本申請要求2008年12月22日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/139,679和2009年3月30日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/164,486的權(quán)益，這兩個(gè)申請均通過引用全文并入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明一般涉及用于治療和/或預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎(OA)的方法。根據(jù)本發(fā)明，GM-CSF拮抗劑可有效治療骨關(guān)節(jié)炎。GM-CSF拮抗劑包括但不限于對GM-CSF或GM-CSF受體特異性的抗體。本發(fā)明還提供可用于在某些疾病模型中測試拮抗劑的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，諸如GM-CSF敲除小鼠。

發(fā)明背景

骨關(guān)節(jié)炎(OA)也稱為退行性關(guān)節(jié)炎，是在老年人和肥胖者中最普遍的疾病。OA是關(guān)節(jié)的疾病，但不同于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，這種疾病不是系統(tǒng)性的，通常只影響一個(gè)或數(shù)個(gè)關(guān)節(jié)。這種疾病導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的總的破壞，下方骨頭的硬化，和骨贅形成，造成運(yùn)動(dòng)能力喪失和疼痛。最終的結(jié)果往往是需要全關(guān)節(jié)置換。

OA在美國影響約～2100萬人，構(gòu)成所有初級(jí)保健就診的25％，并占所有NSAID(非甾體抗炎藥)處方的50％。目前沒有可用的減慢或停止疾病進(jìn)展的療法；現(xiàn)在的藥物僅僅治療癥狀。該疾病的發(fā)病率和嚴(yán)重程度隨著年齡增加。在65歲時(shí)，80％的美國人表現(xiàn)出OA的影像學(xué)證據(jù)，而只有60％將是有癥狀的。65歲時(shí)所有關(guān)節(jié)疾病的65％是OA。在2006年，美國有735,000次OA相關(guān)的住院。

現(xiàn)在的OA藥物治療OA的癥狀而不是疾病本身。治療OA的常用藥物包括非甾體抗炎藥物(NSAID)，諸如雙醋瑞因、扶他林、莫比可與奧斯克(通用名稱：雙氯芬酸鈉、米索前列醇、美洛昔康)。NSAID主要是通過在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中抑制前列腺素合成而起作用的口服化合物。其它常用藥物包括非麻醉鎮(zhèn)痛劑，諸如ultram(曲馬多)、COX-2抑制劑，諸如西樂葆和arcoxia(塞來考昔、艾托考昔)、麻醉鎮(zhèn)痛劑，諸如duragesic(右丙氧芬芬太尼)、透明質(zhì)酸，諸如suparts、海爾根、orthovisc和欣維可(Hylan G-F20)、和皮質(zhì)甾類，諸如潑尼松龍和甲基潑尼松龍(methyl predinisolone)。OA的現(xiàn)有治療傾向于排除經(jīng)由組織改造而手術(shù)諸如軟骨細(xì)胞移植的需要；然而，這些治療僅適用于晚期OA的治療。考慮的治療OA的其它方法包括增生療法(prolotherapy)，其中將刺激物諸如葡萄糖注射到患病關(guān)節(jié)中，從而造成急性炎癥反應(yīng)，但也強(qiáng)化和有希望地愈合組織、韌帶、肌腱和軟骨。因此，對于治療OA存在高度未滿足的醫(yī)療需求。

已知一些細(xì)胞因子牽涉在骨關(guān)節(jié)炎中(Blom等，Current Drug Targets(2008)8:283)。認(rèn)為幾種細(xì)胞因子諸如‘破壞性’細(xì)胞因子IL-1和合成代謝的生長因子轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)是可能的藥物靶。

粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)是一種功能為白細(xì)胞生長因子的細(xì)胞因子。GM-CSF刺激干細(xì)胞產(chǎn)生粒細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞、嗜曙紅粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)和單核細(xì)胞。單核細(xì)胞離開循環(huán)，遷移進(jìn)入組織，從而成熟為巨噬細(xì)胞。因此，其是天然免疫/炎性級(jí)聯(lián)的一部分，小數(shù)目巨噬細(xì)胞活化可以藉以快速導(dǎo)致其數(shù)目增加，這是對于斗爭感染決定性的過程。GM-CSF的活性形式在胞外以同二聚體存在。尤其是，GM-CSF已經(jīng)鑒定為自身免疫疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)中的炎性介質(zhì)，導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白酶的產(chǎn)生增加，并因此最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞。

WO 06/0234412公開了骨關(guān)節(jié)炎的多種生物標(biāo)志，其通過蛋白微陣列鑒定。鑒定的生物標(biāo)志之一是GM-CSF，報(bào)告其在OA組織中四倍上調(diào)。然而，沒有提供GM-CSF也可以是治療介入的點(diǎn)的指示或暗示，僅僅是在OA組織中四倍上調(diào)，如以WO 06/0234412中公開的技術(shù)鑒定的，WO 06/0234412也未暗示上述。在相關(guān)靜脈中，Devalaraja等(US20020141994A1)在適于以集落刺激因子的拮抗劑治療的可能適合的適應(yīng)癥的長列表中粗略提到OA。適應(yīng)癥的列表包括動(dòng)脈硬化、敗血癥、哮喘、自身免疫病、骨質(zhì)疏松癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。除了其它集落刺激因子諸如M-CSF和G-CSF以外，GM-CSF是Devalaraja等提及的集落刺激因子之一。事實(shí)上，Devalaraja等沒有包括為什么拮抗GM-CSF將適于治療患有OA的受治療者的數(shù)據(jù)或其它洞察。

發(fā)明概述

本發(fā)明首次證明，GM-CSF是用于治療OA的有效靶。這一發(fā)現(xiàn)是新的，現(xiàn)有技術(shù)沒有教導(dǎo)、暗示或提供治療OA的這樣一個(gè)介入點(diǎn)的任何理由。因此，本發(fā)明提供例如用于治療受治療者骨關(guān)節(jié)炎的方法，所述方法包括向所述受治療者施用有效量的GM-CSF拮抗劑的步驟。

