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      用于鑒定刀鱭和短頜鱭的引物和分子生物學(xué)方法與流程

      文檔序號(hào):12248966閱讀:452來(lái)源:國(guó)知局
      用于鑒定刀鱭和短頜鱭的引物和分子生物學(xué)方法與流程
      本發(fā)明涉及生物
      技術(shù)領(lǐng)域
      ,特別涉及一種用于鑒定刀鱭和短頜鱭的引物和分子生物學(xué)方法。
      背景技術(shù)
      :長(zhǎng)江刀鱭是長(zhǎng)江中一種重要的漁業(yè)資源,也是長(zhǎng)江特有的一種名貴水產(chǎn)品。而在長(zhǎng)江中,同時(shí)還分布另一種與之形態(tài)極為類似的物種短頜鱭。短頜鱭的口感和價(jià)值,與刀鱭相差較大。市面上常常利用短頜鱭個(gè)體來(lái)冒充刀鱭出售,而由于兩者主要區(qū)別的下頜部分,差距較小難以辨別,而且往往由于刺網(wǎng)的捕撈破損而更加難以甄別;另一方面,由于目前刀鱭尚未實(shí)現(xiàn)人工繁育,養(yǎng)殖需要依賴長(zhǎng)江中撈取的苗種,而刀鱭和短頜鱭的苗種常常出現(xiàn)在同一區(qū)域混雜生存而難以區(qū)分,常常要等養(yǎng)到較大個(gè)體才可以區(qū)分剔除,增加了養(yǎng)殖的成本?,F(xiàn)有技術(shù)中,通常采用線粒體DNA技術(shù)對(duì)刀鱭、鳳鱭和短頜鱭基因甄別,但是此方法主要存在以下缺陷:首選經(jīng)遺傳學(xué)調(diào)查顯示,刀鱭和鳳鱭差異較大,較易使用線粒體基因序列加以區(qū)別,而刀鱭和短頜鱭是姐妹種,分化時(shí)間短,線粒體差異不明顯,甚至還有一定的遺傳漸滲現(xiàn)象,因此,不適合使用線粒體基因組序列對(duì)這兩者進(jìn)行辨別。其次,線粒體是母系遺傳,其序列只能反應(yīng)其母系祖先的特征,而長(zhǎng)江中由于這兩者具有共分布區(qū)和遺傳漸滲現(xiàn)象,有可能使得鑒定產(chǎn)生錯(cuò)誤。同時(shí),一些水系的短頜鱭的遺傳背景與長(zhǎng)江刀鱭更加接近,因此僅適用線粒體基因序列分析,很難區(qū)別其物種歸屬。另一方面,線粒體序列測(cè)定如序列數(shù)據(jù)較少,信息量少,如序列數(shù)據(jù)較多,信息量大,費(fèi)用也較大。為了解決以上存在的問(wèn)題,人們一直在尋求一種理想的技術(shù)解決方案。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:有鑒于此,本發(fā)明的目的在于提供一種鑒別效率高、敏感度高、方便快捷且、費(fèi)用低廉的用于鑒定刀鱭和短頜鱭的引物和分子生物學(xué)方法,以解決上述問(wèn)題。為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種引物組合物,它包含擴(kuò)增引物組和延伸引物組;所述擴(kuò)增引物組的核酸序列如SEQIDNO:1-16所示,所述延伸引物組的核酸序列如SEQIDNO:17-24所示。本發(fā)明還提供一種所述的引物組合物的應(yīng)用,所述引物組合物用于鑒定刀鱭和短頜鱭。本發(fā)明還提供一種構(gòu)建包括待測(cè)刀鱭和短頜鱭的SNP位點(diǎn)區(qū)域核酸測(cè)序文庫(kù)的方法,包括以下步驟:利用擴(kuò)增引物組對(duì)包含SNP位點(diǎn)區(qū)域的待測(cè)刀鱭和短頜鱭核酸樣本進(jìn)行第一PCR擴(kuò)增,獲得第一擴(kuò)增產(chǎn)物,分別利用磷酸化酶和外切酶對(duì)所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化;利用延伸引物組對(duì)純化后的所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行延伸反應(yīng),獲得延伸產(chǎn)物,采用磷酸化酶對(duì)所述延伸產(chǎn)物進(jìn)行純化,純化后的所述延伸產(chǎn)物構(gòu)成所述待測(cè)刀鱭和短頜鱭SNP位點(diǎn)區(qū)域核酸測(cè)序文庫(kù);其中,所述擴(kuò)增引物組的核酸序列如SEQIDNO:1-16所示,所述延伸引物組的核酸序列如SEQIDNO:17-24所示。