一種利用煙草高效表達(dá)IL?37各亞型成熟蛋白的方法與流程

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導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域，具體涉及一種利用煙草高效表達(dá)IL-37各亞型成熟蛋白的方法。

背景技術(shù)：

人白介素-37(IL-37) 是細(xì)胞因子IL-1族中新添加的一成員，于2000年發(fā)現(xiàn)。與IL-1族中的其它成員相反，IL-37屬于抗炎癥細(xì)胞因子具有廣泛的抗炎功效，在限制固有炎癥反應(yīng)(innate inflammation）和抑制獲得性免疫（acquired immunity）反應(yīng)兩個(gè)方面都起著關(guān)鍵的作用。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，抑制人細(xì)胞內(nèi)IL-37的正常表達(dá)會(huì)增加由IL-1，Toll樣受體（Toll-link receptor，TRL）和尿酸結(jié)晶誘發(fā)的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放，包括TNF-α，IL-1α，IL-1?，IL-6 和G-CSF 。盡管到目前為止在小鼠身上還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與人相對(duì)應(yīng)的 IL-37 基因，但人IL-37 在小鼠體內(nèi)具有活性。用構(gòu)建的表達(dá)IL-37轉(zhuǎn)基因小鼠(IL37-tg）研究其對(duì)不同炎癥疾病的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-37-tg 小鼠展現(xiàn)出對(duì)多種炎癥相關(guān)疾病的抵抗力，如內(nèi)毒素血癥，結(jié)腸炎，脊髓損傷，代謝綜合癥，心肌缺血等。此外，注射重組IL-37蛋白質(zhì)到非IL-37轉(zhuǎn)基因的正常小鼠，可同樣地保護(hù)由內(nèi)毒素血癥，代謝綜合癥如肥胖引起的II 型糖尿病，急性肺部損傷，脊髓損傷，心肌梗死，哮喘和肝臟缺血等疾病對(duì)動(dòng)物所造成的損傷。還有，很多人類炎癥疾病的嚴(yán)重程度和IL-37 在體內(nèi)的表達(dá)量相關(guān)聯(lián)。例如，炎癥性腸疾病患者的結(jié)腸組織中有IL-37 表達(dá)，但健康個(gè)體的相應(yīng)組織中不存在。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)IL-37水平升高，某些患者的IL-37基因編碼區(qū)出現(xiàn)突變，他們的下肢關(guān)節(jié)疾病得分相對(duì)無(wú)突變的患者要低，暗示這種突變?cè)鰪?qiáng)了IL-37抗炎癥反應(yīng)的功能。檢測(cè)感染HIV-1患者的外周血液發(fā)現(xiàn)，其IL-37的穩(wěn)臺(tái)態(tài)（steady state）mRNA濃度相對(duì)未感染者要高4倍。這些結(jié)果提示炎癥會(huì)增加機(jī)體內(nèi)IL-37表達(dá)，而IL-37表達(dá)量的增加有助于對(duì)疾病癥狀的控制。一般認(rèn)為，IL-37抑制炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制是通過(guò)和IL-18竟?fàn)幣cIL-18受體（IL-18 receptor）的結(jié)合。IL-37結(jié)合到IL-18Rα上后，復(fù)合體會(huì)捕捉到孤兒誘捕受體（orphan decoy）IL-1R8 與之結(jié)合，隨后IL1R8 的TLRb 結(jié)合區(qū)吸引MyD88 (myeloid differentiation factor 88)與之結(jié)合. 這一相互間的作用能激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路用于阻斷炎癥的發(fā)生，包括對(duì)MAPKS和NF-KB的抑制，mTOR 信號(hào)通路的抑制以及對(duì)抗炎癥通路STAT3，Mer and PTEN的激活。同時(shí)，因?yàn)镸yD88分子被困，它參與IL-1和IL-18信號(hào)通路的程度也相應(yīng)降低。IL-37 對(duì)抗原特異性獲得性免疫的抑制主要是通過(guò)耐受樹(shù)突狀細(xì)胞的產(chǎn)生。因此，IL-37不僅可能提供一種治療諸多炎癥疾病的新的有效方法，而且還有可能用于炎性疾病的早期檢測(cè)和診斷。目前只有大腸桿菌表達(dá)生產(chǎn)小量重組人IL-37作試劑用，遠(yuǎn)不能滿足作為新型檢測(cè)，診斷和治療疾病手段的需求，迫切需要開(kāi)發(fā)另外一種表達(dá)系統(tǒng)能夠廉價(jià)大批量生產(chǎn)高活性的重組IL-37蛋白質(zhì)。

