本發(fā)明具體涉及l(fā)ncRNA-MIR3945HGV1在菌陰肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

結(jié)核病至今仍是全球范圍內(nèi)感染率最高的傳染病，防控形勢十分嚴(yán)峻。快速、敏感診斷是提高治療效果、有效控制結(jié)核病傳播的關(guān)鍵。在全國肺結(jié)核患者中，菌陰肺結(jié)核患者占活動(dòng)性肺結(jié)核患者的60％～70％，且多種其他肺部疾病的臨床癥狀和影像學(xué)特征難以與結(jié)核病相區(qū)別。對菌陰肺結(jié)核有效診斷的方法缺乏，往往造成患者診斷延誤或誤診。我國雖已制定診斷的若干標(biāo)準(zhǔn)，但在臨床應(yīng)用中仍存在許多困惑，并未解決有效診斷菌陰肺結(jié)核這一難題。因此，尋找菌陰肺結(jié)核診斷新標(biāo)識、開創(chuàng)新診斷方法已成為當(dāng)務(wù)之急！

現(xiàn)有肺結(jié)核診斷方法主要為痰結(jié)核菌檢查、結(jié)核菌素試驗(yàn)、特異性抗體測定、影像學(xué)檢查等方法。痰結(jié)核菌檢查耗時(shí)長，假陰性高；結(jié)核菌素試驗(yàn)假陽性高，不容易區(qū)分接種卡介苗人群和結(jié)核病人群；影像學(xué)檢查難以區(qū)分肺結(jié)核病和其他肺部疾病。而找到核酸作為診斷標(biāo)志物，使用PCR技術(shù)作為診斷方法，具有快速、敏感等優(yōu)點(diǎn)，并且價(jià)格比特異性抗體便宜，制備和檢測操作也方便。因此，尋找可以作為菌陰肺結(jié)核診斷的核酸標(biāo)志物，意義非凡。

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)屬于胞內(nèi)寄生菌，主要寄生于巨噬細(xì)胞(macrophage)。結(jié)核分枝桿菌以氣溶膠的形式，經(jīng)人體呼吸道進(jìn)入肺組織，被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬(AM)，但MTB通過相應(yīng)的機(jī)制逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的清除，MTB不會(huì)被AM完全清除。因此MTB能在巨噬細(xì)胞胞內(nèi)生長繁殖，并借助巨噬細(xì)胞的遷徙，繼續(xù)感染其他未被感染的巨噬細(xì)胞。LncRNA(longnoncodingRNA)是一類長度大于200nt的不編碼蛋白的RNA，lncRNA能在表觀遺傳上、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá)，其功能廣泛，參與調(diào)控機(jī)體的各種生命活動(dòng)。已經(jīng)有文獻(xiàn)證明，lncRNA參與機(jī)體免疫的調(diào)控。

目前已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道，lncRNA可以作為癌癥診斷標(biāo)志物。但尚未有以lncRNA作為診斷標(biāo)志物檢測肺結(jié)核的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種lncRNA診斷標(biāo)志物MIR3945HGV1，用于快速診斷菌陰肺結(jié)核，且價(jià)格比目前的診斷方法低廉。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

lncRNA核酸標(biāo)志物在結(jié)核診斷中的應(yīng)用，該lncRNA核酸標(biāo)志物的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，記為MIR3945HGV1。

優(yōu)選的，所述結(jié)核診斷為肺結(jié)核診斷。

優(yōu)選的，所述肺結(jié)核診斷為菌陰肺結(jié)核診斷。

一種菌陰肺結(jié)核診斷試劑盒，該試劑盒含有能夠?qū)ncRNA-MIR3945HGV1的表達(dá)量進(jìn)行定量的試劑。

能夠?qū)ncRNA-MIR3945HGV1的表達(dá)量進(jìn)行定量檢測的試劑在制備肺結(jié)核診斷試劑盒中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述定量檢測的試劑含有能夠?qū)崟r(shí)熒光定量檢測lncRNA-MIR3945HG V1的引物序列。