基于上述,制得所述包含SNP位點(diǎn)區(qū)域的待測(cè)刀鱭和短頜鱭核酸樣本步驟包括:首先取待鑒定樣品的肌肉或者活體尾鰭尖部組織;然后采用酚氯仿法、高鹽法或?qū)游鲋ㄌ崛〈郎y(cè)刀鱭和短頜鱭樣品的DNA?;谏鲜?,構(gòu)建包括待測(cè)刀鱭和短頜鱭的SNP位點(diǎn)區(qū)域核酸測(cè)序文庫(kù)的方法中,按照20微升反應(yīng)體系計(jì)算,所述第一PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:試劑體積(微升)PrimerMix4MgCl1.6dNTPMix0.4ExTaq酶10待測(cè)刀鱭和短頜鱭DNA2ddH2O補(bǔ)至20所述第一PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋夯谏鲜觯鰳?gòu)建包括待測(cè)刀鱭和短頜鱭的SNP位點(diǎn)區(qū)域核酸測(cè)序文庫(kù)的方法中,按照10微升反應(yīng)體系計(jì)算,所述延伸反應(yīng)的反應(yīng)體系為:試劑體積(微升)SNaPshotMultiplexKit5多重第一擴(kuò)增產(chǎn)物2延伸引物組1ddH2O補(bǔ)至10所述延伸反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)椋罕景l(fā)明還提供一種利用上述引物組合鑒定刀鱭和短頜鱭的分子生物學(xué)方法,包括以下步驟:首先取待測(cè)刀鱭和短頜鱭樣品的肌肉或者活體尾鰭尖部組織,然后采用酚氯仿法、高鹽法或?qū)游鲋ㄌ崛〈郎y(cè)刀鱭和短頜鱭樣品的DNA;然后利用擴(kuò)增引物組對(duì)包含SNP位點(diǎn)區(qū)域的待測(cè)刀鱭和短頜鱭核酸樣本進(jìn)行第一PCR擴(kuò)增,獲得第一擴(kuò)增產(chǎn)物;利用磷酸化酶和外切酶對(duì)所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化;利用延伸引物組對(duì)純化后的所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行延伸反應(yīng),獲得延伸產(chǎn)物;采用磷酸化酶對(duì)所述延伸產(chǎn)物進(jìn)行純化;最后對(duì)純化后的延伸產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,獲得測(cè)序結(jié)果;基于所述測(cè)序結(jié)果,確定所述待測(cè)刀鱭和短頜鱭SNP位點(diǎn)區(qū)域核酸序列;基于所述刀鱭和短頜鱭SNP位點(diǎn)區(qū)域核酸序列,利用Structure軟件,繪制群體遺傳差異的柱形圖和個(gè)體遺傳差異的柱形圖,利用該分析判斷所述待測(cè)刀鱭和短頜鱭物種種類;其中,所述擴(kuò)增引物組的核酸序列如SEQIDNO:1-16所示,所述延伸引物組的核酸序列如SEQIDNO:17-24所示?;谏鲜?,所述的利用上述引物組合鑒定刀鱭和短頜鱭的分子生物學(xué)方法中,分別采用ABI3730xl及GeneMapper4.0對(duì)來(lái)所述待測(cè)刀鱭和短頜鱭SNP位點(diǎn)區(qū)域核酸測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序和分析統(tǒng)計(jì)。本發(fā)明相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步,具體的說(shuō),僅選取8個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行樣品鑒定即可有效的區(qū)分刀鱭和短頜鱭物種,達(dá)到物種鑒定的良好效果。同時(shí)由于SNP分型是按照反應(yīng)孔計(jì)費(fèi),而每個(gè)孔同時(shí)容納的檢測(cè)位點(diǎn)的多少是根據(jù)位點(diǎn)的相互位置關(guān)系來(lái)確定的,本發(fā)明選取的8個(gè)位點(diǎn)能夠滿足在一個(gè)反應(yīng)孔完成SNP分型的技術(shù)要求,每個(gè)孔即可鑒定1個(gè)樣品,可以實(shí)現(xiàn)單次96-384個(gè)樣品的反應(yīng),鑒定效率高;并且本發(fā)明的鑒定結(jié)果的軟件可視化分析,方便快捷,結(jié)果直觀、易讀。同時(shí),利用本發(fā)明提供的分子生物學(xué)方法可降低鑒定刀鱭和短頜鱭的鑒定費(fèi)用。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例1從選自洞庭湖的39個(gè)樣品中任選的1個(gè)樣本測(cè)試的8個(gè)SNP位點(diǎn)在分型峰圖中的位置分布。