本發(fā)明屬于中藥材鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于ITS2序列鑒別大花龍膽與混偽品的引物、鑒別方法。

背景技術(shù)：

大花龍膽G.szechenyii，具有清濕熱，瀉肝膽實(shí)火，鎮(zhèn)咳，利喉，健胃等功效，主治肺熱咳嗽，目赤咽痛，陰部濕疹，天花等病癥，藥用部位為其干燥花枝。目前，大花龍膽被歸類(lèi)為白花龍膽的一種，除了大花龍膽，白花龍膽還包括高山龍膽和岷縣龍膽。

由于大花龍膽主要來(lái)自野生，而且功效有其特殊之處，市場(chǎng)需求量逐年攀升，市場(chǎng)價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)比其他白花龍膽類(lèi)藥材，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。但是，由于外形相似、分類(lèi)混亂、鑒定者知識(shí)的局限性等原因，目前大花龍膽與其他白花龍膽以及秦艽等龍膽屬藥材難以區(qū)分，導(dǎo)致對(duì)大花龍膽的認(rèn)識(shí)存在同物異名、同名異物、品種之間誤用混用等問(wèn)題，嚴(yán)重影響了用藥的準(zhǔn)確性和安全性。

目前，有關(guān)大花龍膽的研究只見(jiàn)零星報(bào)道，對(duì)大花龍膽的鑒別仍然主要依靠傳統(tǒng)的形態(tài)分類(lèi)學(xué)鑒定，鑒定工作難度很大。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子鑒定方法也越來(lái)越多的應(yīng)用到中藥材的鑒定上，但目前還未見(jiàn)使用分子技術(shù)對(duì)大花龍膽進(jìn)行鑒別的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于ITS2序列鑒別大花龍膽與混偽品的引物、鑒別方法。

本發(fā)明提供了一種鑒別大花龍膽與混偽品的引物對(duì)，它是SEQ ID NO:1-2所示的引物對(duì)，用于擴(kuò)增ITS2序列。

本發(fā)明還提供了一種鑒別大花龍膽與混偽品的方法，它包括如下步驟：

a、提取待檢樣本的DNA；

b、基因擴(kuò)增：采用SEQ ID NO:1-2所示的引物對(duì)，對(duì)待檢樣本中的DNA進(jìn)行PCR，得到PCR產(chǎn)物；

c、結(jié)果分析：對(duì)步驟b)擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析即可。

其中，步驟b中，所述PCR的條件為：94℃下變性5min；然后在94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

其中，步驟c中，所述對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析的方法為：分析測(cè)序結(jié)果是否含有SEQ ID NO:3所示的序列；

或者利用遺傳分析軟件，分析比較待檢樣本ITS2序列與大花龍膽的ITS2序列差異，判定待檢樣本是否為大花龍膽。

進(jìn)一步地，所述遺傳分析軟件為Mega軟件。

本發(fā)明還提供了SEQ ID NO:1-2所示的引物對(duì)在鑒別大花龍膽與混偽品中的用途。

其中，所述大花龍膽混偽品為高山龍膽、岷縣龍膽、高冷龍膽、滇龍膽草、秦艽和/或麻花艽。

大花龍膽混偽品：包括大花龍膽的易混淆品及偽品。

本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，大花龍膽的ITS2序列，可以用于鑒別大花龍膽及其混偽品，如岷縣龍膽、高山龍膽、高冷龍膽、滇龍膽等，本發(fā)明利用ITS2序列鑒別大花龍膽的方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠，為大花龍膽的資源保護(hù)、物種多樣性研究提供依據(jù)，也為規(guī)范藥材市場(chǎng)提供了保障。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說(shuō)明

圖1為大花龍膽四個(gè)居群的地理坐標(biāo)圖

圖2為大花龍膽原植物圖片圖

圖3為大花龍膽生境圖

圖4為高山龍膽與岷縣龍膽五個(gè)居群的地理坐標(biāo)圖

圖5為居群GSW中高山龍膽原植物圖

圖6為居群GSY中高山龍膽原植物圖

圖7為居群MXH中岷縣龍膽原植物圖

圖8為居群MXR中岷縣龍膽原植物圖

圖9為居群MXB中岷縣龍膽原植物圖

圖10為岷縣龍膽DNA(左)、高山龍膽DNA(中)及大花龍膽DNA(右)圖

圖11為不同退火溫度下樣品DHL1、MXR1的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果圖

圖12為居群MXB 15樣品的ITS2-PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增結(jié)果圖