植物作為一種生物反應(yīng)器生產(chǎn)具有醫(yī)藥用途或其他具有商業(yè)價(jià)值的外源蛋白已展現(xiàn)出聚大的優(yōu)勢(shì)和竟?fàn)幜Γ哂袕V闊的市場(chǎng)前景。植物作為重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)有很多優(yōu)點(diǎn)：(1) 低成本、易大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。植物能進(jìn)行光合作用，僅需要來(lái)自土壤的礦物質(zhì)和水分便可在適宜的條件下獲得大量人們所需的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模容易，只需要很少量的再投入。這與微生物和動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)形成明顯的對(duì)照。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)需要使用昂貴的培養(yǎng)基。擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模需要大量新的投資包括購(gòu)買昂貴的新設(shè)備（如發(fā)效罐等）；(2) 由于動(dòng)物和人病毒無(wú)法跨界感染植物細(xì)胞，植物表達(dá)生產(chǎn)的藥物蛋白受人或動(dòng)物病毒感染的機(jī)會(huì)很小，因此，與動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的藥物蛋白比較，植物生產(chǎn)的藥物蛋白臨床使用更安全；(3) 作為高等真核細(xì)胞生物，植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞一樣可以對(duì)新合成的蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后加工修飾，如糖基化（glycosylation）、磷酸化( phosphorylation) and亞基組裝（subunit assembly），因此表達(dá)產(chǎn)物具有與高等動(dòng)物細(xì)胞一樣的免疫原性和生物活性。細(xì)菌作為生物反應(yīng)器時(shí)，不能對(duì)真核生物的蛋白進(jìn)行有效的翻譯后加工，僅適合表達(dá)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單非糖化的蛋白質(zhì)，而且本身可能是人類病原物。煙草(Nicotiana tabacum) 作為表達(dá)平臺(tái)具有其他植物生產(chǎn)體系不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。首先，自1989年第一次用煙草表達(dá)抗體[3]以來(lái)，煙草已經(jīng)成為生產(chǎn)重組蛋白的主要平臺(tái)；其次，煙草是葉子植物產(chǎn)量高，且葉片可溶性蛋白含量高，作為重組蛋白生產(chǎn)平臺(tái)可提高外源蛋白在植物中的表達(dá)量；再次，煙草的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)非常成熟，重組蛋白在煙草中的表達(dá)可選擇不同的方式，比如細(xì)胞核表達(dá)(轉(zhuǎn)基因植物)、葉綠體表達(dá)和瞬時(shí)表達(dá)；最后，煙草既不是人類食物，也不是飼料作物，因此降低了轉(zhuǎn)基因材料污染食物鏈或飼料鏈的風(fēng)險(xiǎn)。

IL-37基因位于人類第二號(hào)染色體上，其基因表達(dá)產(chǎn)物共有五個(gè)剪切亞型 (isoforms a to e) 。目前的研究主要集中在IL-37b，對(duì)于其他亞型的功能還不太了解。不過(guò)因IL-37a和IL-37d的結(jié)構(gòu)與IL-37b相似，即它們的編碼區(qū)都包含第四個(gè)外顯子，可以編碼β-三葉草結(jié)構(gòu)。此結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是IL-1家族細(xì)胞因子的特征性結(jié)構(gòu). 所以推測(cè)和IL-37b 一樣，IL-37a和IL-37d具有生物學(xué)功能。而IL-37c和IL-37e缺乏第四個(gè)外顯子，不能編碼β-三葉草結(jié)構(gòu)，推測(cè)它們可能沒(méi)有生物學(xué)功能或與IL-37b的功能有所不同。 IL-37在多種組織中表達(dá)，包括血液?jiǎn)魏思?xì)胞，組織聚吞噬細(xì)胞，滑膜細(xì)胞，扁桃體B細(xì)胞，漿細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞以及皮膚，腎臟和腸道的上皮細(xì)胞。IL-37 剪切亞型的分布也有一定的組織特異性。例如，IL-3a主要在大腦中表達(dá)，IL-37b主要存在于腎臟，心臟特異性表達(dá)IL-37c，而IL-37d和IL-37e則主要在骨髓和睪丸中表達(dá)。IL-37的五個(gè)亞型都是先合成蛋白前體，切除信號(hào)肽后產(chǎn)生成熟蛋白。但它們的信號(hào)肽都非經(jīng)典序列。信號(hào)肽的切割主要由半胱天冬酶-1（caspase-1）完成。不過(guò)最新的研究認(rèn)為IL-37信號(hào)肽的完全切割需要?jiǎng)e的酶參與其中。在IL-37的五個(gè)亞型中，IL-37b蛋白鏈最長(zhǎng)，由218個(gè)氨基酸組成，含一個(gè)45個(gè)氨基酸組成的N端信號(hào)肽。雖然IL-37b前體和IL-37b 成熟蛋白形式都發(fā)現(xiàn)有活性，但I(xiàn)L-37b成熟蛋白的活性比IL-37b前體蛋白的活性高出20-30倍。IL-37成熟蛋白也可以進(jìn)入細(xì)胞核與核DNA結(jié)合從而影響基因轉(zhuǎn)錄，而其前體蛋白則不能。人IL-37天然以二聚體形式（dimer）存在，但二聚體的形成不是以共價(jià)鍵(二硫鍵)方式連接。到目前為此，在植物細(xì)胞中還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)編碼caspase-1酶的基因，盡管某些植物蛋白質(zhì)序列表現(xiàn)出與動(dòng)物caspases 酶一定的相似性。這意味著當(dāng)用植物細(xì)胞表達(dá)IL-37基因時(shí)，獲得的表達(dá)產(chǎn)物是IL-37前體而非成熟蛋白，因植物細(xì)胞無(wú)法識(shí)別位于IL-37前體的N末端信號(hào)肽序列並加以剪切。

目前，一種可能的方法是只把編碼成熟IL-37的基因在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，但此方法具有明顯的缺點(diǎn)那就是目的蛋白的低表達(dá)量和低活性，因?yàn)樾潞铣傻牡鞍子捎谌鄙傩盘?hào)肽介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)易引起錯(cuò)誤折疊不僅使之失去活性而且易被植物細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的蛋白酶降解。

