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      一種抗弧菌活性的異香豆素類化合物及其晶體的制作方法

      文檔序號:12241803閱讀:490來源:國知局

      本發(fā)明屬于海洋天然產(chǎn)物領(lǐng)域,具體涉及一種抗弧菌活性的異香豆素類化合物及其晶體。



      背景技術(shù):

      在過去的半個多世紀(jì)里,由于抗生素的廣泛使用,特別是不合理的臨床誤用,造成耐藥性致病菌種類的不斷增加,對人類生命健康帶來極大威脅。為了減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生,急需開發(fā)新的高敏抗菌藥物,以提高臨床用藥的有效性。

      海洋高鹽、高壓、低光照等條件使海洋微生物能夠產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特的次級代謝產(chǎn)物,其中許多化合物具有抗菌活性,為尋找潛在的抗菌藥物先導(dǎo)化合物提供了重要來源。

      近年來,隨著海洋天然藥物化學(xué)的發(fā)展,越來越多的抗菌活性化合物從海洋微生物中不斷分離獲得,為尋找新型抗菌劑提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。采用人工培養(yǎng)發(fā)酵的方法,從海洋微生物中獲得有重要抗菌活性的次級代謝產(chǎn)物,具有環(huán)境友好、可持續(xù)發(fā)展等特點(diǎn),能有效解決藥物開發(fā)過程中的藥源等關(guān)鍵性問題,因此具有獨(dú)特優(yōu)勢。



      技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

      本發(fā)明提供一種真菌Penicillium citrinum HL-5126分離自紅樹尖瓣海蓮,紅樹尖瓣海蓮是第一發(fā)明人于2012年采自中國海南東寨港紅樹林自然保護(hù)區(qū)(Natural Product Research,2016,30(7),821-825)。

      本發(fā)明提供一類由上述紅樹尖瓣海蓮內(nèi)生真菌Penicillium citrinum HL-5126產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物或其藥學(xué)上可接受的鹽,其特征在于所述次級代謝產(chǎn)物具有如下結(jié)構(gòu):

      本發(fā)明提供一種制備化合物1-7或其藥學(xué)上可接受的鹽的制備方法,其特征在于包括如下步驟:

      (1)先在菌種培養(yǎng)基中對真菌Penicillium citrinum HL-5126進(jìn)行菌種培養(yǎng);

      (2)再在發(fā)酵培養(yǎng)基中對步驟(1)中的真菌Penicillium citrinum HL-5126進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng);

      (3)將步驟(2)得到的發(fā)酵物中的發(fā)酵液和菌體分離,發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取3~5次,合并萃取液后減壓濃縮得到發(fā)酵液浸膏;

      (4)步驟(3)得到的發(fā)酵液浸膏經(jīng)過減壓硅膠柱層析,采用石油醚-乙酸乙酯按100:0至0∶100梯度洗脫,將其按照極性大小分成5個組分Fr.1~Fr.5;將Fr.3組分以石油醚-乙酸乙酯10∶2為洗脫劑經(jīng)正相硅膠柱層析后,再經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析,洗脫劑為CHCl3∶MeOH=1∶1,最后經(jīng)高效液相色譜HPLC制備,色譜柱為Agilent C18,9.4×250mm,7μm,流速為2mL/min,流動相為MeOH∶H2O=85∶15最終得到化合物1-7。

      其中所述洗脫劑或流動相的比例均為體積比;所述菌種培養(yǎng)基中含有葡萄糖0.1%–5.0%、酵母膏0.01%–2%、蛋白胨0.01%–2%、瓊脂0.1%–3.0%、粗海鹽0.05%–5%、適量的水,培養(yǎng)溫度為20–25℃,培養(yǎng)時間為5-10天;所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有葡萄糖0.1%–5.0%、酵母膏0.01%–2%、蛋白胨0.01%–2%、粗海鹽0.05%–5%,培養(yǎng)溫度為20–25℃,培養(yǎng)時間為25–30天;上述百分比均為重量百分比。