圖13為基于ITS2序列構(gòu)建的58份大花龍膽樣品的NJ系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)圖

圖14為基于ITS2序列構(gòu)建的高山龍膽與岷縣龍膽NJ系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)圖

圖15為基于ITS2序列構(gòu)建的大花龍膽及其混偽品的NJ聚類(lèi)樹(shù)圖

圖16為基于ITS2序列構(gòu)建的大花龍膽及其混偽品的UPGMA聚類(lèi)樹(shù)圖

具體實(shí)施方式

下面以實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不局限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1本發(fā)明鑒別大花龍膽與混偽品的方法

1、材料來(lái)源、儀器與試劑

1.1材料來(lái)源

大花龍膽四個(gè)居群的植物形態(tài)外觀(guān)一致，均為“高5～7cm，蓮座叢葉發(fā)達(dá)，花多單生枝頂，花冠上部具藍(lán)灰色或棕灰色條紋和斑點(diǎn)”。各居群命名方式主要依據(jù)采樣地點(diǎn)而定。具體見(jiàn)表1。大花龍膽四個(gè)居群的地理坐標(biāo)見(jiàn)圖1。大花龍膽植物形態(tài)見(jiàn)圖2，生存環(huán)境見(jiàn)圖3。

本研究參考《中國(guó)高等植物》有關(guān)兩物種記載，結(jié)合野外調(diào)查結(jié)果，將“株高15～30cm，花1～8朵，花梗長(zhǎng)達(dá)4cm”的植物定種為岷縣龍膽，“株高3～10cm，花1～6朵，無(wú)花?；蚓叨袒ü！钡闹参锒ǚN為高山龍膽。高山龍膽兩個(gè)居群命名方式依據(jù)植物形態(tài)特征而定，岷縣龍膽三個(gè)居群依據(jù)采樣地點(diǎn)命名。具體見(jiàn)表1。高山龍膽與岷縣龍膽五個(gè)居群的地理坐標(biāo)見(jiàn)圖4。各居群中原植物形態(tài)見(jiàn)圖5～9。

1.2儀器與試劑

Tissuelyser-48全自動(dòng)樣品快速研磨儀(上海凈信科技)、單道移液器(Eppendorf，德國(guó))、DK-8D型電熱恒溫水槽(上海一恒科技有限公司)、5424R離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))、微量分光光度計(jì)(Healthcare Bio-Sciences AB)、JY300HE電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)、JY300HE電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)、T100^TMPCR儀(BIO-RAD，新加坡)、721BR08817凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國(guó))。

DP305植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)、瓊脂糖(SIGMA-ALDRICH)、2×Es TaqMasterMix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)、D2000DNA Maker(天根生化科技有限公司)。

2、實(shí)驗(yàn)方法

2.1DNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

取樣品葉片，提取DNA：葉片為高原上采集的新鮮葉片，用硅膠快速干燥后，放入-70℃低溫箱中保存后，備用。

提取樣品葉片DNA時(shí)采用全自動(dòng)樣品快速研磨儀代替人工研磨，使葉片細(xì)胞壁破碎完全，以釋放細(xì)胞內(nèi)含物。其余步驟按試劑盒要求進(jìn)行。

DNA質(zhì)量檢測(cè)：

①取2μL DNA樣品用微量分光光度計(jì)測(cè)定其在260nm和280nm處的OD值及DNA濃度。

②取5μLDNA樣品與1μL 6×Loading Buffer混合均勻，在1％瓊脂糖凝膠上于120V 220MA條件下電泳20min檢測(cè)DNA質(zhì)量。

2.2引物設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)正向引物ITS2F(SEQ ID NO:1)：

5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’

反向引物ITS3R(SEQ ID NO:2)：

5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’，

均由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

2.3PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序

反應(yīng)體系設(shè)定為：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，正向和反向引物(2.5μmol/L)各1.0μL，根據(jù)模板濃度不同DNA用量在1.0～3.0μL之間，其余用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足體系至25μL。

PCR擴(kuò)增程序：94℃，變性5min；94℃，變性30s，最佳退火溫度下退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