圖2為實(shí)施例1中利用結(jié)構(gòu)分析軟件得到的選自洞庭湖中39個(gè)樣本個(gè)體遺傳組成柱狀圖。圖3為實(shí)施例2從選自潘陽(yáng)湖的39個(gè)樣品中任選的1個(gè)樣本測(cè)試的8個(gè)SNP位點(diǎn)在分型峰圖中的位置分布。圖4為實(shí)施例2中利用結(jié)構(gòu)分析軟件得到的選自潘陽(yáng)湖中39個(gè)樣本個(gè)體遺傳組成柱狀圖。圖5為實(shí)施例3中選自蕪湖9個(gè)樣本選中任選1個(gè)樣本測(cè)試的8個(gè)SNP位點(diǎn)在分型峰圖中的位置分布。圖6為實(shí)施例3中利用結(jié)構(gòu)分析軟件得到的9個(gè)選自蕪湖樣本個(gè)體遺傳組成柱狀圖。圖7為實(shí)施例4中選自太湖40個(gè)樣本選中任選1個(gè)樣本測(cè)試的8個(gè)SNP位點(diǎn)在分型峰圖中的位置分布。圖8為實(shí)施例4中利用結(jié)構(gòu)分析軟件得到的40個(gè)選自太湖樣本個(gè)體遺傳組成柱狀圖。圖9-圖10為實(shí)施例5中選自某養(yǎng)殖場(chǎng)20個(gè)樣本選中任選2個(gè)樣本測(cè)試的8個(gè)SNP位點(diǎn)在分型峰圖中的位置分布。圖11為實(shí)施例5中利用結(jié)構(gòu)分析軟件得到的選自某養(yǎng)殖場(chǎng)20個(gè)樣本個(gè)體遺傳組成柱狀圖。圖12-圖13為實(shí)施例6中選自靖江19個(gè)樣本選中任選2個(gè)樣本測(cè)試的8個(gè)SNP位點(diǎn)在分型峰圖中的位置分布。圖14為實(shí)施例3中利用結(jié)構(gòu)分析軟件得到的19個(gè)選自靖江樣本個(gè)體遺傳組成柱狀圖。具體實(shí)施方式下面通過(guò)具體實(shí)施方式,對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。本發(fā)明提供的鑒定刀鱭和短頜鱭的分子生物學(xué)方法,具體包括以下步驟:1、樣本DNA的提取(1)分別取新鮮或冰凍的不同種群的待測(cè)刀鱭和短頜鱭肌肉或者活體的尾鰭尖部組織0.1g,剪碎并置于玻璃勻漿器中,向其中加入1mL的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿至組織塊消失,然后將玻璃勻漿器中的液體置于1.5mL的離心管中,并向離心管加入蛋白酶,混均。在65oC恒溫水浴鍋中水浴30min,也可轉(zhuǎn)入37oC水浴12-24小時(shí),間歇振蕩離心管數(shù)次。然后將離心管置于臺(tái)式離心機(jī)以12000rpm/min離心5分鐘,取上清液置于第二離心管中。(2)向第二離心管中加入2倍上清液體積的異丙醇,倒轉(zhuǎn)混均后,將生成的絲狀物挑出并晾干,然后用200微升的TE試劑重新溶解所述絲狀物。(3)向溶解有絲狀物的TE試劑中加入等體積的酚-氯仿-異戊醇并振蕩混均,然后以12000rpm/min轉(zhuǎn)速離心5分鐘,取上清液置于第三離心管中。(4)向第三離心管中加入等體積的氯仿-異戊醇,并振蕩混均,然后以12000rpm/min轉(zhuǎn)速離心5分鐘,取上清液置于第四離心管中。(5)向第四離心管中加入一半體積的7.5mol/L的乙酸氨和2倍體積的無(wú)水乙醇,混勻后室溫沉淀2min,然后以12000rpm/min轉(zhuǎn)速離心10分鐘,棄上清后,向第四離心管中加入200微升的TE試劑重新溶解沉淀物,即得到刀鱭或短頜鱭的DNA提取液,然后將其置于4oC保存?zhèn)溆谩?、多重PCR擴(kuò)增及延伸反應(yīng)(1)引物設(shè)計(jì)基于篩選的刀鱭和短頜鱭8個(gè)SNP位點(diǎn)基因設(shè)計(jì)能與之配對(duì)的擴(kuò)增引物SEQIDNO:1-16和延伸引物SEQIDNO:17-24;(2)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)首先利用上述擴(kuò)增引物對(duì)DNA提取液進(jìn)行擴(kuò)增,獲得PCR產(chǎn)物;然后取15微升的PCR產(chǎn)物,并向其中加入5USAP酶和2UExonucleaseI酶,并將其置于37oC水浴條件下1小時(shí),然后在75oC滅活15分鐘,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化處理。