在另一方面，本發(fā)明涵蓋用于預(yù)防受治療者骨關(guān)節(jié)炎的方法，所述方法包括向所述受治療者施用有效量的GM-CSF拮抗劑的步驟。

在另一方面，本發(fā)明涉及包含能夠拮抗GM-CSF活化、增殖、誘導(dǎo)患有骨關(guān)節(jié)炎或懷疑患有骨關(guān)節(jié)炎的受治療者中的細(xì)胞生長和/或存活的能力的GM-CSF拮抗劑的組合物，所述組合物還包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。

在另一方面，本發(fā)明涉及包含用于治療骨關(guān)節(jié)炎的GM-CSF拮抗劑的組合物，所述組合物還包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。

在本發(fā)明的具體方面，GM-CSF拮抗劑是對GM-CSF特異性的抗體。

在本發(fā)明的替代方面，GM-CSF拮抗劑是對GM-CSF受體特異性的抗體。

在其它方面，本發(fā)明涉及GM-CSF拮抗劑在制備用于治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。

在其它方面，本發(fā)明提供用于治療骨關(guān)節(jié)炎的GM-CSF拮抗劑。

在整個(gè)說明書中，除非上下文另外要求，否則詞語“包含(comprise)”、“具有(have)”和“包括(include)”和其相應(yīng)的變化形式諸如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”和“包括(including)”將理解為表示含有所指的元素或整數(shù)、或元素或整數(shù)的組，但不排除任何其它元素或整數(shù)、或元素或整數(shù)的組。

附圖簡述

圖1顯示通過組織學(xué)評(píng)分評(píng)價(jià)的不同區(qū)域的關(guān)節(jié)損傷的定量數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置和評(píng)分系統(tǒng)描述在實(shí)施例2?！癓at.”代表外側(cè)，“Med.”代表內(nèi)側(cè)。統(tǒng)計(jì)分析以Mann-Whitney進(jìn)行。數(shù)據(jù)對于股骨外側(cè)(p＝0.02)、脛骨外側(cè)(p＝0.003)、脛骨內(nèi)側(cè)(p＝0.001)、和所有區(qū)域(平均值；p＝0.002)是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。

圖2顯示健康對照膝蓋的示例組織學(xué)切片。放大倍數(shù)是100×。沒有觀察到軟骨損傷、骨贅形成、滑膜炎或變形。S＝滑膜內(nèi)層，C＝軟骨層。

圖3顯示膠原酶誘導(dǎo)OA模型中C57BL/6小鼠左膝

的示例組織學(xué)切片。各切片的放大倍數(shù)在圖中標(biāo)出。上面一行圖片顯示軟骨損傷、骨贅形成和滑膜炎是明顯的。O＝骨贅。S＝滑膜內(nèi)層。下面一行圖片顯示還存在關(guān)節(jié)變形。

圖4顯示膠原酶誘導(dǎo)OA模型中GM-CSF-/-小鼠左膝的示例組織學(xué)切片。各切片的放大倍數(shù)在圖中標(biāo)出。如所見的，異常和/或損傷與C57BL/6小鼠(參見圖3)相比嚴(yán)重度低得多，與健康對照小鼠(參見圖2)相當(dāng)。O＝骨贅。S＝滑膜內(nèi)層。

圖5顯示在OA小鼠模型中用GM-CSF抗體治療性治療的膝關(guān)節(jié)組織學(xué)評(píng)分。Lat.＝外側(cè)。Med.＝內(nèi)側(cè)。結(jié)果表示為平均值±SEM。如可見的，用抗-GM-CSF抗體治療的小鼠顯示較少的疾病。

圖6顯示以雙足平衡測痛儀(incapacitance meter)評(píng)價(jià)后肢重量分配的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖所示，從OA誘導(dǎo)后第27天開始，數(shù)據(jù)是顯著的(未配對t-檢驗(yàn))。

發(fā)明詳述

本發(fā)明證明，GM-CSF是用于治療OA的有效靶。在這方面，本發(fā)明一方面提供利用GM-CSF拮抗劑帶來在OA方面的預(yù)防或治療益處的方法。

本發(fā)明提供治療方法，包括向需要這樣的治療的受治療者施用治療有效量的GM-CSF拮抗劑。本文所用的“治療有效量”或“有效量”是指引發(fā)期望的生物響應(yīng)所必要的GM-CSF拮抗劑的量。根據(jù)本發(fā)明，治療有效量是治療和/或預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎所必要的GM-CSF拮抗劑的量。

本文所用的“GM-CSF拮抗劑”包括最廣泛含義的GM-CSF拮抗劑；包括抑制GM-CSF活性或功能、或通過任何其它方式對GM-CSF施加治療作用的任何分子。術(shù)語GM-CSF拮抗劑包括但不限于，特異性結(jié)合GM-CSF的抗體、對GM-CSF特異性的抑制性核酸、或?qū)M-CSF特異性的小有機(jī)分子。還包含在術(shù)語GM-CSF拮抗劑含義中的有特異性結(jié)合GM-CSF受體的抗體、對GM-CSF受體特異性的抑制性核酸、或?qū)M-CSF受體特異性的小有機(jī)分子。

抑制性核酸包括但不限于，反義DNA、三鏈體形成寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列、siRNA和microRNA。有用的抑制性核酸包括與對照相比，減少編碼GM-CSF的RNA表達(dá)至少20、30、40、50、60、70、80、90或95％的抑制性核酸。抑制性核酸和引入它們的方法是本領(lǐng)域公知的。siRNA設(shè)計(jì)軟件是可獲得的。

對GM-CSF或GM-CSF受體特異性的小有機(jī)分子(SMOL)可經(jīng)由天然產(chǎn)物篩選或篩選化學(xué)品庫來鑒定。通常SMOL的分子量低于500道爾頓，更通常從160到480道爾頓。SMOL的其它典型特征是以下一種或多種：

