shí)間提取RNA。凍存血細(xì)胞在處理保存過(guò)程中，特別是溶化過(guò)程中，總RNA難免降解。

已經(jīng)上市的QIAGEN生產(chǎn)的QIAamp RNA Blood Mini Kit用于從人全血提取總RNA,但是只能用于新鮮全血的RNA提取，價(jià)格也比較貴。Takara寶生物生產(chǎn)的RNAiso plus是一款廣譜型總RNA提取試劑，說(shuō)明書(shū)中提到它可以用于動(dòng)物組織、植物材料、各種微生物和培養(yǎng)細(xì)胞，但是沒(méi)提到它可以用于人全血。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中從人全血提取高質(zhì)量的RNA比較困難的問(wèn)題而提供的一種人全血凍存樣本RNA的提取方法。

本發(fā)明提供的人全血凍存樣本RNA的提取方法，其方法如下所述：

步驟一、人血的處理：

(1)、用紫帽采血管取血液標(biāo)本，采6ml，每次RNA提取0.1ml血細(xì)胞；

(2)、使用通用臺(tái)式離心機(jī)離心，在3000rpm離心條件下離心10分鐘，離心后上層為淡黃色血漿，下層為全血細(xì)胞；

(3)、標(biāo)記1.5ml無(wú)RNA酶管，P代表血漿，B代表全血細(xì)胞，此外管上標(biāo)記樣本號(hào)、日期，以無(wú)菌無(wú)RNA酶槍頭小心地將血漿、全血細(xì)胞分別裝入EP管；

(4)、取全血細(xì)胞0.1ml，加入Trizol 1ml，用于裂解細(xì)胞，保護(hù)RNA，使用振蕩器充分振蕩，振蕩20秒，用槍吹吸5次，至均質(zhì)狀；

(5)、血液標(biāo)本處理完成后，繼續(xù)下面的步驟，或者將樣本放入-80℃冰箱保存；

步驟二、從血液細(xì)胞提取RNA：

(1)、全血細(xì)胞和Trizol的混合物，凍存樣本先解凍，室溫靜止孵育5分鐘；

(2)、每管加入0.2ml的氯仿，1ml Trizol加入0.2ml氯仿，用手振蕩15秒，之后室溫靜置3分鐘；

(3)、用冷凍微量離心機(jī)，在12000g離心條件下離心15分鐘；

(4)、在1.5ml無(wú)RNA酶的EP新管上標(biāo)號(hào)，將(3)中離心后傾斜45度上層透明部分全部轉(zhuǎn)入新管，加入異丙醇0.5ml，1ml Trizol對(duì)應(yīng)用量0.5ml異丙醇，振蕩，室溫靜置10分鐘；

(5)、用冷凍微量離心機(jī)，在4℃、12000g離心條件下離心10分鐘；

(6)、RNA沉于管低，完全除去上清，加入75％乙醇1ml，0.75ml無(wú)水乙醇加0.25ml DEPC處理水，溫和地上下翻轉(zhuǎn)；

(7)、用冷凍微量離心機(jī)，在4℃、7500g離心條件下離心5分鐘；

(8)、倒上清液，在RNA沉淀對(duì)側(cè)倒液，別倒掉RNA pellet，用槍頭取出盡可能多的乙醇；

(9)、干燥，空氣中3分鐘晾干；

(10)、根據(jù)RNA沉淀大小加入去核糖核酸酶水20-40ul，用槍吹打數(shù)次，55度溫度條件孵育10分鐘，溶解RNA，最后小管分裝；

(11)、使用酶標(biāo)儀，測(cè)定RNA濃度，上樣量為2微升，RNA濃度：(A260-A320)×稀釋倍數(shù)×40μg/ml，A260/A280：1.8-2.1可以滿足要求，>2.1可能說(shuō)明RNA降解，<1.6可能說(shuō)明有蛋白雜質(zhì)；

(12)、RNA樣品的保存：可以-80℃保存或繼續(xù)下一步；

(13)、使用Agilent 2100生物分析儀和RNA 6000Nano分析試劑盒測(cè)定RNA質(zhì)量，按說(shuō)明書(shū)操作，上樣量1微升，檢測(cè)核糖體18S和28S的強(qiáng)度，RIN值越接近于10說(shuō)明RNA完整性越好。

