本發(fā)明屬于病毒擴增生物技術領域，具體涉及一種血清4型禽腺病毒懸浮培養(yǎng)擴增方法。

背景技術：

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬，分為5種(A-E)，12個血清型。FAdV感染一般引起亞臨床狀況，而急性感染主要引起包涵體肝炎、心包積液以及肌胃糜爛等。自2013年起，國內雞群由FAdV引起的包涵體肝炎、心包積液病例逐漸增多。到2015年，F(xiàn)AdV感染在國內多個省份雞群暴發(fā)。目前FAdV暴發(fā)不僅發(fā)生在3-4周齡肉雞，還發(fā)生于10-20周齡的蛋雞，給國內養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴重經(jīng)濟損失。

病毒分離鑒定發(fā)現(xiàn)，目前高致病性4型FAdV在國內雞群流行較廣泛。然目前尚無針對血清4型FAdV的商品化疫苗。在疫苗的研制中，病毒效價的高低不僅影響免疫效果，而且直接影響疫苗成本及價格。病毒的雞胚接種是禽用病毒疫苗常用的擴增技術。雖然血清4型FAdV病毒能在雞胚中生長復制，但是雞胚中擴增的血清4型FAdV病毒滴度較低，不能滿足疫苗生產(chǎn)高效價的要求。另外，血清4型FAdV病毒雖然能在雞肝細胞中有效復制，但是普通細胞培養(yǎng)也很難滿足疫苗的規(guī)?；a(chǎn)要求。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是在于提供一種血清4型禽腺病毒懸浮培養(yǎng)擴增方法。本發(fā)明的原理和最核心的關鍵技術是利用雞肝細胞，通過激流式生物反應器懸浮培養(yǎng)技術高效擴增血清4型禽腺病毒，所培養(yǎng)的4型FAdV病毒滴度高，且滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。

實現(xiàn)本發(fā)明的技術解決方案是通過提取所述血清4型禽腺病毒基因組DNA，以其病毒DNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增，后將病毒接種于雞肝細胞，通過細胞懸浮培養(yǎng)技術高效擴增血清4型禽腺病毒。

本發(fā)明一種血清4型禽腺病毒懸浮培養(yǎng)擴增方法，具體包括如下步驟：

(1)血清4型禽腺病毒分離鑒定：取疑似血清4型禽腺病毒感染的病死雞的肝臟，研碎后按1:5的比例加入PBS制成懸液；經(jīng)0.45um微孔濾器過濾后，經(jīng)尿囊腔接種8日齡SPF雞胚，接種后收取尿囊液。取尿囊液400μL于1.5mL指形管內，加入400μL細胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20mmol/L EDTA pH 8.0，2％SDS和蛋白酶K)裂解后，酚：氯仿：異戊醇抽提病毒基因組DNA，并通過乙醇沉淀后溶于30μL滅菌超純水。取2μL提取的病毒DNA作為模板,利用特異性引物進行PCR擴增，

特異性引物序列為：

上游引物：5’-AATTTCGACCCCATGACGCGCCAGG-3’；

下游引物：5’-TGGCGAAAGGCGTACGGAAGTAAGC-3’

PCR產(chǎn)物于90V電壓下經(jīng)1％瓊脂糖凝膠進行電泳。切下PCR特異性產(chǎn)物片段送至南京金斯瑞公司進行序列分析確定為血清4型禽腺病毒。

(2)血清4型禽腺病毒懸浮培養(yǎng)：將病毒接種于雞肝細胞，利用激流式生物反應器擴增血清4型禽腺病毒。懸浮培養(yǎng)激流式生物反應器主要培養(yǎng)條件參數(shù)為：反應器轉速為40r/min、200g載體初始細胞接種為1×10⁹個、細胞培養(yǎng)液為10％FBS血清的DMEM/F12培養(yǎng)液、病毒感染及維持液為含2％FBS血清的DMEM/F12培養(yǎng)基、最適PH為7.0-7.2、病毒接種量MOI為0.1以及病毒收獲時間為接種后96小時。

病毒接種于雞肝細胞之前對雞肝細胞進行培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)液為10％FBS血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，最適PH為7.0-7.2。