      本發(fā)明提供化合物1的晶體結(jié)構(gòu),其特征在于其X-射線單晶衍射數(shù)據(jù)為: 斜方晶系,空間群P212121,晶胞參數(shù)為α=90°,β=90°,γ=90°,Z=4,Dx=1.318mg/mm3,F(000)=640,μ(Cu Kα)=0.848mm-1,2681個可觀測點(diǎn)[I>2σ(I)],可觀測點(diǎn)精修最終偏離因子R=0.083,wR=0.0707,F(xiàn)lack常數(shù)為0.0(3)。

      本發(fā)明提供化合物1晶體的制備方法,其特征在于將化合物1溶于極性溶劑中,自然結(jié)晶得到,所述極性溶劑為甲醇、乙醇或乙酸乙酯。

      本發(fā)明提供一種抗菌劑,其特征在于以化合物1-7、其晶體或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性成分。

      本發(fā)明提供的上述抗菌劑,還包含其他抗菌藥物;也可以包含藥學(xué)上可接受的載體。

      本發(fā)明提供化合物1-7、其晶體或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗菌藥物方面的用途。所述抗菌藥物用于抑制表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌或弧菌。

      本發(fā)明所述晶體結(jié)構(gòu)以雙子超衍射儀(Xcalibur,Atlas,Gemini ultra diffractometer)采用Cu Kα射線在120.01(10)K下掃描收集衍射數(shù)據(jù)。

      本發(fā)明中術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指非毒性的無機(jī)或有機(jī)酸和/或堿的加成鹽,可參見“Salt selection for basic drugs”,Int.J.Pharm.(1986),33,201–217。

      附圖說明

      說明書附圖1為化合物1的XRD圖。

      具體實(shí)施方式

      為了便于對本發(fā)明的進(jìn)一步理解,下面提供的實(shí)施例對其做了更詳細(xì)的說明。但是這些實(shí)施例僅供更好的理解發(fā)明而并非用來限定本發(fā)明的范圍或?qū)嵤┰瓌t,本發(fā)明的實(shí)施方式不限于以下內(nèi)容。

      實(shí)施例1

      (1)紅樹尖瓣海蓮內(nèi)生真菌Penicillium citrinum HL-5126的菌種培養(yǎng)

      菌種培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有葡萄糖5.0%(重量百分比,下同)、酵母膏2%、蛋白胨2%、瓊脂3%、粗海鹽5.0%,其余為水;使用時制成試管斜面,真菌菌株在25℃下培養(yǎng)5天。

      (2)紅樹尖瓣海蓮內(nèi)生真菌Penicillium citrinum HL-5126的發(fā)酵

      發(fā)酵培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有葡萄糖5.0%(重量百分比,下同)、酵母膏2%、蛋白胨2%、氯化鈉5%,其余為水;真菌菌株于25℃培養(yǎng)30天。

      (3)化合物1-7的提取分離

      取20L步驟(2)得到的發(fā)酵液過濾,除去菌體,將濾液濃縮后,用等體積的乙酸乙酯萃取3次;萃取液濃縮后經(jīng)過減壓硅膠柱層析,采用石油醚-乙酸乙酯按100:0至0:100梯度洗脫,將其按照極性大小分成5個組分Fr.1~Fr.5;將Fr.3組分以石油醚-乙酸乙酯10∶2為洗脫劑經(jīng)正相硅膠柱層析后,再經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析,洗脫劑為CHCl3∶MeOH=1∶1,最后經(jīng)高效液相色譜HPLC制備,色譜柱為Agilent C18,9.4×250mm,7μm,流速為2mL/min,流動相為MeOH∶H2O=85∶15,最終得到化合物1(5.0mg)、化合物2(5.0mg)、化合物3(6.2mg)、化合物4(6.0mg)、化合物5(8.0mg)、化合物6(10.0mg)、化合物7(7.0mg)。