具體地,按照20微升反應(yīng)體系計(jì)算,所述第一PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:試劑體積(微升)PrimerMix4MgCl1.6dNTPMix,0.4ExTaq10待測(cè)刀鱭和短頜鱭DNA2ddH2O補(bǔ)至20所述第一PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋海?)SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng)首先采用本發(fā)明設(shè)計(jì)的延伸引物組對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行多重單堿基延伸反應(yīng),獲得延伸產(chǎn)物;然后取10微升的延伸產(chǎn)物,并向其中加入1USAP酶,并將其置于37oC水浴條件下1小時(shí),然后在85oC滅活15分鐘,對(duì)延伸產(chǎn)物進(jìn)行純化處理。具體地,按照10微升反應(yīng)體系計(jì)算,所述延伸反應(yīng)的反應(yīng)體系為:試劑體積(微升)SNaPshotMultiplexKit(ABI)5多重第一擴(kuò)增產(chǎn)物2延伸引物組1ddH2O補(bǔ)至10所述延伸反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)椋?、延伸產(chǎn)物核酸測(cè)序及群體鑒別取1微升純化后的延伸產(chǎn)物置于測(cè)序容器中,然后向其中加入0.5微升的Liz120SIZESTANDARD試劑和8.5微升的Hi-Di試劑并進(jìn)行混勻,并置于95oC溫度下變性5分鐘,變性后采用ABI3730XL測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)ABI3730XL測(cè)序儀上收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper4.0軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。最后,設(shè)置分群參數(shù)K=2,利用Structure2.3.2軟件繪制群體遺傳差異的柱形圖和個(gè)體遺傳差異的柱形圖,利用群體遺傳差異的柱形圖和個(gè)體遺傳差異的柱形圖分析判斷樣本的物種歸屬。實(shí)施例1本實(shí)施例本根據(jù)發(fā)明提供的鑒定刀鱭和短頜鱭的分子生物學(xué)方法的具體步驟,對(duì)選自洞庭湖中39個(gè)樣本進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,具體鑒定結(jié)果如下:利用ABI3730XL測(cè)序平臺(tái),從選自洞庭湖中39個(gè)樣本中任選的1個(gè)樣本測(cè)試的8個(gè)SNP位點(diǎn)在分型峰圖中的位置分布如圖1所示。選自洞庭湖中39個(gè)樣本的遺傳組成柱狀圖如圖2所示,柱狀圖中,黑色組分占大多數(shù)的個(gè)體即為刀鱭,灰色組分占大多數(shù)的個(gè)體為短頜鱭。鑒定結(jié)果顯示,選自洞庭湖中39個(gè)樣本個(gè)體中全部為短頜鱭。實(shí)施例2本實(shí)施例根據(jù)本發(fā)明提供的鑒定刀鱭和短頜鱭的分子生物學(xué)方法,利用ABI3730XL測(cè)序平臺(tái),對(duì)選自潘陽(yáng)湖中39個(gè)樣本進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定具體操作步驟同實(shí)施例1中的測(cè)序和鑒定步驟。從選自潘陽(yáng)湖的39個(gè)樣品中任選的1個(gè)樣本測(cè)試的8個(gè)SNP位點(diǎn)在分型峰圖中的位置分布如圖3所示。選自潘陽(yáng)湖中39個(gè)樣本的遺傳組成柱狀圖如圖4所示,柱狀圖中,黑色組分占大多數(shù)的個(gè)體即為刀鱭,灰色組分占大多數(shù)的個(gè)體為短頜鱭。鑒定結(jié)果顯示,選自潘陽(yáng)湖中39個(gè)樣本個(gè)體中全部為短頜鱭。實(shí)施例3本實(shí)施例根據(jù)本發(fā)明提供的鑒定刀鱭和短頜鱭的分子生物學(xué)方法,利用ABI3730XL測(cè)序平臺(tái),對(duì)選自蕪湖樣的9個(gè)樣本進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定具體操作步驟同實(shí)施例1中的測(cè)序和鑒定步驟。