另一種可能的方法是用植物蛋白信號(hào)肽替換IL-37基因的原信號(hào)肽序列使新合成的目的蛋白分子能實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)并在此過(guò)程中通過(guò)切掉嫁接的植物蛋白信號(hào)肽產(chǎn)生成熟的具有天然N端的目的蛋白. 但這需要測(cè)試許多不同的植物蛋白的信號(hào)肽才有可能找到合適的信號(hào)肽，因?yàn)椴煌盘?hào)肽有不同的作用對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)量有顯著影響。此外，即便用植物蛋白信號(hào)肽作替換，以前的發(fā)現(xiàn)表明由此法表達(dá)的外源基因，蛋白質(zhì)終產(chǎn)物中有相當(dāng)一部分是植物信號(hào)肽未被除掉的前體蛋白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種利用利用TEV 蛋白酶在體內(nèi)和體外高特異性和高活性的雙重特征，通過(guò)設(shè)計(jì)和合成與TEV 蛋白酶在構(gòu)架內(nèi)連接的IL-37融合基因煙草高效表達(dá)IL-37各亞型成熟蛋白的方法。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：一種利用煙草高效表達(dá)IL-37各亞型成熟蛋白的方法，包括以下步驟：

S1. 設(shè)計(jì)IL-37-TEV融合基因：

包括在信號(hào)肽和IL-37成熟蛋白各亞型編碼序列之間插入TEV蛋白酶及其酶切位點(diǎn)編碼序列獲得融合基因、在IL-37成熟蛋白各亞型的天然信號(hào)肽和TEV蛋白酶序列間添加一段柔性連接肽，所述IL-37-TEV融合基因的基本結(jié)構(gòu)順序?yàn)椋鹤陨碓夹盘?hào)肽-柔性連接肽-TEV蛋白酶-TEV酶識(shí)別位點(diǎn)-成熟蛋白各亞型IL-37編碼序列；

所述IL-37成熟蛋白各亞型為IL-37a、IL-37b、IL-37c、IL-37d和IL-37e，其中， IL-37a-TEV融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，IL-37b-TEV融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，IL-37c-TEV融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，IL-37d-TEV融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，IL-37e-TEV融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；其IL-37a-TEV融合基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，IL-37b-TEV融合基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，IL-37c-TEV融合基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，IL-37d-TEV融合基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，IL-37e-TEV融合基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述柔性連接肽序列如SEQ ID NO.11所示；

S2. 構(gòu)建重組表達(dá)載體：

將步驟S1設(shè)計(jì)的IL-37-TEV融合基因連接到過(guò)渡載體PRTL-2-Gus，經(jīng)酶切分離后再克隆到植物表達(dá)雙元空載體的T-DNA ，獲得IL-37成熟蛋白各亞型的重組表達(dá)載體；

S3.表達(dá)：

將步驟S2構(gòu)建的重組表達(dá)載體導(dǎo)入到煙草中進(jìn)行表達(dá)。

進(jìn)一步地，所述IL-37成熟蛋白各亞型為IL-37a、IL-37b、IL-37c、IL-37d和IL-37e。

進(jìn)一步地，所述重組表達(dá)載體由植物組成型E35S啟動(dòng)子及帶有5’端非翻譯的TEV前導(dǎo)序列驅(qū)動(dòng)的基因進(jìn)行的表達(dá)，以Kanamycin 抗性的NPTII基因作為篩選標(biāo)記。

進(jìn)一步地，將步驟S2構(gòu)建的重組表達(dá)載體導(dǎo)入到煙草細(xì)胞中獲得IL-37的轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)IL-37各亞型成熟蛋白。

進(jìn)一步地，將步驟S2構(gòu)建的重組表達(dá)載體注射到煙草中瞬時(shí)表達(dá)IL-37各亞型成熟蛋白。

本發(fā)明中通過(guò)常用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉片遺傳轉(zhuǎn)化方法將重組表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入煙草細(xì)胞中，經(jīng)愈傷細(xì)胞誘導(dǎo)，分化再生和kanamycin抗性篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)IL-37的轉(zhuǎn)基因煙草植株。

將重組表達(dá)載體質(zhì)粒與含有可抑制基因沉默的番茄叢矮病毒(tomato bushy stunt virus，TBSV)基因P19的載體質(zhì)粒用農(nóng)桿菌葉片注射法共注射到煙草葉片中實(shí)現(xiàn)IL-37 成熟蛋白在煙草中的瞬時(shí)表達(dá)。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

在利用植物作為生物器表達(dá)IL-37時(shí)，由于植物細(xì)胞不含有半胱天冬酶-1，因此不能夠識(shí)別和剪切IL-37前體的信號(hào)肽序列而產(chǎn)生成熟目的蛋白。本發(fā)明公布了一種利用煙草高效表達(dá)IL-37各亞型成熟蛋白的方法，首先利用煙草的蝕紋病毒(TEV）蛋白酶在體內(nèi)和體外高特異性和高活性的雙重特點(diǎn)，設(shè)計(jì)在信號(hào)肽和IL-37成熟蛋白編碼序列之間插入 TEV蛋白酶及其識(shí)別位點(diǎn)編碼序列使之形成融合基因。由此，由植物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生的單鏈多肽融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)TEV酶的活性進(jìn)行自我特異性切割從而產(chǎn)生具有天然結(jié)構(gòu)的IL-37成熟蛋白。此外在信號(hào)肽和TEV酶之間添加一段柔性的連接肽序列以保證作為融合單位的TEV酶能相對(duì)獨(dú)立的折疊從而最大程度地保持其酶的活性功能。其后，構(gòu)建了含合成的，密碼子優(yōu)化的融合基因的表達(dá)載體，以植物組成型E35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)融合基因在植物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)；利用膿桿菌介導(dǎo)的葉片轉(zhuǎn)化方法將載體導(dǎo)入葉細(xì)胞，經(jīng)愈傷細(xì)胞誘導(dǎo)、分解再生和卡鈉霉素抗性篩選獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。將重組表達(dá)載體質(zhì)粒與含有可抑制基因沉默的番茄叢矮病毒基因P19的載體質(zhì)粒用農(nóng)桿菌葉片注射法共注射到煙草葉片中實(shí)現(xiàn)IL-37 成熟蛋白在煙草中的瞬時(shí)表達(dá)。由于T-DNA 插入植物細(xì)胞染色體DNA的隨機(jī)性，及其由此對(duì)外原蛋白質(zhì)表達(dá)帶來(lái)的影響，因此每一重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草后獲得的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因植株的篩選不少于25株。利用Western blot等方法，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行檢查分析。結(jié)果顯示，所構(gòu)建的表達(dá)載體正確地表達(dá)IL-37成熟蛋白，并以二聚體形式存在，這與自然的人IL-37蛋白的形式完全一致。最后，對(duì)C-端含有Hisx6 標(biāo)鑒的IL-37通過(guò)His蛋白純化試劑盒的方法從轉(zhuǎn)基因煙草植株葉中分離。純化的Hisx6 標(biāo)鑒IL-37成熟蛋白與小鼠腎上皮細(xì)胞培養(yǎng)。結(jié)果表明植物表達(dá)的IL-37成熟蛋白能有效地抑制由細(xì)菌脂多醣誘發(fā)的炎癥子的分泌，如TNF-a。因此植物表達(dá)的IL-37 具有明顯的活性，為進(jìn)一步利用植物生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)重組IL-37奠定了基礎(chǔ)。