-分配系數(shù)log P在從-0.4到+5.6的范圍

-摩爾折射率從40到130

-原子數(shù)目從20到70

綜述參見Ghose等，J Combin Chem:1:55-68,1999和Lipinski等，Adv Drug Del Rev 23:3-25,1997。

優(yōu)選地，用于本發(fā)明的GM-CSF拮抗劑是對GM-CSF特異性或?qū)M-CSF受體特異性的抗體。這樣的抗體可以是任何類型，諸如鼠、大鼠、嵌合、人源化或人類抗體。因此，“人類”抗體或功能性人類抗體片段定義為不是嵌合(如，不是“人源化”)且不是來自(整個(gè)或部分地)非人類物種的。人類抗體或功能性抗體片段可衍生自人類或可以是合成的人類抗體?！昂铣傻娜祟惪贵w”在本文定義為具有整個(gè)或部分地，計(jì)算機(jī)模擬地衍生自基于對已知人類抗體序列分析的合成序列的序列的抗體。人類抗體序列或其片段的計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)可例如，通過分析人類抗體或抗體片段序列數(shù)據(jù)庫并利用從其獲得的數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)多肽序列來實(shí)現(xiàn)。人類抗體或功能性抗體片段的另一實(shí)例是由從人類來源抗體序列文庫(即，這種文庫是基于從人類天然來源獲取的抗體)分離的核酸編碼的抗體或功能性抗體片段。

“人源化抗體”或功能性人源化抗體片段在本文定義為：(i)衍生自非人類來源(如，帶有異源免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠)，該抗體是基于人類種系序列；或(ii)嵌合的，其中可變結(jié)構(gòu)域衍生自非人類來源，恒定結(jié)構(gòu)域衍生自人類來源；或(iii)CDR-嫁接的，其中可變結(jié)構(gòu)域的CDR來自非人類來源，而可變結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架為人類來源，恒定結(jié)構(gòu)域(如果存在)為人類來源。

術(shù)語“嵌合抗體”或功能性嵌合抗體片段在本文定義為具有衍生自或?qū)?yīng)于見于一種物種的序列的恒定抗體區(qū)和衍生自另一物種的可變抗體區(qū)的抗體分子。優(yōu)選地，恒定抗體區(qū)衍生自或?qū)?yīng)于見于人類如，見于人類種系或體細(xì)胞的序列，可變抗體區(qū)(如，VH、VL、CDR或FR區(qū))衍生自見于非人類動(dòng)物如，小鼠、大鼠、兔或倉鼠的序列。

本文所用的，如果抗體能夠區(qū)分抗原與一種或多種參考抗原，則認(rèn)為這樣的抗體“特異性結(jié)合”、“特異性結(jié)合”、“對...特異性”或“特異性識(shí)別”這樣的抗原(在本文是GM-CSF，或可選地GM-CSF受體)，因?yàn)榻Y(jié)合特異性不是絕對的，而是相對特征。參考抗原可以是用作參考點(diǎn)的一種或多種緊密相關(guān)的抗原，如，IL3、IL5、IL-4、IL13或M-CSF。以其最通用形式(且當(dāng)未提及具體參考時(shí))，“特異性結(jié)合”是指抗體區(qū)分目標(biāo)抗原與無關(guān)抗原的能力，如例如根據(jù)以下方法之一確定的。這種方法包括但不限于，蛋白質(zhì)印跡、ELISA-檢驗(yàn)、RIA-檢驗(yàn)、ECL-檢驗(yàn)、IRMA-檢驗(yàn)和肽掃描。例如，可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)ELISA測定。評(píng)分可通過標(biāo)準(zhǔn)顯色進(jìn)行(如，第二抗體以辣根過氧化物，四甲基聯(lián)苯胺以過氧化氫進(jìn)行顯色)。某些孔中的反應(yīng)通過光密度，例如在450nm的光密度評(píng)分。典型的背景(＝陰性反應(yīng))可以是0.1OD；典型的陽性反應(yīng)可以是1OD。這表示陽性/陰性的差異可以大于10倍。通常，結(jié)合特異性的確定不是通過利用單個(gè)參考抗原，而是利用一組約三種到五種無關(guān)抗原進(jìn)行，諸如奶粉、BSA、鐵傳遞蛋白或類似無關(guān)抗原。另外，“特異性結(jié)合”可能涉及抗體區(qū)分其靶抗原不同部分的能力，如，區(qū)分GM-CSF或GM-CSF受體的不同結(jié)構(gòu)域或區(qū)域、或區(qū)分GM-CSF或GM-CSF受體的一個(gè)或多個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基或氨基酸殘基段。

而且，因此，本文所用的“免疫球蛋白”(Ig)定義為屬于類IgG、IgM、IgE、IgA或IgD(或其任何亞類)的蛋白，包括所有常規(guī)已知的抗體和其功能性片段。因此，抗體/免疫球蛋白的“功能性片段”定義為抗體/免疫球蛋白保留抗原結(jié)合區(qū)的片段(如，IgG可變區(qū))?？贵w的“抗原結(jié)合區(qū)”通常見于抗體的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)，即，CDR-1、-2、和/或-3區(qū)；然而，可變“構(gòu)架”區(qū)也可在抗原結(jié)合中起重要作用，諸如通過提供CDR的骨架。優(yōu)選地，“抗原結(jié)合區(qū)”至少包含可變輕(VL)鏈的氨基酸殘基4至103和可變重(VH)鏈的5至109，更優(yōu)選地包含VL的氨基酸殘基3至107和VH的4至111，尤其優(yōu)選地是完整VL鏈和VH鏈(VL的氨基酸位置1至109和VH的1至113；按照WO 97/08320編號(hào))。用于本發(fā)明的優(yōu)選免疫球蛋白類是IgG。本發(fā)明的“功能性片段”包括F(ab')₂片段、Fab片段、scFv或包含單免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域或單結(jié)構(gòu)域抗體多肽的構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)域，如，單重鏈可變結(jié)構(gòu)域或單輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。可改造F(ab')₂或Fab以使在C_H1結(jié)構(gòu)域和C_L結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生的分子間二硫化物相互作用最小或完全去除。