優(yōu)選的，所述肺結(jié)核為菌陰肺結(jié)核。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明通過前期的批量篩選，從中篩選獲得的lncRNA-MIR3945HGV1作為菌陰肺結(jié)核的診斷標(biāo)志物，通過檢測MIR3945HG V1的表達(dá)水平，能夠有效區(qū)分未感染人群與菌陰肺結(jié)核患者。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)：MTB感染巨噬細(xì)胞(MΦ)后，引起MΦ的各種反應(yīng)，其中包括基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的合成，lncRNA的表達(dá)也受到調(diào)控。MTB感染MΦ后，能引起MIR3945HGV1的表達(dá)上調(diào)，說明MIR3945HG V1在MTB感染MΦ的過程中發(fā)揮著相應(yīng)的作用。用熒光定量PCR(qPCR)檢測菌陰肺結(jié)核病人和健康正常人的PBMC，相對于健康正常人，MIR3945HG V1在菌陰肺結(jié)核病人PBMC表達(dá)上調(diào)，并且兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此MIR3945HGV1可以作為診斷菌陰肺結(jié)核病人和健康正常人的診斷標(biāo)志物。

附圖說明

圖1為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測MTB感染的MΦ中MIR3945HGV1的表達(dá)水平；

圖2為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測菌陰肺結(jié)核患者PBMC中l(wèi)ncRNA-MIR3945HGV1的表達(dá)；圖3為ROC曲線分析。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)：①M(fèi)TB感染巨噬細(xì)胞MΦ后導(dǎo)致MIR3945HG V1表達(dá)上調(diào)；②對30例菌陰肺結(jié)核患者PBMC的檢測結(jié)果也顯示，其MIR3945HG V1的表達(dá)水平顯著高于健康志愿者；受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,簡稱ROC曲線)分析結(jié)果表明，MIR3945HGV1有望成為菌陰肺結(jié)核診斷新靶點(diǎn)。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。

實(shí)施例1感染MTB的MΦ中MIR3945HG V1的表達(dá)上調(diào)

分離健康志愿者的PBMC，免疫磁珠分選CD14⁺單核細(xì)胞，用GM-CSF誘導(dǎo)單核細(xì)胞向MΦ分化，將所得的MΦ感染MTB。72h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測MΦ中MIR3945HGV1的表達(dá)水平。

檢測結(jié)果如圖1所示，從中可以看出，MTB感染后的MΦ的MIR3945HGV1的表達(dá)水平明顯上調(diào)，說明MTB感染促進(jìn)了MIR3945HGV1的表達(dá)。

實(shí)施例2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測菌陰肺結(jié)核患者PBMC中MIR3945HG V1的表達(dá)情況

提取30例菌陰肺結(jié)核患者與32例健康志愿者PBMC的RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測lncRNA-MIR3945HGV1的表達(dá)水平。

檢測結(jié)果如圖2所示，從中可以看出，菌陰肺結(jié)核患者PBMC中MIR3945HG V1表達(dá)呈現(xiàn)顯著上調(diào)趨勢(P<0.0001)。

實(shí)施例3MIR3945HGV1作為菌陰肺結(jié)核診斷的新靶點(diǎn)

本研究發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，MIR3945HG V1在結(jié)核患者PBMC中表達(dá)呈現(xiàn)極顯著上調(diào)趨勢(P<0.0001)。為了解MIR3945HGV1在PBMC的表達(dá)變化是否可以用于區(qū)分健康人與結(jié)核患者，我們使用ROC曲線分析MIR3945HGV1在PBMC中的表達(dá)變化是否用于結(jié)核病的診斷。