為同時(shí)實(shí)施IL-37 成熟蛋白在煙草中的瞬時(shí)表達(dá)，分別將重組表達(dá)載體質(zhì)粒與含有可抑制基因沉默的番茄叢矮病毒基因P19的表達(dá)載體混合通過(guò)農(nóng)桿菌葉片注射法共注射到本氏煙草葉片中，侵染后1-6d內(nèi)采收葉片。利用Western blot等方法對(duì)侵染的煙草葉片進(jìn)行檢查分析。結(jié)果顯示，所構(gòu)建的表達(dá)載體同樣能夠在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)IL-37成熟蛋白，所得產(chǎn)品對(duì)治療諸多炎癥疾病和炎癥疾病的早期檢測(cè)和診斷具有重要應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為IL-37-TEV融合基因結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為植物表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；

圖3為 pBI-SP-TEV-CS-IL-37b轉(zhuǎn)基因煙草總可溶性蛋白免疫印跡法檢測(cè)IL-37b 成熟蛋白的表達(dá)，圖中，A為使用 anti-IL-37 抗體； B為使用 anti-TEV 抗體；

圖4為pBI-SP-TEV-CS-IL-37bHis6轉(zhuǎn)基因煙草總可溶性蛋白免疫印跡法檢測(cè)IL-37bHis6成熟蛋白的表達(dá)，圖中，A為使用 anti-IL-37 抗體；B為使用 anti-TEV 37 抗體；

圖5為注射pBI-SP-TEV-CS-IL-37b表達(dá)載體質(zhì)粒+ P19 的煙草在不同時(shí)間表達(dá)IL-37b蛋白的Western blot 檢測(cè)，使用 anti-IL-37 抗體；

圖6為 Western blot檢測(cè)經(jīng)Ni柱親和層析法獲得的純化IL-37b蛋白，圖中， A為使用 anti-IL-37 抗體； B為使用 anti-TEV 抗體；

圖7為煙草表達(dá)的IL-37成熟蛋白對(duì)抑制細(xì)胞釋放炎癥因子的活性分析，其中，所使用的細(xì)胞為小鼠腎臟表皮細(xì)胞；Med 指細(xì)胞培養(yǎng)基中含有1ug/ml 的LPS但不含IL-37蛋白作對(duì)照用，IL-37 (STAND) 為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所述。

本發(fā)明公開(kāi)了一種利用煙草高效表達(dá)IL-37各亞型成熟蛋白的方法，利用煙草蝕紋病毒蛋白酶(tobacco etch virus protease, TEV protease) 的高特異性和高活性的雙重特點(diǎn)，在信號(hào)肽和成熟IL-37蛋白編碼序列之間插入TEV蛋白酶及其酶切位點(diǎn)編碼序列形成IL-37-TEV 融合基因；根據(jù)煙草密碼子的偏好性，在保證氨基酸序列不變的情況下，對(duì)融合基因序列進(jìn)行優(yōu)化。并委托加拿大多倫多的Bio Basic 公司合成；將構(gòu)建的IL-37-TEV 融合基因的5'端上游與常用的啟動(dòng)子包括其他調(diào)節(jié)區(qū)域(如增強(qiáng)子) 連接, 并在3'端下游與轉(zhuǎn)錄終止子連接；將構(gòu)建的重組表達(dá)載體通過(guò)轉(zhuǎn)化整合到煙草細(xì)胞染色體上，培育高效穩(wěn)定表達(dá)IL-37 的轉(zhuǎn)基因煙草植株以及通過(guò)注射構(gòu)建的重組表達(dá)載體到煙草葉瞬時(shí)表達(dá)目的蛋白。煙草蝕紋病毒蛋白酶 (TEV protease) 是Nla蛋白酶的27 kDa催化域的簡(jiǎn)稱。TEV蛋白酶為高度位點(diǎn)特異性半胱氨酸蛋白酶，該酶可識(shí)別7個(gè)氨基酸識(shí)別位點(diǎn)(谷氨酸-天冬酰胺-亮氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸)并切斷谷氨酰胺與甘氨酸之間的肽鍵。由于其高活性、高特異性的雙重特點(diǎn)，TEV蛋白酶為融合蛋白質(zhì)裂解的有效試劑。其上游裂解產(chǎn)物含6個(gè)多增加的氨基酸，而下游裂解產(chǎn)物只含有1個(gè)多增加的甘氨酸。Shin et al (Protein Sci. 2005; 14, 936–941) 報(bào)道了細(xì)菌表達(dá)的含TEV 蛋白酶的融合蛋白通過(guò)其酶活性能在細(xì)胞內(nèi)實(shí)施特異性自我切割釋放出具有天然結(jié)構(gòu)(native) 的活性融合伴侶(fusion partner) 。Marcos and Beachy (J Gen Virol. 1997;78, 1771–1778) 報(bào)道外源TEV 蛋白酶在植物細(xì)胞內(nèi)有生物活性。這些最初結(jié)果表明通過(guò)構(gòu)建與TEV 蛋白酶連接的融合基因可達(dá)到表達(dá)具有天然結(jié)構(gòu)的重組目的蛋白。

