本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，涉及一種半連續(xù)法生產(chǎn)不同分子量普魯蘭多糖的方法。
背景技術(shù)：
普魯蘭多糖具有良好的理化特性，因此具備應(yīng)用于食品，醫(yī)藥，化工，環(huán)保，包裝等眾多領(lǐng)域的潛力。由于不同領(lǐng)域所需普魯蘭多糖性質(zhì)不同，從而導(dǎo)致對(duì)普魯蘭多糖分子量需求的差異。普魯蘭多糖受到菌種及發(fā)酵條件等不同而導(dǎo)致聚合度的變化，從而影響了其分子量的差異。有報(bào)道稱通過(guò)使用不同的有機(jī)氮源可以將普魯蘭多糖重均分子量控制在2.8×105~6.0×105，分子量分散指數(shù)在2.0~2.4。另外，通過(guò)控制K2HPO4的添加量不同，從而獲得不同分子量的普魯蘭多糖。
本發(fā)明經(jīng)過(guò)改變固有發(fā)酵模式，采用不同時(shí)間點(diǎn)放出發(fā)酵液，并補(bǔ)充相同體積發(fā)酵培養(yǎng)基溶液，同時(shí)調(diào)節(jié)特定發(fā)酵pH，從而使各時(shí)間點(diǎn)所獲得得普魯蘭多糖分子量不同，以達(dá)到獲得不同分子量普魯蘭多糖的目的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種以半連續(xù)發(fā)酵，并調(diào)節(jié)不同pH生產(chǎn)不同分子量普魯蘭多糖方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：一種半連續(xù)法生產(chǎn)不同分子量普魯蘭多糖的方法，其特征在于，包括以下步驟：
（1）制備發(fā)酵種子液，將菌種活化6-8小時(shí)候后接到種子培養(yǎng)基中，28℃，180rpm培養(yǎng)28到32h，得到發(fā)酵種子液；
（2）發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1）得到的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，采用半連續(xù)式發(fā)酵， 在發(fā)酵過(guò)程中，放出發(fā)酵液，并補(bǔ)充相同體積的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，并調(diào)節(jié)pH，繼續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中放出發(fā)酵液，并補(bǔ)充相同體積的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，再調(diào)節(jié)pH，重復(fù)操作，調(diào)節(jié)發(fā)酵pH不同，獲得含有不同分子量普魯蘭多糖的發(fā)酵液；
（3）精制，將步驟（2）中得到的含有不同分子量普魯蘭多糖的發(fā)酵液進(jìn)行精制提取，獲得不同分子量的普魯蘭多糖。
進(jìn)一步，所述步驟（2）中發(fā)酵過(guò)程中pH的調(diào)節(jié)范圍為3.5-4.5。
進(jìn)一步，所述步驟（2）中發(fā)酵過(guò)程中放罐體積為發(fā)酵液總體積的40-60%。
進(jìn)一步，，所述步驟（2）中種子液的接種量為質(zhì)量百分比3~5％，采用5L發(fā)酵罐中裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基。
進(jìn)一步，所述步驟（2）發(fā)酵培養(yǎng)的條件為通風(fēng)量為1.25V/V，轉(zhuǎn)速為400r/min，發(fā)酵初始pH值為5.5，開(kāi)始發(fā)酵24h內(nèi)，溫度為32℃培養(yǎng)，發(fā)酵24h后溫度調(diào)至28℃發(fā)酵。
進(jìn)一步，所述步驟（2）中發(fā)酵進(jìn)行至48~60h，取出40％發(fā)酵液，而后補(bǔ)充同樣體積的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，并調(diào)節(jié)pH至4.5，繼續(xù)發(fā)酵48~56h后取出40％發(fā)酵液，再加入相同體積新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，并調(diào)節(jié)pH至4.0，發(fā)酵至殘?zhí)呛谋M為止。
進(jìn)一步，種子培養(yǎng)基的質(zhì)量配比如下：蔗糖100份，酵母浸粉3份，K2HPO4 2份，NaCl 2.5份，MgSO4 0.4份，(NH4)2SO4 1份，F(xiàn)eSO4 0.05份，pH為6.0。
進(jìn)一步，發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量配比如下：蔗糖150份，蛋白胨 5份，K2HPO4 7份，NaCl 2.5份，MgSO4 0.4份，F(xiàn)eSO4 0.05份，pH為6.0。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明采用半連續(xù)發(fā)酵，結(jié)合調(diào)節(jié)不同發(fā)酵pH以達(dá)到獲得不同分子量普魯蘭多糖的效果。相較于通過(guò)分批發(fā)酵，分批獲得不同分子量的普魯蘭多糖而言，半連續(xù)發(fā)酵所需發(fā)酵時(shí)間更短。獲得相同普魯蘭多糖分子量的重復(fù)率較高，并且采用該種模式，發(fā)酵更加穩(wěn)定。
具體實(shí)施方式