本發(fā)明的有益效果：

降低樣本量，只需要全血細(xì)胞0.1ml,相當(dāng)于全血約0.2ml；提高RNA質(zhì)量，RIN值達(dá)到7.7以上；Trizol法簡(jiǎn)化操作，為醫(yī)學(xué)研究、臨床診斷治療研究提供方法。

附圖說(shuō)明

圖1為現(xiàn)有方法中所獲得的RNA質(zhì)量結(jié)果圖。

圖2為本發(fā)明提供方法所獲得的RNA質(zhì)量結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供的人全血凍存樣本RNA的提取方法，其方法如下所述：

步驟一、人血的處理：

(1)、用紫帽采血管取血液標(biāo)本，采6ml，每次RNA提取0.1ml血細(xì)胞；

(2)、使用通用臺(tái)式離心機(jī)離心，在3000rpm離心條件下離心10分鐘。離心后上層為淡黃色血漿，下層為全血細(xì)胞；

(3)、標(biāo)記1.5ml無(wú)RNA酶管，P代表血漿，B代表全血細(xì)胞，此外管上標(biāo)記樣本號(hào)、日期，以無(wú)菌無(wú)RNA酶槍頭小心地將血漿、全血細(xì)胞分別裝入EP管；

(4)、取全血細(xì)胞0.1ml，加入Trizol 1ml，用于裂解細(xì)胞，保護(hù)RNA，使用振蕩器充分振蕩，振蕩20秒，用槍吹吸5次，至均質(zhì)狀；

(5)、血液標(biāo)本處理完成后，繼續(xù)下面的步驟，或者將樣本放入-80℃冰箱保存；

步驟二、從血液細(xì)胞提取RNA：

(1)、全血細(xì)胞和Trizol的混合物，凍存樣本先解凍，室溫靜止孵育5分鐘；

(2)、每管加入0.2ml的氯仿，1ml Trizol加入0.2ml氯仿，用手振蕩15秒，之后室溫靜置3分鐘；

(3)、用冷凍微量離心機(jī)，在12000g離心條件下離心15分鐘。

(4)、在1.5ml無(wú)RNA酶的EP新管上標(biāo)號(hào)，將(3)中離心后傾斜45度上層透明部分全部轉(zhuǎn)入新管，加入異丙醇0.5ml，1ml Trizol對(duì)應(yīng)用量0.5ml異丙醇，振蕩，室溫靜置10分鐘；

(5)、用冷凍微量離心機(jī)，在4℃、12000g離心條件下離心10分鐘；

(6)、RNA沉于管低，完全除去上清，加入75％乙醇1ml，0.75ml無(wú)水乙醇加0.25ml DEPC處理水，溫和地上下翻轉(zhuǎn)；

(7)、用冷凍微量離心機(jī)，在4℃、7500g離心條件下離心5分鐘；

(8)、倒上清液，在RNA沉淀對(duì)側(cè)倒液，別倒掉RNA pellet，用槍頭取出盡可能多的乙醇；

(9)、干燥，空氣中3分鐘晾干；

(10)、根據(jù)RNA沉淀大小加入去核糖核酸酶水20-40ul，用槍吹打數(shù)次，55度溫度條件孵育10分鐘，溶解RNA，最后小管分裝；

(11)、使用全功能酶標(biāo)儀，測(cè)定RNA濃度，上樣量為2微升，RNA濃度：(A260-A320)×稀釋倍數(shù)×40μg/ml，A260/A280：1.8-2.1可以滿足要求，>2.1可能說(shuō)明RNA降解，<1.6可能說(shuō)明有蛋白雜質(zhì)；

(12)、RNA樣品的保存：可以-80℃保存或繼續(xù)下一步；

(13)、使用Agilent 2100生物分析儀和RNA 6000Nano分析試劑盒測(cè)定RNA質(zhì)量，按說(shuō)明書(shū)操作，上樣量1微升，檢測(cè)核糖體18S和28S的強(qiáng)度，RIN值越接近于10說(shuō)明RNA完整性越好。

