本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種大豆根的維管束特異表達(dá)的GmPHT1.14啟動(dòng)子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

啟動(dòng)子是基因中重要的順式作用元件，一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游幾十個(gè)堿基處。啟動(dòng)子根據(jù)轉(zhuǎn)錄模式不同可分為三種：組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。組織或器官特異性啟動(dòng)子的活性是受特定的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)、物理信號(hào)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)的，即這類啟動(dòng)子的表達(dá)具有特定的時(shí)空性。在這類啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，基因的表達(dá)往往只限于某些特定的器官或組織部位或特定的發(fā)育時(shí)期。組織或器官特異性啟動(dòng)子不僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定器官或組織部位積累，提高區(qū)域表達(dá)量，同時(shí)也可以避免目標(biāo)基因在其他組織器官中表達(dá)造成的不利影響。

到目前為止，已有大量的組織或器官特異性啟動(dòng)子被分離出來，其中包括葉片特異啟動(dòng)子、花特異啟動(dòng)子和種子特異啟動(dòng)子及根特異啟動(dòng)子等。根是植物體吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要器官，根特異表達(dá)系統(tǒng)可用于研究植物的高滲脅迫耐受、植物修復(fù)和根際分泌等。Borisjuk等用根特異啟動(dòng)子mas2、GFP和煙草鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin)基因構(gòu)建融合表達(dá)載體。轉(zhuǎn)基因煙草水培研究結(jié)果表明：根細(xì)胞不僅能夠高效產(chǎn)生GFP，而且可將目的蛋白質(zhì)分泌到液體培養(yǎng)基中(Borisjuk et al.,1999)。此外，應(yīng)奇才等運(yùn)用松樹根特異性啟動(dòng)子PmPgRP10驅(qū)動(dòng)CMO/BADH雙價(jià)基因并轉(zhuǎn)入水稻。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株根和葉的CMO酶、BADH酶活性及其它生理生化指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明：CMO/BADH雙價(jià)基因可在根部特異性表達(dá)(應(yīng)奇才，2006)。

GmPHT1.14基因?qū)儆谥参锪邹D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的家族成員，在調(diào)控磷的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起著重要的作用。因此有必要研究和獲得調(diào)控大豆磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因GmPHT1.14的啟動(dòng)子序列，從而為深入研究植物磷轉(zhuǎn)運(yùn)過程提供有效手段和途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供調(diào)控大豆磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因GmPHT1.14的啟動(dòng)子序列，從而為在各種作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的根的維管束中特異表達(dá)目標(biāo)基因提供有效途徑。

為達(dá)到以上目的，本發(fā)明提供了一種大豆根的維管束特異表達(dá)的GmPHT1.14啟動(dòng)子，其具有：

1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

2)SEQ ID No.1所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸所獲得的具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列。

應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的大豆磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因GmPHT1.14的啟動(dòng)子(SEQ ID No.1)，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，得到所述啟動(dòng)子的突變序列。例如在非活性區(qū)段，在不改變啟動(dòng)子功能的情況下，進(jìn)行以下取代方式中的至少一種所獲得的核苷酸序列：將第637位的T取代為A,將第2233位的A取代為T,將第3096位的G取代為C。

本發(fā)明還提供了含有GmPHT1.14啟動(dòng)子的載體、宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或表達(dá)盒。

在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，只要適合GmPHT1.14啟動(dòng)子的表達(dá)即可，例如可以為市售的載體及質(zhì)粒。

本發(fā)明還提供了GmPHT1.14啟動(dòng)子或含有其的上述生物材料在調(diào)控下游基因在植物根的維管束中特異表達(dá)中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了GmPHT1.14啟動(dòng)子或含有其的上述生物材料在提高下游基因在植物根的維管束中表達(dá)量的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了GmPHT1.14啟動(dòng)子或含有其的上述生物材料在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了GmPHT1.14啟動(dòng)子或含有其的上述生物材料在植物根發(fā)育調(diào)節(jié)中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了GmPHT1.14啟動(dòng)子或含有其的上述生物材料在植物種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了GmPHT1.14啟動(dòng)子或含有其的上述生物材料在植物育種中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，上述植物為作物、林木、蔬菜、花卉、牧草。

