THERAMUTEIN調(diào)節(jié)劑的制作方法

文檔序號：12249517閱讀：508來源：國知局

發(fā)明背景

患者中耐藥性的進行性發(fā)展為使用許多類型藥物長期治療的標志，尤其是在癌癥和感染性疾病的治療領域中。已經(jīng)鑒定了介導某些類型的耐藥性現(xiàn)象的分子機制，而在其它情況中，獲得的以及重新形成的耐受性的機制目前仍然未知。

最初認為在癌癥療法領域中相關的誘導的(獲得的)耐藥性的一種機制包括稱作P-糖蛋白(P-gp)的蛋白質(zhì)表達增加。P-gp位于細胞膜中并且起藥物流出泵的作用。該蛋白質(zhì)能夠從細胞中泵出毒性化學活性劑，包括許多類型的抗癌藥。因此，P-糖蛋白的增量調(diào)節(jié)通常產(chǎn)生對多種藥物的耐藥性。P-糖蛋白在腫瘤細胞中增量調(diào)節(jié)可以代表一種防御機制，該機制在哺乳動物細胞中發(fā)展以便防止受到毒性化學活性劑損害。目前已經(jīng)鑒定了具有與P-gp類似的功能的其它相關耐藥性蛋白質(zhì)，包括多藥物-抗性-相關蛋白家族成員，諸如MRP1和ABCG2。在任何情況下，在研發(fā)對指定靶蛋白具有特異性且毒性較低的化合物時，P-糖蛋白和相關ATP-結合彈夾(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白在臨床顯著性耐藥性中的重要性已經(jīng)下降。

另一種可能的獲得性耐藥的分子機制在于可選的信號途徑導致持續(xù)的細胞存活和代謝，即使原始藥物仍然對其靶標有效。此外，藥物胞內(nèi)代謝的改變也可以導致治療功效喪失。此外，可以發(fā)生基因表達和基因擴增結果的改變，從而導致指定靶蛋白的表達增加或減少，并且通常需要增加藥物劑量以便維持相同作用(Adcock和Lane,2003)。

突變誘導的耐藥性通常為感染性疾病領域中出現(xiàn)的情況。例如，已經(jīng)研發(fā)了幾種抑制在人免疫缺陷(HIV)病毒基因組中編碼的病毒逆轉(zhuǎn)錄酶或病毒蛋白酶的藥物。在文獻中充分確立了使用例如逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑反復治療HIV-感染的AIDS患者最終產(chǎn)生了病毒突變體形式，它們具有因已經(jīng)在編碼逆轉(zhuǎn)錄酶的基因中出現(xiàn)的突變而導致的對藥物的敏感性降低，所述的突變賦予所述酶的突變體形式受藥物的影響降低。

考慮到錯誤被引入HIV基因組的比例，在HIV治療過程中耐藥性的出現(xiàn)并不令人意外。已知HIV逆轉(zhuǎn)錄酶特別具有錯誤趨向性，其中正向突變率約為3.4x 10^-5種突變/堿基對/復制循環(huán)(Mansky等,J.Virol.69：5087-94(1995))。然而，在哺乳動物細胞中編碼的內(nèi)源性基因的類似突變率低一個數(shù)量級以上。

新的證據(jù)表明耐藥性還可能因涉及編碼藥物靶標的基因的突變結果產(chǎn)生(Gorre等,Science,2001；PCT/US02/18729)。在這種情況中，使患者接觸具體的治療物質(zhì)，諸如靶向特異性所關注的蛋白質(zhì)(POI或"靶"蛋白)的指定癌癥藥物后，隱含在編碼為治療物質(zhì)靶標的蛋白質(zhì)的基因中出現(xiàn)的突變的一組細胞的過度生長。目前還不了解該細胞群的過度生長是否因已經(jīng)隱含產(chǎn)生藥物抗性的POI的突變的患者的小百分比的預先存在的細胞所致，或這類突變是否在動物或人接觸能夠活化或抑制所述POI的治療劑過程中或之后重新產(chǎn)生。任一情況中，這類突變結果均可以產(chǎn)生突變的蛋白(下文定義為theramutein)，它受所述治療物質(zhì)的影響程度較低或可能完全不受影響。

慢性髓細胞性白血病(CML)的特征在于在該病穩(wěn)定或慢性期過程中保持分化能力的骨髓先祖(progenitor)過度增殖。多線證據(jù)已經(jīng)確立了作為某些形式的CML中的致病性癌基因的Abl酪氨酸激酶的失調(diào)。這種失調(diào)通常與稱作費城染色體(Ph)的染色體易位相關，導致由與Abelson酪氨酸激酶融合的BCR基因產(chǎn)物組成的融合蛋白表達，由此形成具有酪氨酸激酶活性的p210^Bcr-Abl。相關的融合蛋白稱作p190^Bcr-Abl，其由BCR基因中的不同斷點產(chǎn)生并且已經(jīng)證實出現(xiàn)在具有費城染色體陽性(Ph+)的急性成淋巴細胞性白血病(ALL)的患者中(Melo,1994；Ravandi等,1999)。轉(zhuǎn)化看起來因多信號途徑，包括那些涉及RAS、MYC和JUN的途徑活化所致。甲磺酸伊馬替尼(“STI-571”或)為靶向Abl的激酶結構域的ATP結合位點的2-苯氨基嘧啶(Druker等,NEJM 2001,p.1038)。隨后還通過其它方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了血小板衍生的生長因子(PDGF)β受體的抑制劑和Kit酪氨酸激酶，其中后者涉及胃腸道間質(zhì)瘤的發(fā)生(參見下文)。