簡要步驟如下：接種雞肝細胞后，每隔24h取樣測糖耗。當殘?zhí)橇康陀?.5g/L，定量補充葡萄糖或進行換液。細胞生長6天后進行病毒的接種。通過激流袋將灌注袋及激流袋的細胞培養(yǎng)液全部排出，然后在激流袋中加入6L含200ml胎牛血清的DMEM/F12維持液，在灌注袋中接入4L不含血清的4型禽腺病毒(MOI為0.1TCID₅₀)DMEM/F12，吸附1h后，開始循環(huán)培養(yǎng)。感染后96小時后收集病毒、分裝，并測定病毒效果。結果顯示通過懸浮培養(yǎng)擴增的三批血清4型禽腺病毒效價分別達10^8.16，10^8.25以及10^8.0TCID₅₀/ml。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：本發(fā)明本發(fā)明利用雞肝細胞，建立的血清4型禽腺病毒懸浮培養(yǎng)擴增方法，能實現(xiàn)對血清4型禽腺病毒高效擴增，與雞胚接種比較，病毒滴度比雞胚接種培養(yǎng)病毒高100倍以上(傳統(tǒng)雞胚毒效價小于10^6.0TCID₅₀/ml)。這一血清4型禽腺病毒懸浮培養(yǎng)擴增方法為研制血清4型禽腺病毒疫苗提供了技術，具有很好的應用價值。

附圖說明

圖1是PCR擴增血清4型禽腺病毒特異性DNA片段(泳道1：PCR擴增產(chǎn)物；泳道M：1Kb DNA Ladder)。

具體實施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面通過具體的實施例來具體說明本發(fā)明的技術方案。

實施例：

1、血清4型禽腺病毒分離鑒定：取疑似禽腺病毒感染的病死雞的肝臟，研碎后用按1:5的比例加入PBS制成懸液；5000r/min離心15min，取上清液；加入青霉素和鏈霉素各1000IU/ml，37℃反應30min；經(jīng)0.45um微孔濾器過濾后，以0.2ml/胚的劑量，經(jīng)尿囊腔接種8日齡SPF雞胚，接種后96-120小時后收取尿囊液；－20℃保存。取尿囊液400μL于1.5mL指形管內，加入400μL細胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20mmol/L EDTA pH 8.0，2％SDS和蛋白酶K)，充分混勻后放置56℃水浴鍋作用4小時；加入400uLTris平衡酚，充分混勻后10000r/min離心10分鐘，取上清液于另一1.5mL指形管；加入400μL酚：氯仿：異戊醇，充分混勻后10000r/min離心5分鐘，取上清液于另一1.5mL指形管；加入800μL無水乙醇，顛倒混勻后放入-20℃孵育30分鐘，12000r/min離心15分鐘，棄盡上清液；室溫自然干燥后向沉淀加入30μL滅菌超純水和2uLRNA酶，充分溶解后，即得病毒基因組，置-20℃?zhèn)溆?。?μL提取的病毒DNA作為模板,利用特異性引物進行PCR擴增。

(上游引物：5’-AATTTCGACCCCATGACGCGCCAGG-3’；

下游引物：5’-TGGCGAAAGGCGTACGGAAGTAAGC-3’)

PCR擴增反應體系為：模板1μL，5×Buffer10uL，10mM dNTP Mix 1μL，上游引物為10μmol 2uL，下游引物為10μmol 2uL，高保真酶1μL，加入滅菌超純水至50μL。PCR擴增反應循環(huán)參數(shù)為：95℃預變性4分鐘，隨后進行30個循環(huán)(95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘)，72℃延伸10分鐘。PCR結束后，PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠中進行電泳分析(如圖1所示)。切下PCR特異性產(chǎn)物片段送至南京金斯瑞公司進行序列分析。

2、血清4型禽腺病毒懸浮培養(yǎng)：利用激流式生物反應器擴增血清4型禽腺病毒。懸浮培養(yǎng)激流式生物反應器主要培養(yǎng)條件參數(shù)為反應器轉速為40r/min、200g載體初始細胞接種為1×10⁹個、細胞培養(yǎng)液為10％FBS血清的DMEM/F12培養(yǎng)液、病毒感染及維持液為含2％FBS血清的DMEM/F12培養(yǎng)基、最適PH為7.0-7.2、病毒接種量MOI為0.1以及病毒收獲時間為接種后96小時。簡要步驟如下：接種雞肝細胞后，每隔24h取樣測糖耗。當殘?zhí)橇康陀?.5g/L，定量補充葡萄糖或進行換液。當細胞生長6天后進行病毒的接種。通過激流袋將灌注袋及激流袋的細胞培養(yǎng)液全部排出，然后在激流袋中加入6L含200ml胎牛血清的DMEM/F12維持液，在灌注袋中接入4L不含血清的4型禽腺病毒(MOI為0.1TCID₅₀)DMEM/F12，吸附1h后，開始循環(huán)培養(yǎng)。在感染后不同時間段收集上清液，分別對三批懸浮培養(yǎng)的血清4型禽腺病毒的生長動力學進行了測定。將感染后96小時收集的上清液收集病毒、分裝，并測定病毒效果。結果顯示通過懸浮培養(yǎng)擴增的三批血清4型禽腺病毒效價分別達到10^8.16，10^8.25以及10^8.0TCID₅₀/ml。如表1所示：

表1血清4型禽腺病毒懸浮培養(yǎng)擴增效果