更優(yōu)選地，上述植物為作物。最優(yōu)選為大豆。

本發(fā)明還提供了從大豆基因組中克隆得到4987bp的GmPHT1.14啟動(dòng)子序列所用的特異性引物，其包括正向引物：5’-attgGAGCTCAGTGAAAGTAACATGGACCTAT-3’和反向引物：5’-gagtCTGCAGTAATTACTACTAAAATTGTTGGC-3’

含有上述特異性引物的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述特異性引物也可用于檢測(cè)本發(fā)明所述的大豆磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因GmPHT1.14的啟動(dòng)子。

本發(fā)明首次分離了大豆根的維管束中特異表達(dá)的GmPHT1.14啟動(dòng)子，利用GmPHT1.14啟動(dòng)子表達(dá)GUS基因，結(jié)果表明GmPHT1.14啟動(dòng)子可明顯促進(jìn)植物根的維管束中GUS基因的表達(dá)量，因而，GmPHT1.14啟動(dòng)子在植物根的維管束具有特異性，適合在各種作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的根的維管束中特異表達(dá)目標(biāo)基因并能夠提高目標(biāo)基因的表達(dá)量。

附圖說明

圖1為GmPHT1.14-GUS僅在大豆根的維管束中表達(dá)。A圖為根瘤誘導(dǎo)前的染色結(jié)果。B圖為根瘤誘導(dǎo)后的染色結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1大豆GmPHT1.14啟動(dòng)子的克隆

利用正向引物5’-attgGAGCTCAGTGAAAGTAACATGGACCTAT-3’和反向引物：5’-gagtCTGCAGTAATTACTACTAAAATTGTTGGC-3’從大豆基因組中PCR擴(kuò)增并測(cè)序獲得長(zhǎng)度為4987bp的GmPHT1.14啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。PCR產(chǎn)物兩端分別帶有Sac I和Pst I的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。

上述PCR擴(kuò)增體系為：(20μl體系)

PCR程序：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃3min，共25個(gè)循環(huán)；72℃10min。

實(shí)施例2大豆GmPHT1.14啟動(dòng)子調(diào)控下游基因GUS的表達(dá)情況

根據(jù)實(shí)施例1中PCR克隆得到GmPHT1.14啟動(dòng)子，切膠回收產(chǎn)物用Sac I和Pst I雙酶切。將載體pCAMBIA3301(pCAMBIA3301購(gòu)自澳大利亞Cambia公司)先用HindⅢ和Nco I雙酶切掉35S啟動(dòng)子后用Klenow補(bǔ)齊成平末端，Solution I自連后轉(zhuǎn)化至DH5α中擴(kuò)繁。提質(zhì)粒后再用SacI和Pst I雙酶切，回收后與GmPHT1.14啟動(dòng)子的回收片段用Solution I連接。獲得雙元表達(dá)載體pGmPHT1.14::GUS，將植物表達(dá)載體pGmPHT1.14::GUS轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中擴(kuò)繁。

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，包括：(1)制備含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基；(2)取出貯存于-80℃的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴中融化后，加入5μl連接產(chǎn)物輕輕混勻，冰浴中放置30分鐘；(3)42℃熱激30秒，然后立即置于冰浴中3分鐘；加入300μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)1小時(shí)(160rpm)；(4)取適量培養(yǎng)液均勻涂于選擇性培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)16小時(shí)，用滅菌牙簽挑取5-10個(gè)(或更多)菌落，置于200μl選擇性液體LB培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)；(5)PCR檢測(cè)篩選到的陽性克隆擴(kuò)繁提質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法，將pGmPHT1.14::GUS轉(zhuǎn)入大豆天隆一號(hào)，獲得轉(zhuǎn)化pGmPHT1.14::GUS的發(fā)根50條。