直到近期為止，尚未觀察到在使用指定內(nèi)源性細胞蛋白的特異性抑制劑治療的過程中，其相應的內(nèi)源性基因中的突變可以導致蛋白質(zhì)不同的表達，所述蛋白質(zhì)變體的細胞功能耐受所述抑制劑。Charles Sawyers和同事所做的工作(Gorre等,Science 293：876-80(2001)；PCT/US02/18729)首次證實了使用能夠抑制p210^Bcr-Abl酪氨酸激酶的藥物(即STI-571)治療患者后，在編碼產(chǎn)生p210^Bcr-Abl癌的含有Abelson酪氨酸激酶結構域的靶蛋白的基因中隱含突變的所述患者中可能出現(xiàn)具有臨床意義的細胞群。各種這類突變產(chǎn)生p210^Bcr^-Abl的突變體形式，它們對Gleevec治療的反應性低于產(chǎn)生最初癌癥的形式。值得注意的是，出現(xiàn)的突變對突變蛋白賦予了對蛋白激酶抑制劑藥物作用的相對抗性，同時維持了一定程度的突變蛋白激酶的原始底物特異性。在Gorre等的工作前，本領域技術人員一般認為可以在接觸抑制Abelson蛋白激酶的化合物，諸如STI-571的患者中觀察到的抗性類型可能因上述藥物抗性的其它機制中的一種或多種或由某些其它尚不了解的機制導致，但在任何情況下，所述的抗性均可以涉及不同于藥物靶標POI的靶標(蛋白質(zhì)或其它)。

因此，治療臨床相關的還為現(xiàn)存療法靶標的蛋白質(zhì)突變體形式可能極為有用。這類突變蛋白(如下文定義的theramuteins)正在被公認和理解為復發(fā)性癌癥中的重要靶標，并且還在其它疾病中變得具有重要性。存在對治療劑的需求，這類治療劑對可能在一般有效藥物療法之前、過程中或之后產(chǎn)生的細胞蛋白的這類藥物抗性變體形式具有活性。本發(fā)明的關鍵目的在于提供可以用作用于克服在內(nèi)源性出現(xiàn)的蛋白質(zhì)中的突變-誘導的耐藥性的可能治療劑的化合物。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及為內(nèi)源性蛋白質(zhì)的變體形式的抑制劑或活化劑的活性劑以及鑒定這類變體的新方法。特別關注的是由已經(jīng)突變的基因編碼的內(nèi)源性蛋白質(zhì)變體的抑制劑和活化劑，所述的變體通常在接觸已知為相應未突變內(nèi)源性蛋白質(zhì)的抑制劑或活化劑的化學活性劑后產(chǎn)生或至少在已經(jīng)產(chǎn)生后首先得到鑒定。這類蛋白質(zhì)變體(突變蛋白)在本文中稱作"theramuteins"，它們可以自發(fā)在生物體內(nèi)出現(xiàn)(并且在某些情況中預先存在突變)或所述的突變體可以作為使用當能夠抑制所述theramutein的未突變形式(本文稱作“prototheramutein”)的指定化學活性劑治療生物體時產(chǎn)生的選擇壓力的結果產(chǎn)生?？梢岳斫庠谀承┣闆r中，prototheramutein可以為POI的“野生型"形式(例如因失調(diào)產(chǎn)生疾病的蛋白質(zhì))。在其它情況中，prototheramutein為引起疾病的“野生型”蛋白質(zhì)的變體，它已經(jīng)突變且由此促使作為所述在先突變結果的患病狀態(tài)發(fā)生。Prototheramutein的后一種類型的一個實例為P210^BCR-ABL癌蛋白，并且在315位上隱含蘇氨酸(T)到異亮氨酸(I)突變的這種蛋白質(zhì)的突變體形式稱作P210^{BCR-ABL-T315I}，并且為theramutein的一個實例。本文所用的命名“P210^BCR-ABL“與術語“p210^Bcr-Abl”、“野生型Bcr-Abl蛋白質(zhì)”等為同義詞。

Theramuteins為一類罕有的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，它們隱含了賦予所述蛋白質(zhì)對藥物的抗性的突變，已知所述的藥物以治療有效方式抑制或活化它們的未突變對應體。目前已知編碼少數(shù)幾種這類蛋白質(zhì)的內(nèi)源性基因在某些情況下表現(xiàn)出這類突變。本發(fā)明涉及抑制Abelson酪氨酸激酶蛋白質(zhì)的某些耐藥性突變體(theramuteins)的組合物，所述的Abelson酪氨酸激酶蛋白質(zhì)在文獻中最初稱作P210-Bcr-Abl，它涉及慢性髓細胞性白血病的發(fā)生。本發(fā)明還涉及鑒定抑制或活化任意theramutein的一般方法。

本發(fā)明的方法特別涉及鑒定theramuteins的特異性抑制劑或特異性活化劑的方法。術語“特異性”在上下文中術語“抑制劑”或“活化劑”中的應用(參見下文中的定義)指的是所述的抑制劑或活化劑結合theramutein并且抑制或活化theramutein的細胞功能，但不結合和活化或抑制細胞中的各種其它蛋白質(zhì)或非-蛋白質(zhì)靶標。本領域技術人員充分了解，在醫(yī)學文獻中討論蛋白質(zhì)抑制劑或活化劑的作用時，在特異性抑制劑或特異性活化劑的概念和靶蛋白“特異性”的相關概念方面存在一定程度的可變性。因此，就本發(fā)明的目的而言，物質(zhì)為指定theramutein的特異性抑制劑或特異性活化劑，條件是所述物質(zhì)能夠以指定濃度抑制或活化所述theramutein，使得相應的表型反應(phenoresponse)以適當方式得到調(diào)節(jié)，而在相同指定濃度下對相應對照細胞的表型反應不具有可感覺到的作用，所述的相應對照細胞基本上不表達theramutein或其相應的prototheramutein。