根據(jù)MIR3945HG V1在健康人以及結(jié)核患者PBMC中的相對表達(dá)量，采用統(tǒng)計(jì)分析軟件，建立橫坐標(biāo)為特異性、縱坐標(biāo)為靈敏度的ROC曲線，見圖3。結(jié)果顯示，ROC曲線下面積AUC(A)＝0.9258，說明MIR3945HGV1用于結(jié)核病人診斷具有較高的準(zhǔn)確性(圖3)。ROC曲線中A值意義說明：在A>0.5的情況下，A越接近于1，說明診斷效果越好。A在0.5～0.7時(shí)有較低準(zhǔn)確性，在0.7～0.9時(shí)有一定準(zhǔn)確性，在0.9以上時(shí)有較高準(zhǔn)確性。

對ROC曲線(累積頻數(shù)分布)進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。

表1ROC曲線分析結(jié)果

(以上省略號表示原始數(shù)據(jù)太多，表中僅列出關(guān)鍵數(shù)據(jù))。

對表1結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：當(dāng)MIR3945HGV1的轉(zhuǎn)錄水平Cut-off值(域值)取11.25時(shí)，約登指數(shù)(Youden’s index,YI)最大(YI＝75)，此時(shí)檢測靈敏度可以達(dá)到100％，而特異性達(dá)到75％。所以，將MIR3945HG V1用于結(jié)核病的診斷是可行的，對于提高結(jié)核病的診斷率具有重要意義。

綜上所述：lncRNA-MIR3945HGV1可作為菌陰肺結(jié)核診斷新靶點(diǎn)。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110> 南方醫(yī)科大學(xué)

<120> lncRNA-MIR3945HG V1在菌陰肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3390