選自蕪湖樣的9個(gè)樣本中任選1個(gè)樣本測(cè)試的8個(gè)SNP位點(diǎn)在分型峰圖中的位置分布如圖5所示。選自蕪湖樣的9個(gè)樣本的遺傳組成柱狀圖如圖6所示,柱狀圖中,淺白色組分占大多數(shù)的個(gè)體即為刀鱭,灰色組分占大多數(shù)的個(gè)體為短頜鱭。鑒定結(jié)果顯示,選自蕪湖樣的9個(gè)樣本個(gè)體中全部為刀鱭。實(shí)施例4本實(shí)施例根據(jù)本發(fā)明提供的鑒定刀鱭和短頜鱭的分子生物學(xué)方法,利用ABI3730XL測(cè)序平臺(tái),對(duì)選自太湖40個(gè)樣本進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定具體操作步驟同實(shí)施例1中的測(cè)序和鑒定步驟。選自太湖40個(gè)樣本中任選1個(gè)樣本測(cè)試的8個(gè)SNP位點(diǎn)在分型峰圖中的位置分布如圖7所示。選自太湖40個(gè)樣本的遺傳組成柱狀圖如圖8所示,柱狀圖中,淺白色組分占大多數(shù)的個(gè)體即為刀鱭,灰色組分占大多數(shù)的個(gè)體為短頜鱭。鑒定結(jié)果顯示,選自太湖40個(gè)樣本個(gè)體中全部為刀鱭。實(shí)施例5本實(shí)施例根據(jù)本發(fā)明提供的鑒定刀鱭和短頜鱭的分子生物學(xué)方法,利用ABI3730XL測(cè)序平臺(tái),對(duì)選自某養(yǎng)殖場(chǎng)20個(gè)樣本進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定具體操作步驟同實(shí)施例1中的測(cè)序和鑒定步驟。選自某養(yǎng)殖場(chǎng)20個(gè)樣本任選2個(gè)樣本測(cè)試的8個(gè)SNP位點(diǎn)在分型峰圖中的位置分布如圖9和圖10所示。選自某養(yǎng)殖場(chǎng)20個(gè)樣本的遺傳組成柱狀圖如圖11所示,柱狀圖中,淺白色組分占大多數(shù)的個(gè)體即為刀鱭,灰色組分占大多數(shù)的個(gè)體為短頜鱭。鑒定結(jié)果顯示,選自某養(yǎng)殖場(chǎng)20個(gè)樣本存在兩個(gè)物種的共分布區(qū),分析認(rèn)為養(yǎng)殖群體的種源由于是從長(zhǎng)江下游一帶撈苗,且撈苗活動(dòng)并非一次,因此兩個(gè)物種在群體里混雜程度較高。實(shí)施例6本實(shí)施例根據(jù)本發(fā)明提供的鑒定刀鱭和短頜鱭的分子生物學(xué)方法,利用ABI3730XL測(cè)序平臺(tái),對(duì)選自某養(yǎng)殖場(chǎng)20個(gè)樣本進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定具體操作步驟同實(shí)施例1中的測(cè)序和鑒定步驟。選自靖江19個(gè)樣本任選2個(gè)樣本測(cè)試的8個(gè)SNP位點(diǎn)在分型峰圖中的位置分布如圖12和圖13所示。選自靖江19個(gè)樣本的遺傳組成柱狀圖如圖14所示,柱狀圖中,淺白色組分占大多數(shù)的個(gè)體即為刀鱭,灰色組分占大多數(shù)的個(gè)體為短頜鱭。鑒定結(jié)果顯示,選自靖江19個(gè)樣本存在兩個(gè)物種的共分布區(qū),因此短頜鱭群體里混雜少量刀鱭。最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是:以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)其限制;盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明,所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:依然可以對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行修改或者對(duì)部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換;而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神,其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)方案范圍當(dāng)中。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 
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