實(shí)施例1：設(shè)計(jì)和合成Sp-TEV-CS-IL-37b，Sp-TEV-CS-37a，Sp-TEV-CS-IL-37d，Sp-TEV-CS-IL-37c和 Sp-TEV-CS-IL-37e 融合基因

首先在NCBI網(wǎng)站的GenBank 中獲得IL-37各蛋白亞型的cDNA序列，編碼為Gen Bank accession NO.NM_014439.3 for IL37b；Gen Bank accession NO.NM_173205.1 for IL-37a；Gen Bank accession NO.NM_173204.1 for IL-37c；Gen Bank accession NO.NM_173202.1 for IL-37d and Gen Bank accession NO.NM_173203.1 for IL-37e。同樣地，從Gen Bank 中獲得編碼TEV蛋白酶的核酸序列，編碼為Gen Bank accession NO.NP_062908.1。

設(shè)計(jì)IL-37-TEV 融合基因。

如圖 1所示，融合基因的基本結(jié)構(gòu)順序是：自身原始信號(hào)肽-柔性連接肽(GGGGSx3)-TEV蛋白酶-TEV酶識(shí)別位點(diǎn)-成熟IL-37編碼序列。

根據(jù)煙草密碼子的偏好性對(duì)設(shè)計(jì)的TEV-IL-37融合基因在不改變氨基酸的前提下進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的融合基因由人工合成，合成時(shí)在5'端添加PcI1酶切位點(diǎn)，在3'端增加X(jué)ba I酶切位點(diǎn)。本實(shí)施例的融合基因由加拿大多倫多Bio Basics 公司合成并克隆到質(zhì)粒PUC57。合成后的融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1、2、3、4、5 所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6、7、8、9、10 所示。

實(shí)施例2：重組表達(dá)載體pBI-Sp-TEV-CS-IL-37b，pBI-Sp-TEV-CS-IL-37a， pBI-Sp-TEV-CS-IL-37d，pBI-Sp-TEV-CS-IL-37c和 pBI-Sp-TEV-CS-IL-37e的構(gòu)建

(1) 重組表達(dá)載體pBI-Sp-TEV-CS-IL-37b的構(gòu)建: 構(gòu)建方法如圖 2所示，包括下列主要步驟：

使用Nco I+ Xba I 雙酶切過(guò)渡載體pRTL2-GUS，回收去除GUS基因的4.2 Kb 的載體片段。質(zhì)粒pRTL2-GUS 含有E35S啟動(dòng)子 (enhanced 35S promoter）- 5'端非翻譯的TEV前導(dǎo)序列-GUS- Nos3’ 終止子的GUS基因表達(dá)盒。

使用Pci l 和Xba I酶切所述pUC57-Sp-TEV-CS- IL-37b 質(zhì)粒，回收融合基因片段并插入到pRTL2-GUS 經(jīng)Nco I+ Xba I酶切后回收的載體片段得到過(guò)渡表達(dá)載體 pRTL2- Sp-TEV-CS- IL-37b。

使用Hind III 酶切所述的過(guò)渡表達(dá)載體pRTL2- Sp-TEV-CS- IL-37b，回收含融和基因表達(dá)盒（E35S-Sp-TEV-CS-IL-37b-Nos3’）DNA片段，并插入到經(jīng)Hind III酶切的雙元載體pBI101-1獲得重組表達(dá)載體 pBI- Sp-TEV-CS-IL-37b。

由三親交配法(tri-parental mating) 將構(gòu)建的表達(dá)載體pBI- Sp-TEV-CS-IL-37b轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。

(2) 重組表達(dá)載體pBI-Sp-TEV-CS-IL-37a 的構(gòu)建: 其構(gòu)建方法與載體pBI- Sp-TEV-CS-IL-37b的構(gòu)建相同。

(3) 重組表達(dá)載體pBI-Sp-TEV-CS-IL-37d 的構(gòu)建: 其構(gòu)建方法與載體pBI- Sp-TEV-CS-IL-37b的構(gòu)建相同。

(4) 重組表達(dá)載體pBI-Sp-TEV-CS-IL-37c 的構(gòu)建: 其構(gòu)建方法與載體pBI- Sp-TEV-CS-IL-37b的構(gòu)建相同。

(5) 重組表達(dá)載體pBI-Sp-TEV-CS-IL-37e 的構(gòu)建: 其構(gòu)建方法與載體pBI- Sp-TEV-CS-IL-37b的構(gòu)建相同。

實(shí)施例3：煙草的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建的重組表達(dá)載體質(zhì)粒由三親交配法(tri-parental mating) 分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404。