擴(kuò)增產(chǎn)物保存于-20℃冰箱。

2.4引物最佳退火溫度的考察

調(diào)整退火溫度，將退火溫度設(shè)定在48℃～58℃之間，PCR儀自動(dòng)生成A＝58℃、B＝57.2℃、C＝56℃、D＝54.1℃、E＝51.7℃、F＝49.9℃、G＝48.7℃、H＝48℃共8個(gè)溫度梯度，根據(jù)不同溫度下PCR產(chǎn)物的電泳圖譜，挑選出ITS2引物的最優(yōu)退火溫度。

2.5PCR產(chǎn)物的檢測(cè)

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μL，采用最佳瓊脂糖濃度2.0％，電泳45min，凝膠中含4％的Goldview核酸染料，電極緩沖液為1×TAE，電壓不超過(guò)5V/cm，以D2000DNA Maker作為相對(duì)分子質(zhì)量，待電泳結(jié)束、沖洗干凈后在美國(guó)BIO-RAD生產(chǎn)的721BR08817凝膠成像系統(tǒng)上觀(guān)察記錄，保存圖像。

2.6PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA片段由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序完成并應(yīng)用Contig Express軟件對(duì)序列進(jìn)行校對(duì)拼接，獲得ITS2序列。

使用Clustal W(Version2.1)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得序列進(jìn)行同源性比對(duì)。利用MEGA(Version5.05)軟件尋找SNP位點(diǎn)，運(yùn)用K2P(Kimura 2-Parameter)模型計(jì)算各樣本之間的種內(nèi)遺傳距離，采用鄰接法(Neighbor Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)。

3、結(jié)果分析

3.1DNA質(zhì)量檢測(cè)

微量分光光度計(jì)檢測(cè)樣品DNA純度結(jié)果顯示，樣品中提取的DNA在260nm和280nm下光密度比值均在1.7～1.9之間，純度較高。

微量分光光度計(jì)檢測(cè)所有樣品DNA濃度均在18.5ng/μL～78.5ng/μL之間，用TE緩沖液稀釋DNA濃度至20ng/μL，放于-20℃冰箱中備用。

采用1％瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA質(zhì)量，結(jié)果如圖10。

可見(jiàn)，所有樣品的DNA條帶完整、明亮、清晰、整齊、無(wú)明顯的拖尾現(xiàn)象、基本沒(méi)有降解，所提DNA質(zhì)量符合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。3.2最佳退火溫度的考察

采用樣品DHL1、MXR1對(duì)PCR反應(yīng)的最佳退火溫度進(jìn)行考察，PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果如圖11，A＝58℃、B＝57.2℃、C＝56℃、D＝54.1℃、E＝51.7℃、F＝49.9℃、G＝48.7℃、H＝48℃，樣品DHL1在B、C、D溫度下，條帶更為明亮。樣品MXR1在F退火溫度下無(wú)擴(kuò)增條帶，在A(yíng)、B、D、H退火溫度下擴(kuò)增的條帶清晰明亮度不濟(jì)在C、H退火溫度下擴(kuò)增的條帶清晰。綜合樣品DHL1和MXR1的PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果，將C＝56℃作為ITS2分子標(biāo)記的最佳退火溫度。

3.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

在2.0％的瓊脂糖凝膠濃度下，檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果以居群MXB中15個(gè)樣品的ITS2擴(kuò)增圖譜為例說(shuō)明，具體見(jiàn)圖12。居群MXB中15個(gè)樣品擴(kuò)增的ITS2片段大小約500bp，擴(kuò)增條帶特整齊、清晰、明亮、特異性單一，符合ITS2分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)要求。

3.4ITS2序列測(cè)定結(jié)果

3.4.1大花龍膽居群內(nèi)的ITS2序列結(jié)果

對(duì)大花龍膽四個(gè)居群58個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，應(yīng)用Contig Express軟件對(duì)序列進(jìn)行校對(duì)拼接，獲得ITS2序列。

對(duì)ITS2序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示其相似性達(dá)99.99％。ITS2序列長(zhǎng)度為464～477bp，平均長(zhǎng)度為468.4bp，個(gè)體間存在長(zhǎng)度多態(tài)性；序列GC量為55.8％～56.0％，平均達(dá)55.9％，基本無(wú)差異。

所有大花龍膽樣品的ITS2中均包含下述序列：(SEQ ID NO:3)

ATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCC

CGAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTC

GCCCCCCCAACACCGTGCATGAATTCATGCCGGTCGTCGGAGGGGCGGAT

ATTGGCTTCCCGTGCTTCGGTGCGGCTGGCCTAAATTCAAGTCCCTTGCG

ACGGACACGACGACAAGTGGTGGTTGAATTACTCAACTAAGGTGCTGTCG

CGCGTTGACCCGTCGGATGAGGAGACTTCTTTGACCCTAACGCATGTGTC

GTCACGACGTATGCCACGACCGCGACCCCAGGTCAGGCGGGATTACCCGC

TGAGTTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATTCC

CCTAGTAACGGCGAGCGAACCGGGAACAGCCCAAGCTTAAAATCAGTCGA

CTTCGTCGTCTGAATT

采用鄰接法(Neighbor Joining，NJ)對(duì)所有大花龍膽樣品構(gòu)建系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)，結(jié)果顯示所有樣品聚成一類(lèi)(圖13)。

結(jié)果表明，本發(fā)明SEQ ID NO:1-2所示的引物對(duì)，擴(kuò)增的大花龍膽ITS2序列高度一致，對(duì)不同環(huán)境、地理分布的大花龍膽居群均能擴(kuò)增出同樣的SEQ ID NO:3所示序列。

3.4.2高山龍膽與岷縣龍膽的ITS2序列

對(duì)高山龍膽2個(gè)居群共27個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，應(yīng)用Contig Express軟件對(duì)序列進(jìn)行校對(duì)拼接，獲得ITS2序列。通過(guò)MEGA(Version6.06)中Clustal W程序?qū)π蛄羞M(jìn)行同源性匹配，并尋找序列中的SNP位點(diǎn)。ITS2片段長(zhǎng)度為376bp，其中保守位點(diǎn)121處，變異位點(diǎn)277處，信息位點(diǎn)255處，GC含量基本無(wú)差異，在59.2％～59.4％之間，平均為59.3％。采用DNAsp5.10.01軟件對(duì)遺傳多樣性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GSW居群內(nèi)的遺傳多樣性為0.3528，GSY居群內(nèi)的遺傳多樣性為0.2839，兩個(gè)居群間的核苷酸多態(tài)性為0.3738。

對(duì)岷縣龍膽3個(gè)居群45個(gè)樣品的ITS2序列進(jìn)行同源比對(duì)，結(jié)果顯示岷縣龍膽45個(gè)個(gè)體的ITS2序列長(zhǎng)度為339bp，保守位點(diǎn)92個(gè)，變異位點(diǎn)261個(gè)，信息位點(diǎn)247個(gè)，GC含量為57.7％～58.3％，平均為57.9％。DNAsp5.10.01分析顯示，MXB居群內(nèi)的核苷酸多態(tài)性最低，為0.0023，MXR居群內(nèi)的核苷酸多態(tài)性最高，為0.2993，MXH居群內(nèi)的核苷酸多樣性為0.2314，3個(gè)居群間的核苷酸多態(tài)性為0.3068。

運(yùn)用MEGA(Version6.06)軟件中的K2P(Kimura 2-Parameter)模型計(jì)算高山龍膽與岷縣龍膽72份樣本ITS2序列之間的遺傳距離。結(jié)果顯示高山龍膽與岷縣龍膽種間及同種不同居群間遺傳距離均為0.0000～0.9984。

采用鄰接法(Neighbor Joining，NJ)對(duì)高山龍膽與岷縣龍膽72份樣品的ITS2序列構(gòu)建系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)，見(jiàn)圖14。

結(jié)果顯示，NJ樹(shù)主要分為兩支，而每支上均有高山龍膽、岷縣龍膽(GSW、GSY、MXH、MXR四個(gè)居群)的不同個(gè)體，僅有MXB居群的15個(gè)個(gè)體只在一個(gè)分支上。

說(shuō)明高山龍膽、岷縣龍膽二者存在不同居群間個(gè)體的交叉，通過(guò)本發(fā)明的IST2序列無(wú)法區(qū)分高山龍膽與岷縣龍膽。

3.4.3大花龍膽與其混偽品之間親緣關(guān)系的ITS2分析

大花龍膽五個(gè)居群所有樣品的ITS2序列相同，故大花龍膽的ITS2序列命名為G.szechenyii。

由于高山龍膽與岷縣龍膽的ITS2序列分別有兩種排列形式，故將高山龍膽與岷縣龍膽的兩種ITS2序列，分別命名為G.algida-Ⅰ、G.algida-Ⅱ、G.purdomii-Ⅰ、G.purdomii-Ⅱ。