在某些實施方案中，物質(zhì)可以為prototheramutein和theramutein的調(diào)節(jié)劑。在其它實施方案中，除為prototheramutein和theramutein的調(diào)節(jié)劑外，物質(zhì)還可以調(diào)節(jié)具有相似功能的蛋白質(zhì)的活性。如上所述，除抑制p210^{Bcr Abl}酪氨酸激酶外，甲磺酸伊馬替尼還能夠抑制在某些胃腸道間質(zhì)瘤中超表達的c-kit癌基因產(chǎn)物(也為酪氨酸激酶)以及在某些慢性骨髓單核細胞性白血病(CMML)中表達的PDGFβ受體(也為酪氨酸激酶)。這類化合物有時稱作“適度特異性”抑制劑。

本發(fā)明還提供了可以用于鑒定活化或抑制theramutein的物質(zhì)的一般方法，所述的物質(zhì)將theramutein活化或抑制到相同程度、并且優(yōu)選到甚至大于能夠抑制該蛋白質(zhì)的相應"野生型"形式的已知藥物物質(zhì)的程度(然而，本領域技術人員充分了解這類蛋白質(zhì)的所述"野生型"形式已經(jīng)在產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)參與的相應疾病的過程中突變)。

在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了具有通式I的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制劑：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

各個R¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR¹¹、-(CH₂)_pC(O)(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pC(O)N(R¹²)(R¹³)、-(CH₂)_pC(O)O(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pN(R¹¹)C(O)R¹¹、-(CH₂)_pN(R¹²)(R¹³)、-N(R¹¹)SO₂R¹¹、-OC(O)N(R¹²)(R¹³)、-SO₂N(R¹²)(R¹³)、鹵素、芳基和雜環(huán)組成的組，并且另外或可選地，相鄰環(huán)原子上的兩個R¹基團形成含有0-3個雜原子的5-或6-元稠合環(huán)；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

各個R¹²和R¹³獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；或R¹²和R¹³可以與它們所連接的氮一起形成可以任選地含有一個額外雜原子的5-至7-元環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R²選自-CR²¹_a-、-NR²²_b-和-(C＝R²³)-；

各個R²¹獨立地選自H、鹵素、-NH₂、-N(H)(C_1-3烷基)、-N(C_1-3烷基)₂、-O-(C_1-3烷基)、OH和C_1-3烷基；

各個R²²獨立地選自H和C_1-3烷基；

R²³選自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

R³選自-CR³¹_c-、-NR³²_d-和-(C＝R³³)-；

各個R³¹基團選自H、鹵素、-NH₂、-N(H)(R⁰)、-N(R⁰)₂、-O-R⁰、OH和C_1-3烷基；

各個R³²基團選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳基和雜環(huán)；

R³³選自O、S、N-R³⁴和N-OR⁰；

R³⁴選自H、NO₂、CN、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁴選自-CR⁴¹_e-、-NR⁴²_f-、-(C＝R⁴³)-和-O-；

各個R⁴¹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

各個R⁴²基團選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳基和雜環(huán)；

各個R⁴³各自選自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

條件是當R²為-NR²²_b-且R⁴為-NR⁴²_f-時，R³不為-NR³²_d-；且R³和R⁴不同時分別選自-(C＝R³³)-和-(C＝R⁴³)-；

R⁵選自-Y-R⁶和-Z-R⁷；

Y選自化學鍵、O、NR⁰；

R⁶選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

Z為帶有1-4個碳原子并且任選地被鹵素、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、C(O)N(R⁰)₂、CN、CF₃、N(R⁰)₂、NO₂和OR⁰中的一個或多個取代的烴鏈；

R⁷為H或選自芳基和雜環(huán)；

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

a為1或2；

b為0或1；

c為1或2；

d為0或1；

e為1或2；且

f為0或1。

本發(fā)明提供了治療癌癥和其它疾病的基礎新方式，其中無論通過何種機制，使用現(xiàn)存的藥物化合物治療后均跟隨可鑒定的(臨床顯著的)theramutein-介導的藥物抗性，通過提供在theramuteins產(chǎn)生和照此鑒定時(Wakai等,2004報導了一個實例，其中theramutein可以在持續(xù)治療方案過程中產(chǎn)生)或在表達theramutein的細胞的臨床顯著性群體過度生長前預先給予備選藥物來進行。此外，如果對特定疾病的藥物治療在表達藥物靶向的蛋白質(zhì)的某種theramutein的個體亞群中有效性較低，那么本發(fā)明能夠通過提供有效針對所述theramutein的備選藥物物質(zhì)來適應那些受試者的治療。

1.本發(fā)明提供了測定化學活性劑作為細胞中theramutein的調(diào)節(jié)劑是否至少與作為已知的相應prototheramutein調(diào)節(jié)劑的物質(zhì)同樣有效的方法。該方法的一個實施方案包括使表達prototheramutein并且能夠表現(xiàn)出反應性表型特征(與細胞中prototheramutein的功能相關)的對照細胞與已知的prototheramutein調(diào)節(jié)劑接觸，使表達theramutein并且也能夠表現(xiàn)出反應性表型特征(與細胞中theramutein的功能相關)的測試細胞與化學活性劑接觸，并且比較測試細胞的反應與處理的對照細胞的反應；以便確定該化學活性劑作為theramutein的調(diào)節(jié)劑至少與作為已知的prototheramutein調(diào)節(jié)劑的物質(zhì)同樣有效。在某些其它實施方案中，一種類型的對照細胞可能完全不表達prototheramutein。在其它實施方案中，對照細胞可以表達的prototheramutein的量與測試細胞表達的theramutein的量大體相同。在其它實施方案中，在某些條件下，對照細胞能夠表現(xiàn)出的反應性表型特征的程度與測試細胞大體相同。