煙草培養(yǎng)。煙草種子（N. tabacum CV.81V9）用70%酒精消毒后，種植在一個(gè)含MS + 8g/L瓊脂培養(yǎng)基的植物組織培養(yǎng)盒（magenta vessel）中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)。溫度25±1°C，濕度70%左右，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗循環(huán)光照下培養(yǎng)。3-4周后，幼苗長(zhǎng)到3-4片真葉時(shí)，即可取無(wú)菌植物葉作遺傳轉(zhuǎn)化材料用。

重組表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化煙草。參照Horsch等 (Science 1985. 227，1229-1231)描述的葉片轉(zhuǎn)化方法引入本發(fā)明中的質(zhì)粒。以重組載體PBI-Sp-TEV-CS-IL-37 b為例，將含有該質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落置于5mL 液體TYC (蛋白胨8g/L，酵母4g/L，氯化鈣6.6%) +50mg/L Km +20mg/L Rif培養(yǎng)基中，28℃，180rpm，振蕩培養(yǎng)。取 1 mL 菌液置于 50 mL 液體液體TYC +50 mg/L Km +20mg/L Rif培養(yǎng)基中，28℃，180rpm，培養(yǎng)至OD600=0.5~0.6，6000rpm，離心10min，收集菌體，40mL MS 培養(yǎng)液重懸菌體，煙草無(wú)菌苗葉片去主葉脈和葉片邊緣并切成約1.0cm 小片，在菌液中浸染5min，無(wú)菌濾紙吸干菌液，接種于MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA 培養(yǎng)基上，25℃，黑暗條件下共培養(yǎng) 3 d 后，轉(zhuǎn)接至選擇培養(yǎng)基 (MS+ 6-BA(1 mg/L)+NAA(0.1 mg/L) + Km (100 mg/L) + Cb (500 mg/L)+ 蔗糖(30g/L) + 瓊脂 (8g/L)) 上進(jìn)行芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)，芽長(zhǎng)至約2 cm 時(shí)切下，接種于生根培養(yǎng)基(MS+ Km (100 mg/L) + Cb (500 mg/L) +蔗糖(30g/L) + 瓊脂 (8g/L))上進(jìn)行誘導(dǎo)生根培養(yǎng)。生根后的再生苗移植至花盆中，放到(25±0.5)℃ 溫室培養(yǎng)。

實(shí)施例4：煙草的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

煙草培養(yǎng)：本氏煙草種子(N. Benthamiana ），4C°用水浸泡48 h，播種于土壤中，在25± 1℃、16 h/d 光照的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約 30 天后待其為五葉或六葉期時(shí)即可用于實(shí)驗(yàn)。

分別將含有pBI-Sp-TEV-CS-IL-37b，pBI-Sp-TEV-CS-IL-37a， pBI-Sp-TEV-CS-IL-37d，pBI-Sp-TEV-CS-IL-37c和 pBI-Sp-TEV-CS-IL-37e質(zhì)粒的 LBA4404 農(nóng)桿菌的單菌落接種到TYC液體培養(yǎng)基+ 50 mg/L Km + 100 mg/L Rif， 28℃下，搖24 至 48h。吸取100ul菌液加入10ml TYC液體中，再培養(yǎng)24 h。收集菌體，4℃下，5000×g 離心 10 min，去除上清液，留菌體。將菌體懸浮在懸浮液 (5 mg/ml d-葡萄糖，500 nM MES，20 nM Na₃PO_4?12 H₂O，1M acetosyringone (乙酰丁香酮)) ，6000rpm，離心10min，收集菌體，懸浮液重懸菌體，測(cè)定OD600值。將含有P19 (作用是增加目的蛋白的表達(dá)量) 和目的基因的懸浮液根據(jù)所定農(nóng)桿菌的滴度OD=0.5 按1:1比例混合成侵染液。

用去針頭的一次性注射器將懸浮有農(nóng)桿菌的侵染液從煙葉背面注入葉片內(nèi)。注射完畢后，置于25±1℃人工培養(yǎng)室中培養(yǎng)。注射24 h后收集注射區(qū)域煙草葉，每天一次直到第6天。

實(shí)施例5：轉(zhuǎn)基因煙草IL-37蛋白表達(dá)的檢測(cè)

以重組表達(dá)載體pBI-Sp-TEV-CS-IL-37b轉(zhuǎn)基因煙草為例。取新鮮轉(zhuǎn)基因煙草葉片 0.5 g，立即放在研缽中加液氮磨碎,將研磨好的葉片收集于 2mL EP 管中加入 1 mL蛋白提取液（200mM Tris pH8.0，100 mM NaCL，400 mM 蔗糖，10 mM EDTA，0.1mM ?-琉基乙醇，0.05% Tween-20，1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF），0.1% aprotitin 和0.1% leupeptin），冰上孵育 20~30min，4℃ 12000 rpm/min離心 20min。收集上清，上清為可溶蛋白提取液。

SDS-PAGE 和 Western 免疫印跡法(Western blot) 分析。取蛋白提取液，加入sample buffer，沸水中煮樣10min。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后，利用Western免疫印跡方法(Western Blot) 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。Western blot 檢測(cè)結(jié)果證明，獲得的轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)IL-37b成熟蛋白，并以期望的二聚體（dimer）形式存在，如圖3所示，圖中，M 為蛋白分子量marker； WT為非轉(zhuǎn)基因煙草總可溶性蛋白作負(fù)對(duì)照； lanes b1至b18 為部分轉(zhuǎn)基因植株；箭頭所指為煙草表達(dá)的IL-37b 成熟蛋白形式(二聚體)；圖左側(cè)的數(shù)字為蛋白分子量大小標(biāo)準(zhǔn)。IL-37是非糖蛋白, 不含信號(hào)肽的IL-37b成熟蛋白由173個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量約為19 kDa. IL-37b二聚體的分子量與IL-37-TEV融合蛋白在胞內(nèi)自我剪切后產(chǎn)生的第二個(gè)多肽產(chǎn)物 (即信號(hào)肽+TEV片段) 的分子量相似，發(fā)生兩個(gè)蛋白片段共遷移為一個(gè)寬條帶，如圖3A所示。條帶中間呈現(xiàn)出的不與IL-37抗體反應(yīng)的泡狀帶為SP-TEV多肽。

