本發(fā)明屬于昆蟲飼養(yǎng)技術(shù)以及昆蟲不育生物防治
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及昆蟲益生菌及含有該益生菌的昆蟲飼料添加劑。
背景技術(shù)：
：實(shí)蠅類昆蟲成蟲發(fā)育成熟后，將產(chǎn)卵器插入寄主果實(shí)的表皮下，在寄主果實(shí)內(nèi)部進(jìn)行產(chǎn)卵，幼蟲在果實(shí)內(nèi)孵化，后在果實(shí)內(nèi)潛食為害，造成蛀果，引起落果、爛果等，影響果實(shí)產(chǎn)量和質(zhì)量，嚴(yán)重時(shí)甚至完全失去食用價(jià)值，造成極其嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。利用昆蟲不育技術(shù)(sterileinsecttechnique，SIT)可以有效的控制區(qū)域內(nèi)害蟲的種群從而達(dá)到防治目的，SIT是通過大量飼養(yǎng)目標(biāo)害蟲并將其進(jìn)行輻射處理后，連續(xù)釋放不育雄蟲，與野生目標(biāo)害蟲交配后，產(chǎn)生不育后代，將目標(biāo)害蟲種群數(shù)量控制在經(jīng)濟(jì)閾值之下，甚至徹底根除目標(biāo)害蟲，是區(qū)域害蟲綜合管理(AW-IPM)的一個(gè)重要組成部分。實(shí)蠅科害蟲SIT的實(shí)施已成功治理了10余種實(shí)蠅，例如：20世90年代，日本沖繩和鹿兒島等地區(qū)應(yīng)用SIT成功根除了瓜實(shí)蠅；澳大利亞西部應(yīng)用SIT成功根除了昆士蘭實(shí)蠅等。然而，SIT技術(shù)也具有一定的不足之處，與野外昆蟲種群相比，人工飼養(yǎng)的不育雄蟲存在一些問題：與野外雄蟲種群相比，死亡率高，生活史長，交配能力低下，產(chǎn)卵量少，飛行能力弱等。上述問題嚴(yán)重影響了昆蟲飼養(yǎng)質(zhì)量和SIT技術(shù)實(shí)施效果。昆蟲腸道中棲息著大量的微生物，這些微生物對寄主的生長、發(fā)育、致病和環(huán)境適應(yīng)方面有著重要的影響。這些微生物既參與物質(zhì)代謝，為寄主提供營養(yǎng)物質(zhì)，腸道內(nèi)常駐菌群還可抵御外來微生物的入侵，提高昆蟲飼養(yǎng)的效率，也可修復(fù)不育輻照劑量造成的昆蟲適應(yīng)力損傷等問題。昆蟲益生菌可通過改善昆蟲腸道微生物群落結(jié)構(gòu)從而影響其的物質(zhì)代謝，生長發(fā)育，免疫能力以及行為。它能通過增強(qiáng)機(jī)體對腸道有害微生物的抑制或增強(qiáng)先天免疫功能預(yù)防疾病、修復(fù)不育輻射劑量造成的野外適應(yīng)力損傷，促進(jìn)昆蟲生長，提高飼料利用率。在實(shí)際生產(chǎn)生活中，人類以及畜禽養(yǎng)殖業(yè)相關(guān)的益生菌的研究和商業(yè)化產(chǎn)品已經(jīng)較成熟，而昆蟲飼養(yǎng)尤其不育雄蟲適生性技術(shù)相關(guān)的益生菌的研究資料比較匱乏，產(chǎn)品更是稀缺。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供兩種昆蟲益生菌，本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種昆蟲益生菌飼料添加劑。所提供的益生菌及以其制備的飼料添加劑可促進(jìn)實(shí)蠅類昆蟲生長發(fā)育，提高其繁殖能力，達(dá)到昆蟲種群迅速擴(kuò)大飼養(yǎng)的目的，同時(shí)能修復(fù)SIT技術(shù)輻照對成蟲的損傷，為昆蟲養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)和SIT技術(shù)的實(shí)施提供充足的高質(zhì)量蟲源。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明提供的昆蟲益生菌菌株，是從植食性昆蟲腸道共生菌中分離獲得并保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)BD177和柯氏檸檬酸桿菌(Citrobacterkoseri)BD195，所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌BD177的保藏號為CCTCCNO:M2015621，所述柯氏檸檬酸桿菌BD195的保藏號為CCTCCNO:M2015622。所述益生菌均對昆蟲具有增強(qiáng)昆蟲生理機(jī)能，提高昆蟲適應(yīng)力和繁殖力，修復(fù)輻照損傷的功能。