2.本發(fā)明特別關注的Theramuteins為那些涉及調(diào)節(jié)功能的Theramuteins，諸如酶；蛋白激酶；酪氨酸激酶；受體酪氨酸激酶；絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶；雙向特異性蛋白激酶；蛋白酶；基質(zhì)金屬蛋白酶；磷酸酶；細胞周期控制蛋白；?？康鞍踪|(zhì)，諸如IRS家族成員；細胞表面受體；G-蛋白；離子通道；DNA-和RNA-結合蛋白；聚合酶等。不打算限止可以用于本發(fā)明的theramutein的類型。同時，已知三種theramuteins：BCR-ABL、c-Kit和EGFR。

3.可能與細胞中存在的theramutein(或prototheramutein)相關的任意反應性表型特征可以用于本方法，包括：例如生長或培養(yǎng)特性、theramutein底物的磷酸化狀態(tài)(或其它修飾)和任意類型的細胞的暫時特征，正如所定義和詳細討論的。

附圖說明

附圖1顯示了不同濃度的化合物2(C2)對未轉(zhuǎn)化的載體對照Ba/F3細胞(為IL-3依賴性)以及表達"野生型"p210^Bcr-Abl的Ba/F3細胞(命名為p210^Bcr-Abl-wt)和表達p210^Bcr^-Abl-T315I藥物抗性突變株的Ba/F3細胞的生長和存活率的作用。如本說明書中詳細描述的用自動化細胞計數(shù)器測定細胞計數(shù)和存活率。細胞計數(shù)由實心顏色條表示；細胞存活率由虛線條表示。注意STI-571有效抑制P210細胞系生長(灰色條)，而甚至在10μM濃度下也不能抑制T315I細胞系生長(白色條)。500nM C2在該劑量響應系列范圍內(nèi)表現(xiàn)出最大的特異性缺口。將10μM的STI-571與500nM的C2對T315I細胞系的作用進行比較(白色條)?？s寫：DMSO：二甲亞砜(用于藥物溶解的溶劑)。

附圖2顯示了不同濃度的化合物6(C6)對未轉(zhuǎn)化的載體對照Ba/F3細胞以及表達p210^{Bcr-Abl-T315I}藥物抗性突變株的Ba/F3細胞的生長和存活率的作用。所有其它詳細描述均如附圖1中所。

附圖3顯示了通過比較篩選中鑒定的不同化合物就其對表達prototheramutein和theramutein的細胞系中的作用而言得到的特異性缺口的不同測定結果。化合物3(C3)顯示了用于鑒定化合物的能力的最佳實例，該化合物對theramutein所施加的作用甚至大于其相應對prototheramutein的作用。(E組).A組：對照組DMSO治療；B：陰性異源特異性缺口；C：輕度陽性的異源特異性缺口；D：顯著陽性的同源特異性缺口；E：陽性異源特異性缺口。參見用于解釋的正文。A組：對照組DMSO治療；B：陰性異源特異性缺口；C：輕度陽性的異源特異性缺口；D：顯著陽性的同源特異性缺口；參見解釋部分。

附圖4顯示了用于自磷酸化活性檢測的重組P210Bcr-Abl野生型和T315I突變體激酶結構域的放射自顯影照片。將200ng蛋白質(zhì)預先與測試物質(zhì)在標準自磷酸化反應條件下一起溫育10分鐘，然后加入放射性標記的ATP并使反應在30℃下進行30分鐘，此后通過SDS-PAGE分離樣品。將凝膠進行銀染色，在真空中干燥并且接觸X-光片。注意在10μM STI 571對野生型P210Bcr-Abl有效的同時，它實際上在濃度甚至達100μM時對T315I激酶結構域無效。C2和C6為最佳的兩種鑒定的化合物，隨后是C5、C7和C4。所有這些化合物均測試顯陽性至一定程度。“P210細胞系”指的是表達p210^BCR-ABL-wt的細胞?！癟315I細胞系”指的是表達p210^BCR^-ABL-T315I的細胞。

附圖5表示本發(fā)明有代表性的化合物的化學結構。

附圖6表示本發(fā)明有代表性的化合物的化學結構。

附圖7表示本發(fā)明有代表性的化合物的化學結構。

附圖8表示本發(fā)明有代表性的化合物的化學結構。

附圖9表示本發(fā)明有代表性的化合物的化學結構。

附圖10表示本發(fā)明有代表性的化合物的化學結構。

附圖11表示本發(fā)明有代表性的化合物的化學結構。

附圖12表示本發(fā)明有代表性的化合物的化學結構。

附圖13表示本發(fā)明有代表性的化合物的化學結構。

發(fā)明詳述

本文所用的術語“鹵素(halo)”或“鹵素(halogen)”包括氟、氯、溴和碘。

本文所用的術語“烷基”關注的是帶有1-6個碳原子的取代和未被取代的直鏈和支鏈烷基。優(yōu)選的烷基包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基等。另外，烷基可以任選地被一個或多個選自鹵素、CN、CO₂R、C(O)R、C(O)NR₂、NR₂、環(huán)-氨基、NO₂和OR的取代基取代。

本文所用的術語“環(huán)烷基”關注的是取代和未被取代的環(huán)烷基。優(yōu)選的環(huán)烷基為那些含有3-7個碳原子的單環(huán)，并且包括環(huán)丙基、環(huán)戊基、環(huán)己基等。其它環(huán)烷基可以選自C₇-C₁₀雙環(huán)系或C₉-C₁₄三環(huán)系。另外，環(huán)烷基可以任選地被一個或多個選自鹵素、CN、CO₂R、C(O)R、C(O)NR₂、NR₂、環(huán)-氨基、NO₂和OR的取代基取代。