本發(fā)明的抗體可衍生自基于計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)并由合成產(chǎn)生的核酸編碼的氨基酸序列的重組抗體文庫?？贵w序列的計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)例如，通過分析人類序列數(shù)據(jù)庫并利用從其獲得的數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)多肽序列來實(shí)現(xiàn)。用于設(shè)計(jì)和獲得計(jì)算機(jī)模擬產(chǎn)生的序列的方法描述于，例如，Knappik等，J.Mol.Biol.296:57,2000；Krebs等，J.Immunol.Methods.254:67,2001；Rothe等，J.Mol.Biol.376:1182,2008和授予Knappik等，2000同上的美國專利號(hào)6,300,064，其通過引用全文并入本文。

對GM-CSF特異性的任何抗體可用在本發(fā)明。示例抗體公開于US 11/914,599，其通過引用全文并入本文。其它示例抗體包括包含描述為SEQ ID NO:1的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列或描述為SEQ ID NO:2的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的抗體。又其它示例抗體包括衍生自包含描述為SEQ ID NO:1的重鏈可變區(qū)或描述為SEQ ID NO:2的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的抗體的抗體。又其它示例抗體包括與包含描述為SEQ ID NO:1的重鏈可變區(qū)或描述為SEQ ID NO:2的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的抗體具有相同特異性和/或結(jié)合相同表位的抗體。又其它示例抗體包括包含與描述為SEQ ID NO:1的序列至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源的重鏈可變區(qū)的抗體。又其它示例抗體包括包含與描述為SEQ ID NO:2的序列至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源的輕鏈可變區(qū)的抗體。

SEQ ID NO：1：

SEQ ID NO：2：

可用在本發(fā)明的替代示例抗體是包含描述為SEQ ID NO:3的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列或描述為SEQ ID NO:4的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的抗體。其它示例抗體包括衍生自包含描述為SEQ ID NO:3的重鏈可變區(qū)或描述為SEQ ID NO:4的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的抗體的抗體。又其它示例抗體包括與包含描述為SEQ ID NO:3的重鏈可變區(qū)或描述為SEQ ID NO:4的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的抗體具有相同特異性和/或結(jié)合相同表位的抗體。又其它示例抗體包括包含與描述為SEQ ID NO:3的序列至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源的重鏈可變區(qū)的抗體。又其它示例抗體包括包含與描述為SEQ ID NO：4的序列至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源的輕鏈可變區(qū)的抗體。

SEQ ID NO.3：重MOR

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMNWVRQAPGKGLEWVSGIENKYAGGATYYAASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGFGTDFWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO.4：輕MOR

DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGKKYAYWYQQKPGQAPVLVIYKKRPSGIPERFSGSNSCNTATLTISGTQAEDEADYYCSAWGDKGMVFGGGTKLTVLGQ

可用在本發(fā)明的替代示例抗體是包含選自以下的H-CDR3序列的抗體：

優(yōu)選地，包含選自SEQ ID NO.5-16任一種的H-CDR3序列的抗體另外包含以下H-CDR1序列：

Asp Tyr Leu Leu His

1 5

(SEQ ID NO：17)，

和/或以下H-CDR2序列：

Trp Leu Asn Pro Tyr Ser Gly ASp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

(SEQ ID NO：18)，

和/或以下L-CDR1序列：

Arg Ala Ser Gln Asn Ile Arg Asn Ile Leu Asn

1 5 10

(SEQ ID NO：19)，

和/或以下L-CDR2序列：

Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser

1 5

(SEQ ID NO：20)，

和/或以下L-CDR3序列：

Gln Gln Ser Tyr Ser Met Pro Arg Thr

1 5

(SEQ ID NO：21)

可用于本發(fā)明的替代示例抗體是包含以下的抗體：以下L-CDR1序列：

Arg Ala Ser His Arg Val Ser Ser Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

(SEQ ID NO：22)，

和/或以下L-CDR2序列：

Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5 (SEQ ID NO：23)，

和/或以下L-CDR3序列：

Gln Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Val Thr

1 5 (SEQ ID NO：24)，

和/或以下H-CDR1序列：

Gly Tyr Ile Phe Pro Thr Phe Ala Leu His

1 5 10

(SEQ ID NO：25)，

和/或以下H-CDR2序列：

Ser Ile Asn Thr Ala Ser Gly Lys Thr Lys Phe Ser Thr Lys phe Gln

1 5 10 15

(SEQ ID NO：26)，

和/或以下H-CDR3序列：

Asp Arg Phe Gln Asn Ile Met Ala Thr Ile Leu ASp Val

1 5 10

(SEQ ID NO：27)

優(yōu)選地所述抗體包含SEQ ID NO.22-27的所有CRD。

GM-CSF受體是促紅細(xì)胞生成素受體超家族的成員。它是異二聚的，由α亞基和β亞基構(gòu)成。α亞基是對GM-CSF高度特異性的，而β亞基是與其它細(xì)胞因子受體包括IL3和IL5共有的。這反映在β受體亞基的組織分布較廣泛。α亞基，GM-CSFRα主要在骨髓細(xì)胞和非造血細(xì)胞上表達(dá)，諸如嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜曙紅粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和呼吸道上皮細(xì)胞。全長GM-CSFRα是400個(gè)氨基酸的I型膜糖蛋白，屬于I型細(xì)胞因子受體家族，由22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽(位置1-22)、298個(gè)氨基酸的胞外結(jié)構(gòu)域(位置23-320)、位置321-345的跨膜結(jié)構(gòu)域和短的55個(gè)氨基酸的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。信號(hào)肽被裂解以提供GM-CSFRα的成熟形式，為378個(gè)氨基酸的蛋白。人類和鼠GM-CSFRα的cDNA克隆是可獲得的，并且在蛋白水平，受體亞基具有36％的同一性。GM-CSF能夠以相對低的親和力與僅α亞基結(jié)合(Kd 1-5nM)，但根本不結(jié)合僅β亞基。然而，α亞基和β亞基二者的存在導(dǎo)致高親和力配體-受體復(fù)合體(Kd>>100pM)。GM-CSF信號(hào)傳導(dǎo)如下發(fā)生：通過初始與GM-CSFRα鏈結(jié)合，然后與較大亞基即共有的β鏈交聯(lián)產(chǎn)生高親和力相互作用，這將JAK-STAT途徑磷酸化。