GUS活性分析表明，GmPHT1.14啟動(dòng)子在植物的根的維管束中特異表達(dá)，見圖1，由圖1的根瘤誘導(dǎo)前的表達(dá)和誘導(dǎo)后的表達(dá)對(duì)比來看，GmPHT1.14啟動(dòng)子能夠在植物根的維管束中特異表達(dá)，可見該啟動(dòng)子可用于包括各種作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等在內(nèi)的各種植物根的維管束中特異表達(dá)目標(biāo)基因。

發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)化方法：

(1)將大豆用氯氣熏蒸法滅菌12個(gè)小時(shí)后，取出置于超凈臺(tái)吹凈剩余氯氣后，用滅菌的超純水浸泡16小時(shí)備用；

(2)將帶有pGmPHT1.14::GUS的農(nóng)桿菌K599挑單克隆活化后，試管小搖后用YEP大搖至菌液OD在0.8-1.0之間，4000轉(zhuǎn)，22℃離心10min后，重懸于LCCM(1/10X Gamborg B₅鹽,30g/L蔗糖,3.9g/L MES,pH 5.4.滅菌后加入40mg/L乙酰丁香酮)中；

(3)將浸泡好的大豆的胚根切下，以下胚軸為外植體，將外植體浸于重懸菌液中30min完成侵染，在濾紙上吸干浸染液，將侵染后的大豆外植體置于CCM(1/10X Gamborg B₅鹽,30g/L蔗糖,3.9g/L MES,4.25g/L瓊脂,pH 5.4.滅菌后加入Cysteine 400mg/L,and 40mg/L乙酰丁香酮)上避光培養(yǎng)3天；

(4)將共培養(yǎng)后的大豆外植體的下胚軸插入發(fā)根誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1X Gamborg B₅鹽,30g/L蔗糖,and 0.59g/L MES,7g/L瓊脂，pH5.7.滅菌后加入Cefotaxime 100mg/L)中，長(zhǎng)日光照下培養(yǎng)10-14天誘導(dǎo)發(fā)根，發(fā)根生長(zhǎng)至2cm時(shí)，取材。

(5)將誘導(dǎo)成熟的發(fā)根(根長(zhǎng)≥3cm)取出洗凈培養(yǎng)基，置于根瘤菌HH103懸浮液中浸染30min，完成根瘤菌接種，將接種后的發(fā)根復(fù)合植株置于澆灌BD營(yíng)養(yǎng)液的蛭石中，長(zhǎng)日光照培養(yǎng)12-14天后可見幼嫩根瘤，取材。

轉(zhuǎn)化株的GUS染色：

(1)將組織樣品加入90％丙酮中，置于冰上20～30分鐘；

(2)經(jīng)丙酮處理后，用50mM磷酸緩沖液(pH7.2)、2mM K₄Fe[CN]₆及2mM K₃Fe[CN]₆溶液潤(rùn)洗組織；

(3)將樣品放在X－Gluc染色液中(50mM磷酸緩沖液(pH7.2),1mM X-gluc,2mM K₄Fe[CN]₆,2mM K₃Fe[CN]₆)，抽氣10分鐘，然后37℃染色過夜；

(4)第二天用70％乙醇脫色；

(5)在載玻片上加幾滴HCG溶液，將脫色后的樣品置于其中；

(6)壓片，透明15分鐘或者過夜透明(根據(jù)組織的發(fā)育時(shí)期而定)。

GUS染色液配方：

20mM X-gluc(MW＝521.8)

用DMSO或N,N-二甲基甲酰胺溶解，100mg X-gluc需用9.58ml DMSO溶解,終濃度為20mM。

50mM磷酸緩沖液(pH7.0)

A液：NaH₂PO₄·2H₂O 3.12g溶于無菌蒸餾水，定容至100ml；

B液：Na₂HPO₄·12H₂O 7.17g溶于無菌蒸餾水，定容至100ml；

取39mlA液與61mlB液混合。

染色液配制：5mM鐵氰化鉀；5mM亞鐵氰化鉀；10mM EDTA；50mM磷酸緩沖液；1mM X-gluc。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之做一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。