本文所用的術語“鏈烯基”關注的是取代和未被取代的直鏈和支鏈烯基團。優(yōu)選的鏈烯基為那些含有2-6個碳原子的鏈烯基。另外鏈烯基可以任選地被一個或多個選自鹵素、CN、CO₂R、C(O)R、C(O)NR₂、NR₂、環(huán)-氨基、NO₂和OR的取代基取代。

本文所用的術語“炔基”關注的是取代和未被取代的直鏈和支鏈炔基。優(yōu)選的炔基為那些含有2-6個碳原子的炔基。另外，炔基可以任選地被一個或多個選自鹵素、CN、CO₂R、C(O)R、C(O)NR₂、NR₂、環(huán)-氨基、NO₂和OR的取代基取代。

本文所用的術語“芳烷基”關注的是帶有芳族基團作為取代基的烷基，所述的芳族基團可以被取代和未被取代。芳烷基可以任選地在芳基上被一個或多個取代基取代，所述的取代基選自鹵素、CN、CF₃、NR₂、環(huán)-氨基、NO₂、OR、CF₃、-(CH₂)_xC(O)(CH₂)_yR、-(CH₂)_xC(O)N(R')(R")、-(CH₂)_xC(O)O(CH₂)_yR、-(CH₂)_xN(R')(R")、-N(R)SO₂R、-O(CH₂)_xC(O)N(R')(R")、-SO₂N(R')(R")、-(CH₂)_xN(R)-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_xN(R)-C(O)-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_xN(R)-C(O)-O-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_x-C(O)-N(R)-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_xC(O)N(R)-(CH₂)_y-R、-O-(CH₂)_x-C(O)-N(R)-(CH₂)_y-R、取代和未被取代的烷基、取代和未被取代的環(huán)烷基、取代和未被取代的芳烷基、取代和未被取代的鏈烯基、取代和未被取代的炔基、取代和未被取代的芳基和取代和未被取代的雜環(huán)，其中所述取代的烷基、取代的環(huán)烷基、取代的芳烷基、取代的鏈烯基、取代的炔基、取代的芳基和取代的雜環(huán)可以被鹵素、CN、CF₃、CO₂R、C(O)R、C(O)NR₂、NR₂、環(huán)-氨基、NO₂和OR中的一個或多個取代。

本文所用的術語“雜環(huán)基”或"雜環(huán)"關注的是帶有至少一個雜原子作為環(huán)成員的芳族和非-芳族環(huán)狀基團。優(yōu)選的雜環(huán)基為那些含有5或6個環(huán)原子的包括至少一個雜原子的雜環(huán)基，并且包括：環(huán)狀胺類，諸如嗎啉代、哌啶子基、吡咯烷并等；和環(huán)醚類，諸如四氫呋喃、四氫吡喃等。芳族雜環(huán)基，也稱作“雜芳基”關注的是可以包括1-3個雜原子的單-環(huán)雜-芳族基團，例如吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、噠嗪、嘧啶等。本文所用的術語雜芳基還包括帶有兩個或多個環(huán)的多環(huán)雜-芳族系統(tǒng)，其中的兩個原子為兩個相鄰的環(huán)共用(這些環(huán)是"稠合的")，其中環(huán)中的至少一個為雜芳基，例如其它環(huán)可以為環(huán)烷基、環(huán)烯基、芳基、雜環(huán)和/或雜芳基。多環(huán)雜芳族系統(tǒng)的實例包括喹啉、異喹啉、四氫異喹啉、喹喔啉、quinaxoline、苯并咪唑、苯并呋喃、嘌呤、咪唑并吡啶、苯并三唑等。另外，雜環(huán)基可以任選地被如下基團取代：鹵素、CN、CF₃、NR₂、環(huán)-氨基、NO₂、OR、CF₃、-(CH₂)_xC(O)(CH₂)_yR、-(CH₂)_xC(O)N(R')(R")、-(CH₂)_xC(O)O(CH₂)_yR、-(CH₂)_xN(R')(R")、-N(R)SO₂R、-O(CH₂)_xC(O)N(R')(R")、-SO₂N(R’)(R”)、-(CH₂)_xN(R)-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_xN(R)-C(O)-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_xN(R)-C(O)-O-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_x-C(O)-N(R)-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_xC(O)N(R)-(CH₂)_y-R、-O-(CH₂)_x-C(O)-N(R)-(CH₂)_y-R、取代和未被取代的烷基、取代和未被取代的環(huán)烷基、取代和未被取代的芳烷基、取代和未被取代的鏈烯基、取代和未被取代的炔基、取代和未被取代的芳基和取代和未被取代的雜環(huán)，其中所述取代的烷基、取代的環(huán)烷基、取代的芳烷基、取代的鏈烯基、取代的炔基、取代的芳基和取代的雜環(huán)可以被鹵素、CN、CF₃、CO₂R、C(O)R、C(O)NR₂、NR₂、環(huán)-氨基、NO₂和OR中的一個或多個取代。