對GM-CSF受體特異性的任何抗體可用在本發(fā)明。示例抗體包括包含描述為SEQ ID No:28-46任一種的H-CDR3序列的氨基酸序列的抗體。其它示例抗體包括衍生自包含描述為SEQ ID No:28-46任一種的H-CDR3序列的氨基酸序列的抗體的抗體。又其它示例抗體包括與包含描述為SEQ ID No:28-46任一種的H-CDR3序列的氨基酸序列的抗體具有相同特異性和/或結(jié)合相同表位的抗體。又其它示例抗體包括包含與描述為SEQ ID No:28-46任一種的H-CDR3序列至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源的H-CDR3序列的抗體。

在某些方面，本發(fā)明提供用于治療受治療者骨關(guān)節(jié)炎的方法，所述方法包括向所述受治療者施用GM-CSF拮抗劑的步驟。在這一上下文中使用的“受治療者”是指任何哺乳動(dòng)物，包括嚙齒動(dòng)物諸如小鼠或大鼠、和靈長類諸如食蟹猴(Macaca fascicularis)、獼猴(Macaca mulatta)或人類(Homo sapiens)。優(yōu)選地受治療者是靈長類，最優(yōu)選地是人類。

在某一方面，本發(fā)明提供包含能夠拮抗GM-CSF活化、增殖、誘導(dǎo)患有骨關(guān)節(jié)炎或懷疑患有骨關(guān)節(jié)炎的受治療者中的細(xì)胞生長和/或存活的能力的GM-CSF拮抗劑的組合物，所述組合物還包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。本發(fā)明的抗-GM-CSF抗體可拮抗GM-CSF在骨關(guān)節(jié)炎中的任何作用。

在另一方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防受治療者骨關(guān)節(jié)炎的方法，所述方法包括向所述受治療者施用GM-CSF拮抗劑。在這一上下文中使用的“預(yù)防”是指目的是阻止疾病發(fā)作或延遲疾病發(fā)作的方法。

在某些方面，本發(fā)明提供包含可用于治療骨關(guān)節(jié)炎的GM-CSF拮抗劑的組合物，所述組合物還包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。

在其它方面，本發(fā)明提供GM-CSF拮抗劑在制備用于治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。

在其它方面，本發(fā)明提供用于治療骨關(guān)節(jié)炎的GM-CSF拮抗劑。

本發(fā)明的組合物優(yōu)選地是包含用于治療骨關(guān)節(jié)炎的GM-CSF拮抗劑和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。這樣的載體、稀釋劑和賦形劑是本領(lǐng)域公知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員將發(fā)現(xiàn)最適于用本發(fā)明的GM-CSF拮抗劑治療受治療者的制劑和施用途徑。

在另一方面，本發(fā)明提供具有GM-CSF-/-基因型的遺傳改造的哺乳動(dòng)物。在具體方面，所述哺乳動(dòng)物是小鼠。術(shù)語“敲除的”小鼠(或哺乳動(dòng)物)、某一基因“被破壞的”小鼠(或哺乳動(dòng)物)、和具有“-/-基因型”的小鼠(或哺乳動(dòng)物)在本發(fā)明中可互換使用并且是本領(lǐng)域公認(rèn)的。各自的動(dòng)物在染色體的兩個(gè)等位基因上具有各自的基因缺陷，所述基因在本文是GM-CSF。

實(shí)施例1：

GM-CSF-/-小鼠的產(chǎn)生

GM-CSF-/-小鼠的產(chǎn)生描述在Stanley等(1994).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5592。簡單地說，嵌合小鼠通過向C57BL/6(H-2b)宿主胚泡微注射帶有被破壞的GM-CSF基因的129/OLA-衍生ES細(xì)胞(H-2b)而產(chǎn)生。將突變GM-CSF等位基因的種系傳遞者(transmitter)與C57BL/6小鼠雜交11代，將獲得的GM-CSF+/-小鼠種間雜交獲得用于實(shí)驗(yàn)的GM-CSF-/-、GM-CSF+/-和GM-CSF+/+小鼠。GM-CSF基因型狀態(tài)通過PCR分析尾DNA來確定。對動(dòng)物隨意喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物食物和水，與同樣性別的同窩出生者圈養(yǎng)在內(nèi)墊鋸屑的籠中。將8至15周齡的兩種性別的小鼠交付實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例2：

驗(yàn)證GM-CSF作為骨關(guān)節(jié)炎的靶

在骨關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，比較GM-CSF-/-小鼠與C57BL/6小鼠(參見如，Mills等，J Immunol 164:6166-6173,2000)。

方法：小鼠(每組n＝10)在第-2天和第0天接受左膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射膠原酶(Blom等，Arthritis Rheum 56:147-157,2007)。在第42天殺死小鼠，收集膝關(guān)節(jié)，固定，脫鈣，包埋在石蠟中，用切片機(jī)切成7μm。然后對載玻片用番紅O/固綠、蘇木精和曙紅染色以證明關(guān)節(jié)病理學(xué)。研究的病理學(xué)包括：軟骨損傷、滑膜炎、骨贅形成和關(guān)節(jié)變形。

用于軟骨病理學(xué)的評(píng)分系統(tǒng)如下：

等級(jí)

0 正常

1 不規(guī)則、但完整

1.5 不規(guī)則、帶有粗糙表面

2 淺表纖毛化(Superficial fibrillation)

2.5 淺表纖毛化、軟骨層中細(xì)胞減少

3 垂直裂

3.5 分支(Branching)和/或水平裂、潮標(biāo)破裂(tidemark ruptures)

4 軟骨損失，未延伸到潮標(biāo)

4.5 軟骨損失，延伸到潮標(biāo)