本發(fā)明提供的昆蟲益生菌飼料添加劑，以100g計(jì)，含有以下成分：有效活菌數(shù)不少于1×108個(gè)的昆蟲益生菌、0.1～1.2％重量的復(fù)合維生素、0.1～1.2％重量的復(fù)合微量元素、1～3％重量的抗壞血酸、0.3～2％重量的氮源、0.3～1％重量的氯化鈉、10～80％重量的菌劑載體。所述菌劑載體為麥麩、稻殼、麥殼、酒糟、殼聚糖、鋸末、菌渣、草木灰、甘蔗渣、柑橘皮渣、秸稈中的一種或多種。本發(fā)明的有益效果是：(1)本發(fā)明所提供的兩種益生菌均可有效提高昆蟲對飼料的利用率，增強(qiáng)昆蟲生理機(jī)能、繁殖力，提高昆蟲適應(yīng)力。(2)本發(fā)明所提供的兩種益生菌對不育雄蟲的飛行能力、交配競爭力、存活率均有顯著提升，各項(xiàng)生理機(jī)能指標(biāo)基本能恢復(fù)到正常實(shí)蠅的水平。(3)本發(fā)明所提供的昆蟲益生菌飼料添加劑能提高昆蟲的蛹重、羽化率、產(chǎn)卵量，從而提高了昆蟲飼養(yǎng)效率和質(zhì)量。(4)本發(fā)明為昆蟲飼養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化以及提高昆蟲不育(SIT)技術(shù)實(shí)施質(zhì)量提供了科學(xué)可行的方法。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1菌株的獲得(1)昆蟲腸道微生物的分離：挑取柑橘大實(shí)蠅、柑橘小實(shí)蠅、金龜甲、天牛、白蟻、黃粉蟲、水虻等植食性昆蟲的成蟲或者幼蟲，對蟲體進(jìn)行表面消毒處理，以排除外來微生物的影響，解剖出完整腸道后放入裝有300ul～500ul無菌水的無菌勻漿器，研磨充分后小心稀釋，涂NA平板進(jìn)行可培養(yǎng)菌篩選。(2)昆蟲腸道微生物的鑒定：NA平板培養(yǎng)挑單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，28-37℃恒溫培養(yǎng)12-48h。利用微生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定菌株的種類，通過鑒定從植食性昆蟲的腸道內(nèi)獲得鞘脂桿菌、芬氏纖維微菌、產(chǎn)堿假單胞菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、柯氏檸檬酸桿菌等多種菌株，其中產(chǎn)酸克雷伯氏菌和柯氏檸檬酸桿菌能促進(jìn)實(shí)蠅的繁殖和生長，該兩種菌株均于2015年10月20日送交位于武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)進(jìn)行保藏，各菌種的命名與保藏編號如下：產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)BD177，CCTCCNO:M2015621?？率蠙幟仕釛U菌(Citrobacterkoseri)BD195，CCTCCNO:M2015622。所述菌株均屬于伽馬變形菌綱(Gammaproteobacteria)腸桿菌目(Enterobacteriales)腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，產(chǎn)酸克雷伯氏菌為克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，柯氏檸檬酸桿菌為檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)。產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)為G-桿菌，不運(yùn)動(dòng)，兼性厭氧，生長在肉汁培養(yǎng)基上產(chǎn)生圓形明亮的菌落，利用檸檬酸鹽和葡萄糖作為唯一碳源，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣?？率蠙幟仕釛U菌(Citrobacterkoseri)為G-菌，可以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)，兼性厭氧，生長在肉汁培養(yǎng)基上的菌落光滑、低凹、濕潤、半透明、表明有光澤、邊緣整齊，可利用檸檬酸鹽作為唯一碳源，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。