本文所用的術語“芳基”或“芳族基團”關注的是單-環(huán)芳族基團(例如苯基、吡啶基、吡唑基等)和多環(huán)環(huán)系(萘基、喹啉等)。多環(huán)可以帶有兩個或多個環(huán)，其中的兩個原子為兩個相鄰的環(huán)共用(這些環(huán)是"稠合的")，其中環(huán)中的至少一個為芳族環(huán)，例如其它環(huán)可以為環(huán)烷基、環(huán)烯基、芳基、雜環(huán)和/或雜芳基。另外，芳基可以任選地被一個或多個取代基取代，所述的取代基選自鹵素、CN、CF₃、NR₂、環(huán)-氨基、NO₂、OR、CF₃、-(CH₂)_xC(O)(CH₂)_yR、-(CH₂)_xC(O)N(R')(R")、-(CH₂)_xC(O)O(CH₂)_yR、-(CH₂)_xN(R')(R")、-N(R)SO₂R、-O(CH₂)_xC(O)N(R')(R")、-SO₂N(R')(R")、-(CH₂)_xN(R)-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_xN(R)-C(O)-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_xN(R)-C(O)-O-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_x-C(O)-N(R)-(CH₂)_y-R、-(CH₂)_xC(O)N(R)-(CH₂)_y-R、-O-(CH₂)_x-C(O)-N(R)-(CH₂)_y-R、取代和未被取代的烷基、取代和未被取代的環(huán)烷基、取代和未被取代的芳烷基、取代和未被取代的鏈烯基、取代和未被取代的炔基、取代和未被取代的芳基和取代和未被取代的雜環(huán)，其中所述取代的烷基、取代的環(huán)烷基、取代的芳烷基、取代的鏈烯基、取代的炔基、取代的芳基和取代的雜環(huán)可以被鹵素、CN、CF₃、CO₂R、C(O)R、C(O)NR₂、NR₂、環(huán)-氨基、NO₂和OR中的一個或多個取代。

本文所用的術語"雜原子"，特別是作為環(huán)雜原子指的是N、O和S。

各個R獨立地選自H、取代和未被取代的烷基、取代和未被取代的環(huán)烷基、取代和未被取代的芳烷基、取代和未被取代的芳基和取代和未被取代的雜環(huán)，其中所述取代的烷基、取代的環(huán)烷基、取代的芳烷基、取代的芳基和取代的雜環(huán)可以被一個或多個鹵素、CN、CF₃、OH、CO₂H、NO₂、C_1-6烷基、-O-(C_1-6烷基)、-NH₂、-NH(C_1-6烷基)和-N(C_1-6烷基)₂取代。

各個R'和R"獨立地選自H或取代和未被取代的烷基、取代和未被取代的環(huán)烷基、取代和未被取代的芳烷基、取代和未被取代的芳基和取代和未被取代的雜環(huán)，其中所述取代的烷基、取代的環(huán)烷基、取代的芳烷基、取代的芳基和取代的雜環(huán)可以被一個或多個鹵素、CN、CF₃、OH、CO₂H、NO₂、C_1-6烷基、-O-(C_1-6烷基)、-NH₂、-NH(C_1-6烷基)和-N(C_1-6烷基)₂取代；或R'和R"可以與它們所連接的氮一起形成可以任選地含有至多三個額外雜原子的5-至7-元環(huán)。每個x和每個y獨立地選自0-4。

在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了具有通式I的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制劑：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R²選自-CR²¹_a-、-NR²²_b-和-(C＝R²³)-；

各個R²¹獨立地選自H、鹵素、-NH₂、-N(H)(C_1-3烷基)、-N(C_1-3烷基)₂、-O-(C_1-3烷基)、OH和C_1-3烷基；

各個R²²獨立地選自H和C_1-3烷基；

R²³選自-O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

R³選自-CR³¹_c-、-NR³²_d-和-(C＝R³³)-；

R³¹基團各自選自H、鹵素、-NH₂、-N(H)(R⁰)、-N(R⁰)₂、-O-R⁰、OH和C_1-3烷基；

R³²基團各自選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳基和雜環(huán)；

R³³選自O、S、N-R³⁴和N-OR⁰；

R³⁴選自H、NO₂、CN、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁴選自-CR⁴¹_e-、-NR⁴²_f-、-(C＝R⁴³)-和-O-；

各個R⁴¹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

各個R⁴²基團選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳基和雜環(huán)；

各個R⁴³選自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

條件是當R²為-NR²²_b-且R⁴為-NR⁴²_f-時，R³不為-NR³²_d-；且R³和R⁴不同時分別選自-(C＝R³³)-和-(C＝R⁴³)-；

R⁵選自-Y-R⁶和-Z-R⁷；

Y選自化學鍵、O、NR⁰；

R⁶選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁷為H或選自芳基和雜環(huán)；

R⁰各自獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

a為1或2；

b為0或1；

c為1或2；

d為0或1；

e為1或2；且

f為0或1。

本文所述的本發(fā)明中的重要組成部分和概念教導在于本發(fā)明化合物的R²和R³位置均非任意芳族或非-芳族環(huán)結構的成員。我們發(fā)現(xiàn)帶有R²和/或R³位置作為任意芳族或非-芳族環(huán)結構的成員的化合物無法有效地抑制T315I theramutein，而除具有其它優(yōu)選的活性基團外，在這些位置上缺乏這樣的環(huán)成分的本發(fā)明化合物為T315I theramutein的有效抑制劑。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，環(huán)A為芳族環(huán)。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，X¹或X²為N。在另一個優(yōu)選的實施方案中，X¹和X²均為N。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，環(huán)A為吡啶環(huán)或嘧啶環(huán)。在進一步優(yōu)選的實施方案中，環(huán)A選自如下提供的結構：

在一個優(yōu)選的實施方案中，如果R²或R⁴被分別選為-NR²²_b-或-NR⁴²-，那么R³¹不選自鹵素、-NH₂、-N(H)(R⁰)、-N(R⁰)₂、-O-R⁰或OH。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了具有通式I_a的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制劑：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

各個R²²獨立地選自H和C_1-3烷基；

R³選自-CR³¹_c-、-NR³²_d-,和-(C＝R³³)-；

各個R³¹基團選自H、鹵素、-NH₂、-N(H)(R⁰)、-N(R⁰)₂、-O-R⁰、OH和C_1-3烷基；

各個R³²基團選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳基和雜環(huán)；

R³³選自O、S、N-R³⁴和N-OR⁰；

R³⁴選自H、NO₂、CN、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁴選自-CR⁴¹_e-、-NR⁴²_f-、-(C＝R⁴³)-和-O-；