      經(jīng)結(jié)構(gòu)確證,化合物1-3為新化合物,化合物4-7表征數(shù)據(jù)與已知報道的數(shù)據(jù)一致,在本發(fā)明中不在贅述。

      化合物1-3的NMR數(shù)據(jù)(400MHz 1H NMR,100MHz 13C NMR)

      化合物1:無色晶體,[α]24D=–29.0(c=0.25,MeOH).mp 118.8–120.4℃;λmax(logε)220(3.02),246(2.50),312(1.62)nm;CD(c 2×10-4mol/L,MeOH)λmax(Δε),259(-23.0),280(-2.5),330(-13.6);IR(KBr)νmax 3518,1712,1602,1272,1250,1230,1112,1082,1064,798cm–1;HRESIMS m/z 281.1384[M+H]+(calcd for C15H21O5,281.1383).

      化合物2:無色晶體,[α]24D=–24.6(c=0.25,MeOH).mp 136.9–137.6℃.λmax(logε)220(3.02),246(2.50),312(1.62)nm;CD(0.52Mm,MeOH)λmax(Δε)239(+2.00),257(-8.60),290(-1.52),329(-3.10);IR(KBr)νmax 3518,1712,1602,1272,1250,1230,1112,1082,1064,798cm–1;HRESIMS m/z 579.2200[2M+Na]+(calcd for C30H36O10Na,579.2200).

      化合物3:無色晶體,[α]24D=–12.0(c=0.25,MeOH).λmax(logε)220(3.02),246(2.50),312(1.62)nm;CD(0.52Mm,MeOH)λmax(Δε)240(+9.60),260(-2.65),328(-0.16);IR(KBr)νmax 3518,1712,1602,1272,1250,1230,1112,1082,1064,798cm–1;HRESIMS m/z 273.0733[M+Na]+(calcd for C30H36O10Na,273.0740).

      實(shí)施例2

      將實(shí)施例1中菌種培養(yǎng)基中成分調(diào)整為葡萄糖0.1%、酵母膏0.01%、蛋白胨0.01%、瓊脂0.1%、粗海鹽0.05%、適量的水,培養(yǎng)溫度為20℃,培養(yǎng)時間為10天;所述發(fā)酵培養(yǎng)基中成分調(diào)整為含有葡萄糖0.1%、酵母膏0.01%、蛋白 胨0.01%、粗海鹽0.05%,培養(yǎng)溫度為25℃,培養(yǎng)時間為25天;上述百分比均為重量百分比。仍能以類似的收率得到化合物1-7。

      實(shí)施例3

      取2.0mg化合物1溶于2mL甲醇中,靜止自然結(jié)晶,4天后得到無色晶體,其晶體結(jié)構(gòu)以雙子超衍射儀(Xcalibur,Atlas,Gemini ultra diffractometer)采用Cu Kα射線在120.01(10)K下掃描收集衍射數(shù)據(jù)。

      化合物1晶體:斜方晶系,空間群P212121,晶胞參數(shù)為α=90°,β=90°,γ=90°,Z=4,Dx=1.318mg/mm3,F(000)=640,μ(Cu Kα)=0.848mm-1,2681個可觀測點(diǎn)[I>2σ(I)],可觀測點(diǎn)精修最終偏離因子R=0.083,wR=0.0707,F(xiàn)lack常數(shù)為0.0(3)。

      此外,將化合物1溶于乙醇或乙酸乙酯中,靜止3-7天均能得到上述晶體。

      實(shí)施例4本發(fā)明的化合物的抗菌活性的測定

      本發(fā)明的化合物按照文獻(xiàn)方法(Pierce C.G.;Uppuluri P.;Teistan A.R.;Wormley Jr.F.L.;Mowat E.;Ramage G.;Lopez-ribot J.L.Nat.Protoc.2008,3,1494-1500),測試對4株革蘭氏陽性菌:蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、弧菌(V.alginolyticus)的抗菌活性。如表1所示。

      表1本發(fā)明的化合物對細(xì)菌的抑制活性

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