5 軟骨損失超出潮標(biāo)，但未延伸到骨

5.5 軟骨損失延伸到骨

6 骨損失/重建/變形

階段

1 <10％面積受損

2 10-25％面積受損

3 25-50％面積受損

4 50-75％面積受損

等級(jí)乘以階段得到評(píng)分。

這一評(píng)分系統(tǒng)是基于在臨床和實(shí)驗(yàn)OA中評(píng)價(jià)OA組織病理學(xué)的公認(rèn)方法。參見Pritzker等，Osteoarthritis Cartilage 14:13-29,2006。等級(jí)定義為OA發(fā)展到軟骨中的深度。階段定義為牽涉軟骨的水平范圍，即，有多少軟骨受影響。等級(jí)乘以階段得到評(píng)分以提供總的評(píng)分，從而代表對OA嚴(yán)重程度和范圍的綜合評(píng)價(jià)。對每只小鼠的最多六個(gè)切片評(píng)分。

結(jié)果：檢查這些關(guān)節(jié)顯示，GM-CSF-/-小鼠比對照小鼠顯示較少的膝關(guān)節(jié)病理學(xué)，指示GM-CSF在正常骨關(guān)節(jié)炎病理學(xué)和進(jìn)展中的作用。在C57BL/6小鼠觀察到的病理學(xué)包括軟骨層嚴(yán)重?fù)p傷、骨贅形成、關(guān)節(jié)變形和滑膜炎。GM-CSF-/-小鼠顯示沒有骨贅形成或關(guān)節(jié)變形，較少的軟骨損傷和滑膜炎。

關(guān)于不同區(qū)域關(guān)節(jié)損傷的定量數(shù)據(jù)顯示在圖1。代表性組織學(xué)顯示在圖2(健康對照膝蓋)、圖3(C57BL/6左膝)和圖4(GM-CSF-/-左膝)。與C57BL/6小鼠相比，GM-CSF基因缺陷型小鼠發(fā)展較少的膠原酶誘導(dǎo)OA病理學(xué)。

總之，在骨關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，與C57BL/6小鼠相比，GM-CSF-/-小鼠顯示明顯減少的膝關(guān)節(jié)病理學(xué)，驗(yàn)證了GM-CSF為骨關(guān)節(jié)炎治療介入的藥物靶。

實(shí)施例3：

GM-CSF拮抗劑在OA治療中的治療效力

這一實(shí)驗(yàn)中，我們使用對GM-CSF特異性的單克隆抗體證實(shí)GM-CSF拮抗劑可有效治療骨關(guān)節(jié)炎。

膠原誘導(dǎo)的OA小鼠模型：

在第0天和第2天對C57BL/6小鼠右膝關(guān)節(jié)內(nèi)給予1個(gè)單位的VII型膠原酶以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)不穩(wěn)定(參見Blom等，(2004)Osteoarthritis Cartilage.12；627-35)。

抗-GM-CSF抗體治療：

將20只小鼠隨機(jī)分為2組(10只小鼠/組)。

組1(n＝10)：抗-GM-CSF抗體(22E9)

組2(n＝10)：IgG2a同種型對照抗體。

以250μg/小鼠/治療的抗-GM-CSF抗體(22E9)或IgG2a同種型對照抗體腹膜內(nèi)治療小鼠，每周三次，持續(xù)6周。治療在誘導(dǎo)OA之前4天開始(預(yù)防性)，即，在第-4天、第-2天、第0天(第一次膠原酶注射當(dāng)天)治療小鼠，然后每周3次，直到6周時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束)。在第2周、第4周和第6周，對小鼠放血。檢查血清的抗體含量和對22E9的免疫原性。純化對照抗體和抗-GM-CSF抗體二者以包含少于10個(gè)內(nèi)毒素單位/ml。

抗體22E9用作示例抗-GM-CSF抗體。22E9是IgG2a同種型，是大鼠抗-小鼠GM-CSF-特異性抗體。22E9購自AbD Serotec(Martinsried,Germany；目錄號(hào)1023501)。存在替代的供應(yīng)商，如，eBioscience(SanDiego.CA,USA,目錄號(hào)14-7331)。

組織學(xué)：

最后一次注射后6周，對小鼠膝關(guān)節(jié)進(jìn)行組織學(xué)研究。收集膝關(guān)節(jié)，固定，脫鈣，包埋在石蠟中，用切片機(jī)切成7μm。然后對載玻片用番紅O/固綠、蘇木精和曙紅染色以證明關(guān)節(jié)病理學(xué)。研究的病理學(xué)包括：軟骨損傷、滑膜炎、骨贅形成和關(guān)節(jié)變形。

與實(shí)施例2相同的評(píng)分系統(tǒng)用于軟骨病理學(xué)。等級(jí)乘以階段得到評(píng)分。

以下評(píng)分系統(tǒng)用于滑膜炎(滑膜層評(píng)分系統(tǒng))：

0 與正常關(guān)節(jié)比較無變化

1 滑膜內(nèi)層增厚，炎癥細(xì)胞有些流入

2 滑膜內(nèi)層增厚，炎癥細(xì)胞中級(jí)流入

3 滑膜內(nèi)層明顯增厚，觀察到炎癥細(xì)胞最大程度流入

疼痛測量：

用于OA模型的疼痛指示是利用雙足平衡測痛儀測量的重量的差異分配。這種儀器測量操作的后肢與對側(cè)未操作后肢之間重量分配的變化。在實(shí)驗(yàn)之前允許小鼠適應(yīng)設(shè)備三次。經(jīng)5秒的階段測量每個(gè)后肢上承受的重量。取每只小鼠每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的三次獨(dú)立測量值，然后取平均值。實(shí)驗(yàn)期間每周進(jìn)行2次測量。結(jié)果表示為膠原酶注射肢/對照肢×100。

結(jié)果：

對于組織學(xué)中分析的所有區(qū)域(除了股骨內(nèi)側(cè)以外)，即股骨外側(cè)、脛骨外側(cè)和脛骨內(nèi)側(cè)，在用抗-GM-CSF抗體治療的小鼠中有朝向疾病減少的明顯趨勢。結(jié)果描繪在圖5。