各個R⁴¹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

各個R⁴²基團選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳基和雜環(huán)；

各個R⁴³選自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

條件是當R⁴為-NR⁴²_f-時，R³不為-NR³²_d-；且R³和R⁴不同時分別選自-(C＝R³³)-和-(C＝R⁴³)-；

R⁵選自-Y-R⁶和-Z-R⁷；

Y選自化學鍵、O、N-R⁰；

R⁶選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁷為H或選自芳基和雜環(huán)；

R⁰各自獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

a為1或2；

b為0或1；

c為1或2；

d為0或1；

e為1或2；且

f為0或1。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了具有通式I_b的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制劑：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

R¹各自獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR¹¹、-(CH₂)_pC(O)(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pC(O)N(R¹²)(R¹³)、-(CH₂)_pC(O)O(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pN(R¹¹)C(O)R¹¹、-(CH₂)_pN(R¹²)(R¹³)、-N(R¹¹)SO₂R¹¹、-OC(O)N(R¹²)(R¹³)、-SO₂N(R¹²)(R¹³)、鹵素、芳基和雜環(huán)組成的組，并且另外或可選地，相鄰環(huán)原子上的兩個R¹基團形成含有0-3個雜原子的5-或6-元稠合環(huán)；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

各個R²²各自獨立地選自H和C_1-3烷基；

各個R³²基團選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳基和雜環(huán)；

R⁴選自-CR⁴¹_e-、-(C＝R⁴³)-和-O-；

R⁴¹各自選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

各個R⁴³選自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

R⁵選自-Y-R⁶和-Z-R⁷；

Y選自化學鍵、O、N-R⁰；

R⁶選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁷為H或選自芳基和雜環(huán)；

R⁰各自獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

a為1或2；

b為0或1；

c為1或2；

d為0或1；

e為1或2；且

f為0或1。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，選擇通式I的R²、R³和R⁴以便得到下列化學基團：

-N(R²²)-N＝C(R⁴¹)-

-N(R²²)-N(R³²)-C(＝O)-

-N(R²²)-N(R³²)-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-N(R²²)-C(R³¹)(R³¹)-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-N(R²²)-C(R³¹)(R³¹)-C(＝O)-

-N＝N-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-C(R²¹)＝C＝C(R⁴¹)-

-C(R²¹)＝C(R³¹)-C(＝O)-

-C(R²¹)＝C(R³¹)-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-C(R²¹)(R²¹)-C(R³¹)＝C(R⁴¹)-

-C(R²¹)(R²¹)-C(R³¹)(R³¹)-C(＝O)-

-C(R²¹)(R²¹)-C(R³¹)(R³¹)-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-C(R²¹)(R²¹)-N(R³²)-C(＝O)-

-C(R²¹)(R²¹)-N(R³²)-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-N(R²²)-C(＝O)-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-N(R²²)-C(＝O)-N(R⁴¹)-

-N(R²²)-C(＝O)-O-

-C(R²¹)(R²¹)-C(＝O)-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-C(R²¹)(R²¹)-C(＝O)-N(R⁴²)-

-N(R²²)-C(＝NR³⁴)-N(R⁴²)-

-C(＝O)-N(R³²)-N(R⁴²).

用于R²、R³和R⁴的特別優(yōu)選的化學基團包括：

-N(R²²)-N＝C(R⁴¹)-

-N(R²²)-N(R³²)-C(＝O)-

-N(R²²)-C(R³¹)(R³¹)-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-N(R²²)-C(R³¹)(R³¹)-C(＝O)-

-C(R²¹)(R²¹)-C(＝O)-C(R⁴¹)(R⁴¹)-

-C(R²¹)(R²¹)-C(＝O)-N(R⁴²)-

-N(R²²)-C(＝NR³⁴)-N(R⁴²)-

-C(＝O)-N(R³²)-N(R⁴²)。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，R⁶或R⁷為可以任選被取代的芳基。特別優(yōu)選的芳基包括取代或未被取代的苯基和吡啶基。在額外或備選的實施方案中，優(yōu)選取代基R²¹和R²²獨立地選自具有小的空間體積的基團并且優(yōu)選自H和CH₃，且更優(yōu)選H。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了具有通式II的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制劑：

其中

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R⁸選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)組成的組；

R⁹選自-Y-R⁶和-Z-R⁷；

Y選自化學鍵、O、N-R⁰；

R⁶選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁷為H或選自芳基和雜環(huán)；且

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了具有通式II_a的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制劑：

其中

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R⁸選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)組成的組；

X³為N、CH或C-R⁵⁰；

各個R⁵⁰獨立地選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR⁵¹、-(CH₂)_rC(O)(CH₂)_sR⁵¹、-(CH₂)_rC(O)N(R⁵²)(R⁵³)、-(CH₂)_rC(O)O(CH₂)_sR⁵¹、-(CH₂)_rN(R⁵¹)C(O)R⁵¹、-(CH₂)_rN(R⁵²)(R⁵³)、-N(R⁵¹)SO₂R⁵¹、-OC(O)N(R⁵²)(R⁵³)、-SO₂N(R⁵²)(R⁵³)、鹵素、芳基和雜環(huán)組成的組，并且另外或可選地，相鄰環(huán)原子上的兩個R⁵⁰基團形成含有0-3個雜原子的5-或6-元稠合環(huán)；

R⁵¹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁵²和R⁵³獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；或R⁵²和R⁵³可以與它們所連接的氮一起形成可以任選地含有一個額外雜原子的5-至7-元環(huán)；

r為0-4；

s為0-4；

m為0-4；且

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了具有通式II_b的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制劑：

其中：

R¹⁴選自H和F；

R⁸選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)組成的組；

X³為N、CH或C-R⁶⁰；

各個R⁶⁰獨立地選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR⁰、鹵素、芳基和雜環(huán)組成的組；