實(shí)施例6：轉(zhuǎn)基因煙草IL-37His₆蛋白表達(dá)的檢測(cè)

以重組表達(dá)載體pBI-Sp-TEV-CS-IL-37bHis₆轉(zhuǎn)基因煙草為例。蛋白提取方法如實(shí)施例5的方法提取。

SDS-PAGE 和 Western 免疫印跡法(Western blot) 分析。結(jié)果與實(shí)施例5所述一致，如圖4所示，圖中，M 為蛋白分子量marker; WT為非轉(zhuǎn)基因煙草總可溶性蛋白作負(fù)對(duì)照； lane b’1 to b’18 為部分轉(zhuǎn)基因植株；箭頭所指為表達(dá)的IL-37bHis₆成熟蛋白形式(二聚體)；圖左側(cè)的數(shù)字為蛋白分子量大小標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)施例7：煙草瞬時(shí)表達(dá)IL-37的檢測(cè)

以重組表達(dá)載體PBI-Sp-TEV-CS-IL-37 b注射煙草瞬時(shí)表達(dá)為例。使用實(shí)施例5所述蛋白質(zhì)提取方法，從不同時(shí)間收集的注射區(qū)域煙草中提取蛋白質(zhì)。

使用實(shí)施例5所述的SDS-PAGE和Western blot 方法檢測(cè)提取的蛋白質(zhì)。檢測(cè)結(jié)果證明煙草瞬時(shí)表達(dá)IL-37 b 成熟蛋白，并同樣以二聚體（dimer）形式存在，如圖5所示，圖中，1-6指注射表達(dá)載體后的1至6天（DAI）收集的煙草。M 為蛋白分子量marke；IL-37+為IL-37蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；WT為非轉(zhuǎn)基因煙草總可溶性蛋白作負(fù)對(duì)照；箭頭所指為煙草瞬時(shí)表達(dá)的IL-37b 成熟蛋白(二聚體)，圖左側(cè)的數(shù)字為蛋白分子量大小標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)施例8：煙草表達(dá)的IL-37的純化和檢測(cè)

以從轉(zhuǎn)基因煙草純化IL-37bHis₆ 為例。使用His 靶向的蛋白純化試劑盒（His-Trap kit，購(gòu)自Cedar lane Canada）和根據(jù)使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化。

使用實(shí)施例5所述的SDS-PAGE和Western blot 方法檢測(cè)純化的蛋白，結(jié)果如圖6所示，其中，M為蛋白質(zhì)分子量marker；TSP為轉(zhuǎn)基因煙草可溶性總蛋白(上柱前)；FT為flow- through；W為wash；E1為eluted fraction 1；E2為eluted fraction 2；圖 6A箭頭所指為IL-37b 成熟蛋白 (二聚體形式) ，當(dāng)使用抗TEV抗體檢查時(shí)，E1和E2不與抗體反應(yīng)，如圖6 B，表明純化的IL-37b蛋白中不含有SP-TEV多肽。圖左側(cè)的數(shù)字為蛋白分子量大小標(biāo)準(zhǔn)。圖6 結(jié)果表明純化的IL-37bHis₆中不含有SP-TEV蛋白片段。

實(shí)施例9：煙草表達(dá)的IL-37成熟蛋白對(duì)抑制細(xì)胞釋放炎癥因子的活性分析

無(wú)菌取B6小鼠腎臟輕碾，加HANK'S（平衡鹽溶液）液沖洗，2000 rpm，5 min，離心棄上清，加1% 膠原溶解酶 V(collagens V，Invitragen），37C°，30min溶解腎組織。加HANK'S液阻止溶解。離心，種植細(xì)胞到腎細(xì)胞培養(yǎng)液K1+/+（K1+/+ 復(fù)合培養(yǎng)液 50：50 DMEM 和Ham’s F12；含有10%小牛血清（FBS），和激素包括5Ig/ml的胰島素（insulin），34pg/ml三碘甲狀腺氨酸(triiodothyronine），5Ig/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)，1.73ng/ml 亞硒酸鈉(sodium selenite)，8ng/ml 氫化可的松(hydrocortisone)，25ng/ml 上表皮生長(zhǎng)因素(epidermal growth factor)，100u/ml青霉素(penicillin)，100u/ml鏈霉素(streptomycin ）中. 5% CO₂，37C° 一定的濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5-7天后腎上皮細(xì)胞長(zhǎng)滿到80%。懸浮細(xì)胞于K1+/+液中。用0.4% 用臺(tái)盼藍(lán) (Trypan blue) 染色，血球計(jì)（hemocytometer）計(jì)數(shù)以0.8x10⁶ 細(xì)胞濃度種植到96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24hr后加入100 ul K1-/- (DMEM/Ham’s F12 50/50 Mix)，100u/ml青霉素，100u/ml鏈霉素和不同濃度純化的植物表達(dá)的IL-37(prIL-37)，每孔最終濃度分別為 0，20，10，5，2,5 0.625 nM). 標(biāo)準(zhǔn)IL-37蛋白作負(fù)對(duì)照. 培養(yǎng)24hr小時(shí)后，棄上清液，加100ul K1-/- 培養(yǎng)液含1ug/ml 脂多糖(lipopolysaccharides）。培養(yǎng)24hr后收集上清液，用TNF-a試劑盒（R&D Canada）測(cè)定 TNF-a濃度，如圖7所示，結(jié)果表明植物表達(dá)的IL-37具有高度生物活性。