對重量分配的評(píng)價(jià)作為與關(guān)節(jié)炎相關(guān)疼痛的量度，顯示與對照mAb-治療組相比，抗-GM-CSF mAb-治療組從第27天開始重量從患關(guān)節(jié)炎的膝蓋明顯轉(zhuǎn)移。結(jié)果描繪在圖6。

與用對照抗體治療的小鼠相比，用GM-CSF拮抗劑治療的小鼠顯示較少的疾病。與用對照抗體治療的小鼠相比，用GM-CSF拮抗劑治療的小鼠還顯示在疾病后面階段顯著較少的疼痛。與接受GM-CSF-特異性抗體的小鼠相比，用同種型對照抗體治療的小鼠顯示顯著增加的骨關(guān)節(jié)炎體征。這證明GM-CSF拮抗劑有效地治療OA。

實(shí)施例4：

包含SEQ ID NO.1或2的GM-CSF特異性抗體的治療效力

重復(fù)實(shí)施例3，藉以使用包含描述為SEQ ID NO:1的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列或描述為SEQ ID NO:2的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的GM-CSF特異性抗體作為GM-CSF拮抗劑?？墒褂眯∈笠酝獾牧硪晃锓N，尤其是本實(shí)驗(yàn)中使用的抗體對其交叉反應(yīng)的物種。優(yōu)選地本實(shí)驗(yàn)中使用的動(dòng)物物種是大鼠。

與接受包含描述為SEQ ID NO:1的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列或描述為SEQ ID NO:2的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的GM-CSF特異性抗體的動(dòng)物相比，用同種型對照抗體治療的動(dòng)物顯示顯著增加的骨關(guān)節(jié)炎體征。這證明該抗體在OA治療中的效力。

實(shí)施例5：

包含SEQ ID NO.3或4的GM-CSF特異性抗體的治療效力

重復(fù)實(shí)施例3。使用包含描述為SEQ ID NO:3的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列或描述為SEQ ID NO:4的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的GM-CSF特異性抗體作為GM-CSF拮抗劑。可使用小鼠以外的另一物種，尤其是本實(shí)驗(yàn)中使用的抗體對其交叉反應(yīng)的物種。優(yōu)選地本實(shí)驗(yàn)中使用的動(dòng)物物種是大鼠。

與接受包含描述為SEQ ID NO:3的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列或描述為SEQ ID NO:4的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的GM-CSF特異性抗體的動(dòng)物相比，用同種型對照抗體治療的動(dòng)物如大鼠顯示顯著增加的骨關(guān)節(jié)炎體征。這證明該抗體在OA治療中的效力。

實(shí)施例6：

包含SEQ ID NO.5-20的GM-CSF特異性抗體的治療效力

重復(fù)實(shí)施例3。使用包含選自SEQ ID NO.5-16任一種的H-CDR3序列的GM-CSF特異性抗體作為GM-CSF拮抗劑。優(yōu)選地，所述抗體還包含SEQ ID NO:16的H-CDR1序列、和/或SEQ ID NO:17的H-CDR2序列、和/或SEQ ID NO:18的L-CDR1序列、和/或SEQ ID NO:19的L-CDR2序列)、和/或SEQ ID NO:20的L-CDR3序列?？墒褂眯∈笠酝獾牧硪晃锓N，尤其是本實(shí)驗(yàn)中使用的抗體對其交叉反應(yīng)的物種。優(yōu)選地本實(shí)驗(yàn)中使用的動(dòng)物物種是大鼠。

與接受本實(shí)施例的GM-CSF特異性抗體的動(dòng)物相比，用同種型對照抗體治療的動(dòng)物如大鼠顯示顯著增加的骨關(guān)節(jié)炎體征。這證明該抗體在OA治療中的效力。

實(shí)施例7：

包含SEQ ID NO.21-26的GM-CSF特異性抗體的治療效力

重復(fù)實(shí)施例3。使用包含SEQ ID NO:22的L-CDR1序列、和/或SEQ ID NO:23的L-CDR2序列、和/或SEQ ID NO:24的L-CDR3序列、和/或SEQ ID NO:25的H-CDR1序列、和/或SEQ ID NO:26的H-CDR2序列、和/或SEQ ID NO:27的H-CDR3序列的GM-CSF特異性抗體作為GM-CSF拮抗劑。優(yōu)選地所述抗體包含SEQ ID NO.22-27的所有CRD?？墒褂眯∈笠酝獾牧硪晃锓N，尤其是本實(shí)驗(yàn)中使用的抗體對其交叉反應(yīng)的物種。優(yōu)選地本實(shí)驗(yàn)中使用的動(dòng)物物種是大鼠。

與接受本實(shí)施例的GM-CSF特異性抗體的動(dòng)物相比，用同種型對照抗體治療的動(dòng)物如大鼠顯示顯著增加的骨關(guān)節(jié)炎體征。這證明該抗體在OA治療中的效力。

實(shí)施例8：

對GM-CSF受體特異性的抗體的治療效力

重復(fù)實(shí)施例3，區(qū)別是使用對GM-CSF受體特異性的單克隆抗體代替對GM-CSF特異性的單克隆抗體。

使用包含描述為SEQ ID No:27-45任一種的H-CDR3序列的氨基酸序列的GM-CSF受體特異性抗體作為GM-CSF拮抗劑?？墒褂眯∈笠酝獾牧硪晃锓N，尤其是本實(shí)驗(yàn)中使用的抗體對其交叉反應(yīng)的物種。優(yōu)選地本實(shí)驗(yàn)中使用的動(dòng)物物種是大鼠。

與接受本實(shí)施例的GM-CSF受體特異性抗體的動(dòng)物相比，用同種型對照抗體治療的動(dòng)物如大鼠顯示顯著增加的骨關(guān)節(jié)炎體征。這證明該抗體在OA治療中的效力。

實(shí)施例9：

臨床試驗(yàn)