粗根龍膽Gentianacallistantha Diels et Gilg：《中國(guó)高等植物》(第九卷)已經(jīng)依據(jù)植物形態(tài)將其正名為大花龍膽，即將粗根龍膽與大花龍膽兩品種合并為一個(gè)種。

3.4.3.1遺傳距離分析

從GenBANK數(shù)據(jù)庫(kù)中下載已有高山龍膽G.algida Pall.的ITS2序列及大花龍膽常見(jiàn)混偽品高冷龍膽Gentiana frigidHaenke、滇龍膽草GentianarigescensFranch.exHemsl.、秦艽Gentianamacrophylla Pall.、麻花艽Gentianastraminea Maxim.的ITS2序列，物種信息見(jiàn)表2。

表2從GenBANK數(shù)據(jù)庫(kù)中下載物種的信息表

將測(cè)定所得的大花龍膽、高山龍膽、岷縣龍膽的ITS2序列與從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)取的大花龍膽易混品種的ITS2序列一起，通過(guò)MEGA6.06構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。選取龍膽科大鐘花屬大鐘花Megacodonstylophorus(C.B.Clarke))H.Smith，龍膽科花錨屬橢圓葉花錨HaleniaellipticaD.Don作為外類(lèi)群。

通過(guò)MEGA(Version6.06)對(duì)所有序列進(jìn)行同源比對(duì)，同源序列中總序列長(zhǎng)度為221bp，保守序列143處，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)43處，單變異位點(diǎn)32處，變異位點(diǎn)共75處，變異位點(diǎn)占總位點(diǎn)的33.9％。GC含量在56.6％～63.2％之間，平均為59.3％。在K2P(Kimura2-Parameter)模型下建立遺傳距離矩陣，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可見(jiàn)，大花龍膽與其它品種的遺傳距離為0.0094～0.2608，種間變異明顯，而大花龍膽居群之間序列穩(wěn)定。

而高山龍膽-Ⅰ與岷縣龍膽-Ⅰ兩種間的遺傳距離；高山龍膽-Ⅱ、岷縣龍膽-Ⅱ與高冷龍膽三者的遺傳距離最小，均為0，無(wú)法進(jìn)行區(qū)分。

因此，基于IST2序列的遺傳距離分析法可以用于鑒別大花龍膽與其它易混品。

3.4.3.2聚類(lèi)分析：

采用鄰接法(Neighbor joining，NJ)及非加權(quán)組平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)對(duì)所有物種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，聚類(lèi)時(shí)以Bootstrap做1000次可信度分析，結(jié)果見(jiàn)圖15、16。

通過(guò)NJ法、UPGMA法對(duì)大花龍膽及易混品種構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以發(fā)現(xiàn)，聚類(lèi)主要分為五支，第一支由龍膽屬高山龍膽組的高山龍膽-Ⅰ、高山龍膽-Ⅱ、岷縣龍膽-Ⅰ、岷縣龍膽-Ⅱ、高山龍膽、高冷龍膽組成。第二支由龍膽屬多枝組滇龍膽草自成一支。第三支由龍膽屬多枝組大花龍膽與粗根龍膽組成，大花龍膽與粗根龍膽的遺傳距離較近，為0.0094，這與《中國(guó)高等植物》依據(jù)植物形態(tài)將大花龍膽與粗根龍膽兩品種合并為一個(gè)種的結(jié)果相一致。第四支由龍膽屬秦艽組中的秦艽和麻花艽組成。第五支由龍膽科大鐘花屬大鐘花和花錨屬橢圓葉花錨組成，所有龍膽屬品種與花錨屬橢圓葉花錨均距離較遠(yuǎn)。

NJ與UPGMA聚類(lèi)結(jié)果基本一致，與傳統(tǒng)經(jīng)典分類(lèi)中的品種親緣關(guān)系呈現(xiàn)一致性，本發(fā)明的IST2序列，可以區(qū)分物種是否為大花龍膽，但無(wú)法將高山龍膽、岷縣龍膽與高冷龍膽三者區(qū)分開(kāi)。

因此，SEQ ID NO:1-2所示的引物對(duì)擴(kuò)增的IST2序列，可以區(qū)分大花龍膽及其混偽品。

綜上，本發(fā)明SEQ ID NO:1-2所示的引物對(duì)，可以準(zhǔn)確鑒別大花龍膽真?zhèn)?，且操作?jiǎn)單、準(zhǔn)確可靠，為規(guī)范藥材市場(chǎng)提供了保障，應(yīng)用前景良好。