本發(fā)明涉及一種堆肥優(yōu)勢微生物限制因子的識(shí)別方法。
背景技術(shù)：
我國有機(jī)廢棄物產(chǎn)量每年大約有40多億噸，位居世界之首。目前，由于有機(jī)廢棄物處理效率較低，其產(chǎn)生的環(huán)境污染問題已經(jīng)嚴(yán)重制約了我國環(huán)境友好型、資源節(jié)約型社會(huì)建設(shè)進(jìn)程。好氧堆肥法是有機(jī)廢棄物資源化利用的主要方法之一，但目前在堆肥高效化、高質(zhì)化等技術(shù)方面仍存在諸多迫切解決的技術(shù)問題。
堆肥過程是有機(jī)物在微生物的作用下進(jìn)行分解及腐殖酸類物質(zhì)形成的過程。由于有機(jī)廢棄物中小分子物質(zhì)(糖、氨基酸、脂類等)更容易被微生物利用，通常堆肥初期由于資源相對(duì)豐富，微生物種群數(shù)量在堆肥的中前期即達(dá)到峰值。堆肥高溫后期由于物料中微生物可利用的碳源組成較為單一，主要為纖維素、木質(zhì)素類物質(zhì)，加之此時(shí)物料中其它營養(yǎng)物質(zhì)大幅減少，堆肥中微生物種群多樣性明顯降低，有機(jī)物質(zhì)分解速率趨于平緩。因此，高溫后期物料營養(yǎng)濃度是制約微生物多樣性的關(guān)鍵限制因子。綜合以往研究報(bào)道，生物強(qiáng)化提高堆肥效率方面的研究，主要通過外源微生物及相關(guān)的接種工藝加以實(shí)現(xiàn)。但由于外源微生物與土著微生物存在競爭，同時(shí)要適應(yīng)堆肥溫度變化急劇、物質(zhì)轉(zhuǎn)化頻繁等堆肥微環(huán)境因子，導(dǎo)致生物強(qiáng)化提升堆肥效率有限。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種不同于接種外源微生物的生物強(qiáng)化思路，本發(fā)明方法可識(shí)別出堆肥過程中土著優(yōu)勢微生物功能菌株的營養(yǎng)關(guān)鍵限制因子，從而結(jié)合堆肥過程營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)，可提高堆肥效率、分質(zhì)資源化。
堆肥優(yōu)勢微生物低營養(yǎng)限制因子的識(shí)別方法按以下步驟進(jìn)行：
一、采集有機(jī)廢棄物在堆肥不同時(shí)期的樣品，一部分堆肥樣品低溫保存；另一部分堆肥樣品進(jìn)行理化因子、營養(yǎng)物指標(biāo)和微生物種群結(jié)構(gòu)測定；
二、根據(jù)測定結(jié)果，選擇堆肥過程中具有明顯峰值或堆肥過程明顯降低的營養(yǎng)物作為關(guān)鍵營養(yǎng)物；
三、選出有機(jī)廢棄物堆肥過程中關(guān)鍵營養(yǎng)物含量處于最低階段的低溫保存堆肥樣品，然后添加關(guān)鍵營養(yǎng)物至堆肥過程中的峰值濃度，再按所選堆肥樣品取樣時(shí)溫度培養(yǎng)24～48小時(shí)，然后再次進(jìn)行微生物種群結(jié)構(gòu)測定；
四、將步驟三所選堆肥樣品在步驟一和步驟三測定的微生物種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，添加關(guān)鍵營養(yǎng)物后新出現(xiàn)或恢復(fù)的優(yōu)勢微生物種群為靶向微生物，該關(guān)鍵營養(yǎng)物即為靶向微生物所在有機(jī)廢棄物堆肥低營養(yǎng)限制因子。
本發(fā)明步驟二中優(yōu)選與堆肥優(yōu)勢微生物顯著相關(guān)營養(yǎng)作為關(guān)鍵營養(yǎng)物。
根據(jù)本發(fā)明識(shí)別方法能夠確定有機(jī)廢棄物堆肥過程(各個(gè)階段)中與微生物生長、繁殖密切相關(guān)的營養(yǎng)物，并從中找到對(duì)應(yīng)關(guān)系，確定低營養(yǎng)限制因子；進(jìn)而為有機(jī)廢棄物堆肥的后期研究和提高堆肥效率、分質(zhì)資源化奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明方法針對(duì)性強(qiáng)、準(zhǔn)確，對(duì)有機(jī)廢棄物堆肥具有指導(dǎo)性意義。同時(shí)本發(fā)明方法利用一次堆肥的樣品進(jìn)行培養(yǎng)，節(jié)省了再次重新堆肥進(jìn)行脅迫因子篩選的時(shí)間和成本。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。