為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1
將出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans）CGMCC NO.7055菌株活化6~8h后，將其從PDA斜面培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接到裝液量為100mL的500mL種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基的質(zhì)量配比如下：蔗糖100份，酵母浸粉3份，K2HPO4 2份，NaCl 2.5份，MgSO4 0.4份，(NH4)2SO4 1份，F(xiàn)eSO4 0.05份，pH為6.0，將種子液在上述培養(yǎng)基中28℃，180rpm培養(yǎng)32h，得到發(fā)酵的種子液，再以3%的接種量接入裝液量為3L的5L發(fā)酵罐中，通風(fēng)量為1.25V/V，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，前24h培養(yǎng)溫度為32℃，24h后發(fā)酵溫度調(diào)節(jié)至28℃。
在發(fā)酵進(jìn)行48h放出40%發(fā)酵液，記作“第一批”，而后向其中補(bǔ)充相同放料體積的發(fā)酵培養(yǎng)基，并調(diào)節(jié)pH至4.5。繼續(xù)發(fā)酵50h再放出50%發(fā)酵液，該批發(fā)酵液記為“第二批”。其后繼續(xù)補(bǔ)充相同發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH至4.5，發(fā)酵64h后停止發(fā)酵，終產(chǎn)發(fā)酵液記為“第三批”。
將上述的三批發(fā)酵液經(jīng)提取精制后，得出第一批產(chǎn)量58.2g/L，重均分子量為6.73×105 Da。第二批發(fā)酵液產(chǎn)量為67.7g/L，重均分子量為3.94×105Da。第三批產(chǎn)量為90.3g/L，重均分子量為2.58×105Da。
實(shí)施例2
將出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans）CGMCC NO.7055菌株活化6~8h后，將其從PDA斜面培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接到裝液量為100mL的500mL培養(yǎng)基中，種子液28℃，180rpm培養(yǎng)32h，再以5%的接種量接入裝液量為3L的5L發(fā)酵罐中，通風(fēng)量為1.0V/V，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，前24h培養(yǎng)溫度為32℃，24h后發(fā)酵溫度調(diào)節(jié)至28℃。
在發(fā)酵進(jìn)行56h，放出45%發(fā)酵液，記作“第一批”，而后向其中補(bǔ)充相同放料體積的發(fā)酵培養(yǎng)基，并調(diào)節(jié)pH至4.0。繼續(xù)發(fā)酵56h再放出60%發(fā)酵液，該批發(fā)酵液記為“第二批”。其后繼續(xù)補(bǔ)充相同發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH至3.5，發(fā)酵64h后停止發(fā)酵，終產(chǎn)發(fā)酵液記為“第三批”。
經(jīng)提取精制后，得出第一批產(chǎn)量51.7g/L，重均分子量為6.52×105 Da。第二批發(fā)酵液產(chǎn)量為73.4g/L，重均分子量為3.61×105 Da。第三批產(chǎn)量為98.3g/L，重均分子量為2.45×105 Da。
實(shí)施例3
將出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans）CGMCC NO.7055菌株活化6~8h后，將其從PDA斜面培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接到裝液量為100mL的500mL培養(yǎng)基中，種子液28℃，180rpm培養(yǎng)28h，將其導(dǎo)入二級(jí)種子液中28℃，200rpm培養(yǎng)24h。以5%的接種量接入裝液量為18L的30L發(fā)酵罐中，通風(fēng)量為1.15V/V，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，前24h培養(yǎng)溫度為32℃，24h后發(fā)酵溫度調(diào)節(jié)至28℃。
在發(fā)酵進(jìn)行48h，放出45%發(fā)酵液，記作“第一批”，而后向其中補(bǔ)充相同放料體積的發(fā)酵培養(yǎng)基，并調(diào)節(jié)pH至3.5。繼續(xù)發(fā)酵60h再放出60%發(fā)酵液，該批發(fā)酵液記為“第二批”。其后繼續(xù)補(bǔ)充相同發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH至3.0，發(fā)酵64h后停止發(fā)酵，終產(chǎn)發(fā)酵液記為“第三批”。
經(jīng)提取精制后，得出第一批產(chǎn)量48.7g/L，重均分子量為5.72×105 Da。第二批發(fā)酵液產(chǎn)量為77.5g/L，重均分子量為3.78×105 Da。第三批產(chǎn)量為95.1g/L，重均分子量為2.09×105 Da。
以上各實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。