SEQUENCE LISTING

<110> 馬生武、安托尼.邁克爾.耶尼卡、鄧紹平、楊洪吉、魏亮

<120> 一種利用煙草高效表達(dá)IL-37各亞型成熟蛋白的方法

<130> 2016

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1371

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtcaggtt gtgatagaag agagacagaa actaagggta aaaacagctt caagaagcga 60

ctaagaggac caaaggttgg tggaggtgga tctggtggag gtgggtcagg agggggggga 120

tctggtgaat ctcttttcaa gggtcctaga gattacaatc caatcagtag tacaatctgt 180

cacttaacca acgaaagcga tggtcataca acaagtctct acggtatcgg atttggtcca 240

ttcattatta ccaacaagca tctcttcaga agaaacaacg gaacactcct cgttcaatca 300

ctgcatggag ttttcaaggt aaagaacaca accaccttgc aacaacattt gatagacgga 360

agagatatga ttataattag gatgccaaag gacttcccgc cttttccaca gaagttgaag 420

tttcgagagc ctcaacgtga agaacgtatt tgccttgtaa ccactaattt tcagacaaag 480

tccatgtcca gcatggtttc agatacttcc tgcacttttc cttcctctga tggaattttc 540

tggaaacact ggattcagac aaaagacggg caatgcgggt ctcctttggt ttcaactagg 600

gatgggttca tagttggcat acattcagca tcaaatttta ctaatactaa taattatttt 660

acttctgtcc ccaaaaattt tatggagctt cttactaatc aggaggctca gcagtgggtc 720

tctggctgga ggttgaatgc tgactctgtt ttgtggggcg gccacaaagt gtttatgtca 780

aaaccagaag aaccatttca acccgtgaaa gaggccactc aattaatgaa tgagcttgtg 840

tattctcaag aaaatttgta ttttcaaggc aagaacttaa acccgaagaa attcagcatt 900

catgaccagg atcacaaagt actggtcctg gactctggga atctcatagc agttccagat 960

aaaaactaca tacgcccaga gatcttcttt gcattagcct catccttgag ctcagcctct 1020

gcggagaaag gaagtccgat tctcctgggg gtctctaaag gggagttttg tctctactgt 1080

gacaaggata aaggacaaag tcatccatcc cttcagctga agaaggagaa actgatgaag 1140

ctggctgccc aaaaggaatc agcacgccgg cccttcatct tttatagggc tcaggtgggc 1200

tcctggaaca tgctggagtc ggcggctcac cccggatggt tcatctgcac ctcctgcaat 1260

tgtaatgagc ctgttggggt gacagataaa tttgagaaca ggaaacacat tgaattttca 1320

tttcaaccag tttgcaaagc tgaaatgagc cccagtgagg tcagcgattg a 1371

<210> 2

<211> 1449

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtcctttg tgggggagaa ctcaggagtg aaaatgggct ctgaggactg ggaaaaagat 60

gaaccccagt gctgcttaga agacccggct gtaagccccc tggaaccagg cccaagcctc 120

cccaccatga attttggtgg aggtggatct ggtggaggtg ggtcaggagg ggggggatct 180

ggtgaatctc ttttcaaggg tcctagagat tacaatccaa tcagtagtac aatctgtcac 240

ttaaccaacg aaagcgatgg tcatacaaca agtctctacg gtatcggatt tggtccattc 300

attattacca acaagcatct cttcagaaga aacaacggaa cactcctcgt tcaatcactg 360

catggagttt tcaaggtaaa gaacacaacc accttgcaac aacatttgat agacggaaga 420

gatatgatta taattaggat gccaaaggac ttcccgcctt ttccacagaa gttgaagttt 480

cgagagcctc aacgtgaaga acgtatttgc cttgtaacca ctaattttca gacaaagtcc 540

atgtccagca tggtttcaga tacttcctgc acttttcctt cctctgatgg aattttctgg 600

aaacactgga ttcagacaaa agacgggcaa tgcgggtctc ctttggtttc aactagggat 660

gggttcatag ttggcataca ttcagcatca aattttacta atactaataa ttattttact 720

tctgtcccca aaaattttat ggagcttctt actaatcagg aggctcagca gtgggtctct 780

ggctggaggt tgaatgctga ctctgttttg tggggcggcc acaaagtgtt tatgtcaaaa 840

ccagaagaac catttcaacc cgtgaaagag gccactcaat taatgaatga gcttgtgtat 900

tctcaagaaa atttgtattt tcaaggcgtt cacacaagtc caaaggtgaa gaacttaaac 960

ccgaagaaat tcagcattca tgaccaggat cacaaagtac tggtcctgga ctctgggaat 1020

ctcatagcag ttccagataa aaactacata cgcccagaga tcttctttgc attagcctca 1080

tccttgagct cagcctctgc ggagaaagga agtccgattc tcctgggggt ctctaaaggg 1140

gagttttgtc tctactgtga caaggataaa ggacaaagtc atccatccct tcagctgaag 1200

aaggagaaac tgatgaagct ggctgcccaa aaggaatcag cacgccggcc cttcatcttt 1260

tatagggctc aggtgggctc ctggaacatg ctggagtcgg cggctcaccc cggatggttc 1320

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<210> 3

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3