具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式堆肥優(yōu)勢微生物低營養(yǎng)限制因子的識(shí)別方法按以下步驟進(jìn)行：
一、采集有機(jī)廢棄物在堆肥不同時(shí)期的樣品，一部分堆肥樣品低溫保存；另一部分堆肥樣品進(jìn)行理化因子、營養(yǎng)物指標(biāo)和微生物種群結(jié)構(gòu)測定；
二、根據(jù)測定結(jié)果，選擇堆肥過程中具有明顯峰值或堆肥過程明顯降低的營養(yǎng)物作為關(guān)鍵營養(yǎng)物；
三、選出有機(jī)廢棄物堆肥過程中關(guān)鍵營養(yǎng)物含量處于最低階段的低溫保存堆肥樣品，然后添加關(guān)鍵營養(yǎng)物至堆肥過程中的峰值濃度，再按所選堆肥樣品取樣時(shí)溫度培養(yǎng)24～48小時(shí)，然后再次進(jìn)行微生物種群結(jié)構(gòu)測定；
四、將步驟三所選堆肥樣品在步驟一和步驟三測定的微生物種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，添加關(guān)鍵營養(yǎng)物后新出現(xiàn)或恢復(fù)的優(yōu)勢微生物種群為靶向微生物，該關(guān)鍵營養(yǎng)物即為靶向微生物所在有機(jī)廢棄物堆肥低營養(yǎng)限制因子。
本實(shí)施方式所確定的關(guān)鍵營養(yǎng)物為堆肥過程中濃度曾發(fā)生明顯變化的物質(zhì)。
具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一的不同點(diǎn)是：步驟一中所述營養(yǎng)物指標(biāo)主要為全氮、氨氮、硝氮、有機(jī)氮、全磷、水溶性磷及Olsen-P。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。
具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一或二的不同點(diǎn)是：步驟一中所述微生物種群結(jié)構(gòu)測定主要是進(jìn)行PCR-DGGE、PCR-SSCP和/或高通量測序。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一或二相同。
具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至三之一的不同點(diǎn)是：步驟一中所述堆肥樣品低溫保存溫度為-20℃。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一至三之一相同。
具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至四之一的不同點(diǎn)是：步驟一中所述低溫保存堆肥樣品的重量≥60g。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一至四之一相同。
具體實(shí)施方式六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至五之一的不同點(diǎn)是：根據(jù)步驟一理化因子中含水量的測定結(jié)果計(jì)算步驟三關(guān)鍵營養(yǎng)物的添加量。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一至五之一相同。
步驟三關(guān)鍵營養(yǎng)物的添加量＝m樣品×(1-含水率)×(C最大值-C最小值)×M鹽/M元素
其中，m樣品為選取步驟一低溫保存堆肥樣品的質(zhì)量(g)
C最大值為關(guān)鍵營養(yǎng)物(元素)在堆肥過程中的峰值濃度
C最小值為關(guān)鍵營養(yǎng)物(元素)在堆肥過程中的最低值濃度
M鹽為添加關(guān)鍵營養(yǎng)物所選物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量
M元素為添加關(guān)鍵營養(yǎng)物在M鹽中相對(duì)分子質(zhì)量
以氨氮為關(guān)鍵營養(yǎng)物為例，M鹽為硫酸銨、相對(duì)分子質(zhì)量132.14，M元素為NH4分子在硫酸銨中的相對(duì)分子質(zhì)量36。