上述方法中所用的試劑及設(shè)備如下所述：

(一)試劑耗材：

苯酚：英杰生命科技有限公司；

異丙醇：英杰生命科技有限公司(貨號(hào):I9030)；

氯仿：廣州瑞舒；

Trizol:為總RNA提取試劑TRIzol，為英杰生命科技有限公司生產(chǎn)，貨號(hào):15596-018；

去核糖核酸酶水：上海生工(貨號(hào):7732-18-5)；

乙醇：阿拉丁生化科技股份有限公司(貨號(hào):E1230038)；

RNA 6000Nano分析試劑盒：為微量總RNA分析試劑盒：安捷倫科技有限公司(貨號(hào):5067-1511)；

采血管：紫帽管(含2％EDTA抗凝劑)；

1.5ml無(wú)RNA酶EP管；

無(wú)菌無(wú)RNA酶槍頭；

(二)設(shè)備:

Agilent 2100生物分析儀：為安捷倫2100生物分析儀(安捷倫科技有限公司，美國(guó)加利福尼亞州圣克拉拉市)，利用微流控技術(shù)平臺(tái)檢測(cè)核糖體18S和28S的強(qiáng)度，使用RNA分子完整值(RIN)來(lái)確定RNA的完整性(RIN值已經(jīng)成為RNA研究領(lǐng)域內(nèi)質(zhì)量評(píng)估的黃金標(biāo)準(zhǔn))。

全功能酶標(biāo)儀：美國(guó)伯騰儀器有限公司，美國(guó)佛蒙特州威努斯基市，測(cè)量RNA濃度，通過(guò)樣本在260nm和280nm波長(zhǎng)的吸收度確定RNA純度。

通用臺(tái)式離心機(jī)：型號(hào)：heraeus multifuge x1r賽默飛世爾科技有限公司，美國(guó)馬薩諸塞州沃爾瑟姆市。

冷凍微量離心機(jī)：型號(hào)：Thermo Scientific Heraeus Fresco 21賽默飛世爾科技有限公司，美國(guó)馬薩諸塞州沃爾瑟姆市。

振蕩器：型號(hào)：QL901海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司。

本發(fā)明所述方法與現(xiàn)有技術(shù)方法的結(jié)果比較：

(一)現(xiàn)有技術(shù)：凍存全血細(xì)胞，細(xì)胞的量/Trizol的量＝1:3的結(jié)果(圖1所示)，圖1中用現(xiàn)有技術(shù)從凍存全血細(xì)胞提取的RNA樣本，用Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)的結(jié)果。樣本1.RIN:2.60；樣本3.RIN:3.00；樣本6.RIN:6.60；樣本11.RIN:2.30；其他樣本的RIN值都測(cè)不到。圖片上方黑色長(zhǎng)方形表示RIN值測(cè)不到。

(二)本發(fā)明提供方法：凍存或新鮮全血，細(xì)胞的量/Trizol的量＝1:10的結(jié)果(圖2所示)，圖2中用本發(fā)明提供方法技術(shù)從全血細(xì)胞提取的RNA樣本，用Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)的結(jié)果。樣本1.RIN:9.20；樣本2.RIN:9.30；樣本3.RIN:2.00；樣本4.RIN:1.10；樣本5.RIN:8.80；樣本6.RIN:7.70；樣本7.RIN:3.20；樣本8.RIN:6.10；樣本9.RIN:8.00；樣本10.RIN:8.50；樣本11.RIN:測(cè)不到。圖片上方黑色長(zhǎng)方形表示RIN值測(cè)不到。樣本1和2是新鮮全血按照試劑盒說(shuō)明書(shū)用柱提(QIAamp RNA Blood Mini kit)的結(jié)果；樣本3、4和11是凍存全血按照試劑盒說(shuō)明書(shū)用柱提(QIAamp RNA Blood Mini kit)的結(jié)果；樣本5和6是新鮮全血用發(fā)明技術(shù)提的結(jié)果；樣本7和8是凍存全血用發(fā)明技術(shù)提的結(jié)果；樣本9和10是加Trizol后凍存全血用發(fā)明技術(shù)提的結(jié)果。