臨床試驗(yàn)在患有膝蓋骨關(guān)節(jié)炎的成年患者中進(jìn)行。隨機(jī)化、雙盲、安慰劑-對照臨床試驗(yàn)的目的是確定本發(fā)明的GM-CSF拮抗劑與安慰劑對診斷為膝蓋骨關(guān)節(jié)炎(OA)的30名患者總樣本中總的疼痛緩解和生活質(zhì)量的比較差異。另一目的是確定本發(fā)明的GM-CSF拮抗劑的安全性和耐受性，這由不良事件、體檢和生命體征確定。

方法：

年齡為40歲和以上、臨床診斷為膝蓋骨關(guān)節(jié)炎、并證實(shí)在試驗(yàn)前的這個(gè)月膝蓋疼痛至少15天的30名患者(約15名成年男性和15名成年女性)參與本研究?；颊呓邮苤委熡行Я康腉M-CSF拮抗劑或安慰劑(如，每兩周一次，持續(xù)約六個(gè)月)。

研究中使用Western Ontario and McMaster Universities骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)(WOMAC；Bellamy等，J Rheumatol 15(12):1833-40,1988)和SF-36v2生活質(zhì)量工具量表(Quality of Life instrument scales)(Quality Metric Health Outcomes Solutions,Lincoln,RI)。WOMAC是一種疾病特異性、自我實(shí)施的健康狀態(tài)量度。它在患有臀部和/或膝蓋骨關(guān)節(jié)炎的患者探測疼痛區(qū)域臨床上重要的癥狀、僵硬和身體功能。此指數(shù)由24個(gè)問題組成(5-疼痛、2-僵硬和17-身體功能)，可在5分鐘內(nèi)完成。WOMAC是用于在多種介入(藥理學(xué)、營養(yǎng)、手術(shù)、物理治療等等)后檢測臨床上重要的健康狀態(tài)變化的有效、可靠和靈敏的工具。WOMAC問卷有效地評(píng)價(jià)對臀部或膝蓋骨關(guān)節(jié)炎的介入的作用。SF-36v2生活質(zhì)量工具是多目的、簡式健康調(diào)查，有36個(gè)問題。它產(chǎn)生8-等級(jí)的功能性健康概況和健康評(píng)分以及基于心理測定的生理健康和心理健康概要量度、和基于偏好的健康效用指數(shù)。它是一種通用的量度，不同于針對具體年齡、疾病或治療組的量度。因此，SF-36v2已經(jīng)證明對于調(diào)查一般人群和特定人群、比較疾病的相對負(fù)荷、和區(qū)分寬范圍的不同治療產(chǎn)生的健康益處有用。SF-36v2產(chǎn)生關(guān)于以下的健康方面和子集的信息：生理健康(包括身體功能、角色生理(role-physical)、身體疼痛和總體健康)和心理健康(包括活力、社會(huì)機(jī)能、角色心理狀況(role-emotional)和心理健康)。

結(jié)果：

身體疼痛的變化：與安慰劑相比，用本發(fā)明的GM-CSF拮抗劑治療的患者在SF-36v2身體疼痛上的改進(jìn)是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。評(píng)分越高越好，因?yàn)檫@表示患者服用產(chǎn)品后感覺到較少疼痛。接受本發(fā)明的GM-CSF拮抗劑的組與安慰劑組相比，身體疼痛評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的改進(jìn)。

角色生理評(píng)分的變化：在由于身體健康引起的角色限制(角色生理)方面，本發(fā)明的GM-CSF拮抗劑與安慰劑相比的優(yōu)越效果在第8周、第12周和第20周是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。評(píng)分越高越好，因?yàn)檫@表示患者注意到身體的進(jìn)步和日常生活活動(dòng)中遇到的限制減少。接受本發(fā)明的GM-CSF拮抗劑的組與安慰劑組相比，角色生理評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的改進(jìn)。

總WOMAC評(píng)分的變化：用本發(fā)明的GM-CSF拮抗劑治療的組的總WOMAC評(píng)分統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著地好于安慰劑組的總WOMAC評(píng)分(評(píng)分越低越好)。

WOMAC ADL的變化：用本發(fā)明的GM-CSF拮抗劑治療的組比安慰劑組日常生活活動(dòng)(測量為WOMAC ADL亞-評(píng)分)的改進(jìn)大。用本發(fā)明的GM-CSF拮抗劑治療的組與安慰劑組相比，WOMAC ADL評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的改進(jìn)(評(píng)分越低越好)。

總結(jié)：

臨床試驗(yàn)顯示本發(fā)明的GM-CSF拮抗劑改進(jìn)患有膝蓋骨關(guān)節(jié)炎的患者生活質(zhì)量的效力。考慮到?jīng)]有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的副作用，臨床試驗(yàn)的結(jié)果還顯示產(chǎn)品的安全性和耐受性。

本發(fā)明的GM-CSF拮抗劑的效力還可通過在本發(fā)明的GM-CSF拮抗劑對其交叉反應(yīng)的其它物種中研究來確立(如，對馬進(jìn)行以評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)活動(dòng))；通過對軟骨細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行測定，利用體外研究以確定本發(fā)明的GM-CSF拮抗劑抑制IL-1-誘導(dǎo)的聚集蛋白多糖降解的能力。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，除了具體描述的以外，易于對本文描述的本發(fā)明變化和修改。將理解的是，本發(fā)明包括所有這樣的變化和修改。本發(fā)明還單獨(dú)地或集合地包括在本說明書中提到或指出的所有步驟、特征、組合物和化合物，和任何兩種或多種所述步驟或特征的任意組合和所有組合。

參考文獻(xiàn)

Bellamy等，J Rheumatol 15(12):1833-40,1988

Blom等，Arthritis Rheum 56:147-157,2007

Ghose等，J Combin Chem:7:55-68,1999

Knappik等，J.Mol.Biol.296:57,2000

Krebs等，J.Immunol.Methods.254:67,2001

Lipinski等，Adv Drug Del Rev 23:3-25,1997

Mills等，J Immunol 764:6166-6173,2000

Pritzker等，Osteoarthritis Cartilage 74:13-29,2006

Rothe等，J.Mol.Biol.376:1182,2008