<212> RNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

atgtgggtag tctgaggccc acggtgtcag aagccctggt tattcaggct cctgaatggt 60

gactggtttg tcccctcctg ctggagtcat gtgtcctctg aactggccat ggagcagaag 120

aggttgcatg gccagaagga aaggaaaact gctcctgtct ccccatcccc tagaatcgtt 180

gacaaaatga gtgacactgc cctgggatct gggtctctgg ttgaggcctt ggagctactg 240

cctctgcctg tgaactcacc catcatcgct aacaggttgc tccacagcct acagatctca 300

atatttcgct agcacaaaac ccaagcggcc aggcacggtg gctcacgcct gtaatcccag 360

cactttggga ggccgaggcg ggtggatcac ttgaggtcag gagttcgaga ccagcctgac 420

caacatggag aaaccccgtc tctactaaaa atacaaaatt agccgggcgt ggtgacacgt 480

gcccgtaatc ccagctactt gggaggctga ggcaggagaa ttgcttgaac accgggggtg 540

gaggttgtgg tgagccgaga ttgcaccact gcactccagt ctgggagaca gagagagacc 600

ccatctcaaa agaaaaaaaa aaaaaaagac caagggactt ccgggaacta aaacatctca 660

gccctttcat cgccagtgtc ttcatcttac aagcagaaaa ggaaaaaaag cagtgggaag 720

cagtaagaag ctaccgctga ctcactatga attactgctg actttgaatt atttagcagc 780

tgtggaaaag ccatcttttg tttaaaaaaa aaatagggtt ttctgaaatg ctttttattt 840

ttttatttgt ataaatacct gcccagaaca gtcaagtcaa ctgacatctg ctaaatgact 900

gagacactgt ggaatttgta tactggcatg gtgtgcagtt tcgtgcaagt ataaccacag 960

agacagacaa atctctatca ttgccacaga ctgcttatag caaaattcca gagctcctgt 1020

cattggtctt taatagttgt gctttgttgc ttttgttacc acgtgtgcat ttgtgtcaac 1080

attatacaaa gcactctttc tcacaagagc tagtttcact ctacaaccat actgtaagac 1140

aggtattgtt ttaagatcaa gaaaccaagg ctctgagagg tttagtgact cacctaagat 1200

catgaactaa taataagtga cggatcaggg acttgacctg ggacattgat gccaattcca 1260

gggcaccttc caccgtgtca tatggcactt gctctacata tgtgccaggc agcacccgca 1320

tggcttttcc tcatgaaaca acgtggaccc aggcctacac agcagttgtg agaaagtgcc 1380

tccagctggg agcgcatctg gcccagggca ccagctgcca ctccatgctc tgaatccatc 1440

ctggcctgtg ctgagacccc ccctttccat gggctgctcc ccacccgtga tggggcatgg 1500

caggggcact aggcagcccc cttcctgaga gacatggggc tcctctgcct agaatgttgt 1560

ctcagcactt ctcttctgcc ttgctgaact ttccctagag ccaaggaggc ctccatacaa 1620

cctttcctct ccttcatttg gagtcagact tgcactgcag tctaatggtc atcccacttt 1680

tttccagctc cctgataaaa tctatggctt ctgcttcttg gaggacccag attatcacag 1740

cttatctcat tcctttgcag cagatgcccc tgcaggccat ctctccaggc tcaggaacct 1800

aaagaagaat ctacccagat gtggtggctc acacctgtga tcccaccact ttgggaggct 1860

gaggcaagag gatcacttga gcccaggagt tggagaccaa cgtaggcaat acagcaagac 1920

tcccatctct acaaaaaaaa aaaagaaaga aagaaagaaa gaaaagaaat tagctggctg 1980

tggtgctgca catttgtaat accagctact ctagaggctg aggctggagg atcacttgag 2040

ccgaggagtg agctatgacc acaccattgc atttcagcct cagtgacaga gcaaggccct 2100

gcctcaaaaa aaaaaaaaaa aaaagaaaag aataagataa aataaataat acaggagaac 2160

ctagtgctca ggttctctag tgaagaggaa ggcaaaagat agaaaggtca gacaaactta 2220

aacatgcatt ccaagatcgg cctgggtccg cccgtagaca tgaaggaatc ttctggtgga 2280

aagttaggca gggaaacgga cactgctatg agcatgtctt cctgggcagc ttgcgatggt 2340

caggaggagg tggttgttcc tcagcagcgg tgcttccgat gaagccccat gttgtagtgg 2400

aagacaagcc attcctgtct gaccttctgt gccgcgccta ggcttccaaa agctgctatc 2460

gccaagatcc atttccgttc acctttaaac tgcttgttat ggggaggagt cagccagcca 2520

tgatgcatac ttgttacaga aagaaacgcc cacgttgagc tctcctgata agaagagaga 2580

gcattcgtca ttgtctgtat ctgtcatctg aagaaggaac caatgtcaaa aatcccacac 2640

attctcctcc cgcaagtcac agagtaagcc tcccattctt gagctcgttc attcaccaaa 2700

cacattctga tctctcctgt gcccaggcgg tgggattcag agaagaagtg ctgcctagta 2760

gtcagcaccc agtgccagga aaacaggaca aggggagttg tcgggggaga caccaggatt 2820

gaagttgctt ttactaaaaa acattttttt tatcttgtta acaaatatat ttaccatggt 2880

acatggtggc aatgctctca gttttaaaac acagcaatta tcttccagtg gtcactaatt 2940

aatccaggtg tggctaggaa cagctggata ctgatctgtg tgatgatggc acctctatca 3000

tcaggctgcc attgctggca ctttgggcaa ggtggactgg ggttctgctc tggggctgtg 3060

tgcccaaggt ttacacctca ctattttaca gcacactgga gctcccaaca gtccccgaag 3120

gtctggagat caccaatggg caggagagaa gggaggggtt tagacatcag ggagccaagt 3180

tctacagcat cttctagatc caggctatcg agcacttgaa atgcggctaa gtctgaattg 3240

agatgtgctg tgtgtaagag acacaacaga ttttgaagac agtatgagaa aaagaacata 3300

aaatatctca gtaattttat attgattaca tgttgaaatg atactaattt ttgatatact 3360

gggttaaata aaatagatta ttaaaattaa 3390