實(shí)施例2昆蟲益生菌飼料添加劑的制備(1)將保藏的產(chǎn)酸克雷伯氏菌BD177和柯氏檸檬酸桿菌BD195按1∶1的體積比，以總共5％(v/v)的接入量接種于100mlLB液體培養(yǎng)基中，30℃、150r/min搖床培養(yǎng)，使用微量分光光度計(jì)測量菌液在600nm處的OD值為1。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨(氮源)1g、酵母粉(氮源)0.5g、NaCl1g、90mL去離子水，調(diào)節(jié)PH值至7.4，定容至100mL，121℃高溫滅菌15-20min。(2)取復(fù)合維生素0.3g、復(fù)合微量元素0.2g、抗壞血酸1.5g溶于上述菌液中，然后將其與麥麩18g充分混合制成益生菌飼料添加劑，加去離子水至100g。該飼料添加劑中益生菌的有效活菌數(shù)為108～109個(gè)。所述復(fù)合維生素由維生素A，維生素D2，維生素E，維生素B1，維生素B2，維生素B6，維生素B12，維生素C組成，所述復(fù)合微量元素由鐵，碘，銅，錳，鋅，鎂，鉀，磷酸氫鈣，L-賴氨酸鹽，煙酰胺，泛酸鈣組成。用于補(bǔ)充昆蟲的各種營養(yǎng)元素，各種維生素和微量元素的用量均按飼料添加劑的常規(guī)用量，可通過商業(yè)途徑購買獲得。實(shí)施例3昆蟲益生菌飼料添加劑對昆蟲生長、繁殖的促進(jìn)能力實(shí)施例中使用的實(shí)蠅幼蟲人工飼料飼養(yǎng)：酵母粉7.5g，蔗糖50g，麥麩107g，0.6g復(fù)合維生素片，抗壞血酸3g，加入無菌水300ml，處理組在此基礎(chǔ)上添加100g實(shí)施例2制備的昆蟲益生菌飼料添加劑，對照組添加益生菌載體(80ml無菌水+20g麥麩)混合攪拌均勻待用。將誘集到的實(shí)蠅卵加入飼料中，每組約300粒。飼養(yǎng)條件：28±2℃，濕度70±5％，光照周期12h：12h。飼養(yǎng)10天后將幼蟲轉(zhuǎn)移到經(jīng)過120℃高溫處理的沙土上，令其入沙化蛹。檢測處理組和對照組昆蟲的各項(xiàng)指標(biāo)蛹重，羽化率，產(chǎn)卵量。結(jié)果如下：表1.益生菌對橘小實(shí)蠅生長發(fā)育的影響指標(biāo)對照組實(shí)驗(yàn)組蛹重(g)0.4533±0.0088190.5133±0.01764羽化率(％)62.67±0.779671.10±1.172產(chǎn)卵量(粒)146.8±52.68350.8±57.49經(jīng)過Ttest統(tǒng)計(jì)分析，添加昆蟲益生菌飼料添加劑后蛹重、羽化率、產(chǎn)卵量均顯著增加。實(shí)施例4昆蟲益生菌飼料添加劑提高不育雄蟲交配競爭力以及適應(yīng)力幼蟲入沙化蛹，大約2000粒末齡蛹(羽化前2天)經(jīng)過不育劑量水平的γ射線輻照處理作為處理組，1000粒末齡蛹不經(jīng)受γ射線輻照作為對照組A。待成蟲羽化出土后，將雌雄蟲分開飼養(yǎng)。對照組A未輻照雄蟲提供蔗糖：酵母(3:1)，無菌水；處理組B輻照雄蟲提供蔗糖：酵母(3:1)，無菌水；處理組C輻照雄蟲提供蔗糖：酵母(3:1)，實(shí)施例2中的益生菌飼料添加劑。處理組C益生菌飼料添加劑飼喂5天后，將添加劑置換成無菌水進(jìn)行飼養(yǎng)。檢測對照組A，處理組B和處理組C昆蟲的各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)：成蟲飛行能力，交配競爭力以及存活率。結(jié)果如下：表2.實(shí)蠅各項(xiàng)指標(biāo)指標(biāo)對照組A處理組B處理組C7日齡飛行距離(km)1.635±0.25260.6413±0.18091.616±0.278514日齡飛行距離(km)1.813±0.34410.8433±0.23961.751±0.4917交配競爭力指數(shù)10.43±0.12300.92±0.238150％存活率時(shí)間(天)50.53045.5經(jīng)分析，輻照后實(shí)蠅成蟲添加益生菌飼料添加劑后飛行能力、交配競爭力、存活率均顯著提升，各項(xiàng)生理機(jī)能指標(biāo)基本能恢復(fù)到正常實(shí)蠅的水平。以上結(jié)果表明：本發(fā)明提供的昆蟲益生菌及其制備而成的飼料添加劑顯著增強(qiáng)了昆蟲生理機(jī)能，提高昆蟲適應(yīng)力和繁殖力，修復(fù)輻照損傷，從而提高了昆蟲飼養(yǎng)效率和質(zhì)量，改善不育雄蟲野外適應(yīng)力，為昆蟲飼養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化以及提高昆蟲不育(SIT)技術(shù)實(shí)施質(zhì)量提供了科學(xué)可行的方法。當(dāng)前第1頁1 2 3