R⁶¹選自芳基和雜環(huán)；

Q選自化學鍵或具有式-O-、-(CH₂)_i-、-(CH₂)_iC(O)(CH₂)_j-、-(CH₂)_i-N(R⁶²)-(CH₂)_j-、-(CH₂)_iC(O)-N(R⁶²)-(CH₂)_j-、-(CH₂)_iC(O)O(CH₂)_j-、-(CH₂)_iN(R⁶²)C(O)-(CH₂)_j-、-(CH₂)_iOC(O)N(R⁶²)-(CH₂)_j-和-O-(CH₂)_i-C(O)N(R⁶²)-(CH₂)_j-的基團；

R⁶²選自芳基和雜環(huán)；

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

h為0-4；

i為0-4；且

j為0-4。

在通式II_b化合物的優(yōu)選實施方案中，R⁶⁰選自鹵素、CF₃和OH。

通式II、II_a或II_b的典型化合物包括下列結構：

在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了具有通式III的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制劑：

其中

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R¹⁰選自-Y'-R¹⁸；

Y'選自化學鍵、O、NR⁰-和帶有1-4個碳原子并且任選地被鹵素、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、C(O)N(R⁰)₂、CN、CF₃、N(R⁰)₂、NO₂和OR⁰中的一個或多個取代的烴鏈；

R¹⁸選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CF₃、芳基和雜環(huán)組成的組；且

各個R⁰獨立地選自H、烷基,環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了具有通式III_a的P210^{BCR-ABL-T315I}theramutein的抑制劑：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

X³為N、CH或C-R⁵⁰；

各個R⁵⁰獨立地選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR⁵¹、-(CH₂)_rC(O)(CH₂)_sR⁵¹、-(CH₂)_rC(O)N(R⁵²)(R⁵³)、-(CH₂)_rC(O)O(CH₂)_sR⁵¹、(CH₂)_rN(R⁵¹)C(O)R⁵¹、-(CH₂)_rN(R⁵²)(R⁵³)、-N(R⁵¹)SO₂R⁵¹、-OC(O)N(R⁵²)(R⁵³)、-SO₂N(R⁵²)(R⁵³)、鹵素、芳基和雜環(huán)組成的組，并且另外或可選地，相鄰環(huán)原子上的兩個R⁵⁰基團形成含有0-3個雜原子的5-或6-元稠合環(huán)；

R⁵¹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

r為0-4；

s為0-4；

m為0-4；且

各個R⁰各自獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

通式III或III_a的典型化合物包括下列結構：

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了具有通式IV的P210^{BCR-ABL-T315I} theramutein的抑制劑：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R²²選自H和C_1-3烷基；

R³⁴選自H、NO₂、CN、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁴⁴選自H、烷基、環(huán)烷基、-(C＝O)R⁰、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁴⁵選自-Y"-R¹⁹；

Y"選自化學鍵、O、NR⁰-和帶有1-4個碳原子并且任選被鹵素、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、C(O)N(R⁰)₂、CN、CF₃、N(R⁰)₂、NO₂和OR⁰中的一個或多個取代的烴鏈；

R¹⁹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CF₃、芳基和雜環(huán)組成的組；且

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

通式IV的典型化合物包括下列結構：

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了具有通式V的P210^{BCR-ABL-T315I} theramutein的抑制劑：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R²²選自H和C_1-3烷基；

R³⁴選自H、NO₂、CN、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁵⁵選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁵⁶選自-Y"-R¹⁹；

R¹⁹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CF₃、芳基和雜環(huán)組成的組；且

各個R⁰各自獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了具有通式V_a的P210^{BCR-ABL-T315I} theramutein的抑制劑：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R⁵⁵選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

X³為N或C-R⁵⁰；

R⁵¹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁵²和R⁵³各自獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；或R⁵²和R⁵³可以與它們所連接的氮一起形成可以任選地含有一個額外雜原子的5-至7-元環(huán)；

r為0-4；

s為0-4；

m為0-4；且

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

通式V或V_a的典型化合物包括下列結構：

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了具有通式VI的P210^{BCR-ABL-T315I} theramutein的抑制劑：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R⁵⁵選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁵⁶選自-Y"-R¹⁹；

R¹⁹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CF₃、芳基和雜環(huán)組成的組；且

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了具有通式VI_a的P210^{BCR-ABL-T315I} theramutein的抑制劑：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R⁵⁵選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

X³為N或C-R⁵⁰；

R⁵¹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

r為0-4；

s為0-4；

m為0-4；且

各個R⁰各自獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

通式VI或VI_a的典型化合物包括下列結構：

本文所用的每種表達方式的定義，例如烷基、m、n、R、R'等在任何結構中出現(xiàn)一次以上時，與其在同一結構中的其它處的定義無關。

就對結構I、I_a、I_b、II、II_a、II_b、III、III_a、IV、IV_a、V、V_a、VI和VI_a化合物的上述描述中的每一種而言，對術語鹵素、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基、雜環(huán)基或雜環(huán)的每次敘述獨立地選自本節(jié)開始部分中提供的這些術語的定義。

可以理解本文提供的化學結構包括如下隱含條件，即取代按照取代原子和取代基的允許價鍵進行并且取代產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物，例如，該化合物不會通過諸如重排、環(huán)化、消除等自發(fā)進行轉(zhuǎn)化。

當本發(fā)明的化合物中存在一個或多個手性中心時，本文所述的通式包括各異構體及其混合物(例如外消旋物等)。

當本發(fā)明的化合物中存在一個或多個雙鍵時，本文所述的通式包括順式-和反式-異構體。盡管本文描述了順式或反式(cis of trans)構型的化學結構(諸如，例如結構II、II_a、V、V_a、VI和VI_a)，兩種構型的含義是每種通式均包括。

在某些實施方案中，本發(fā)明的化合物可以以幾種互變異構體形式存在。因此，本文所述的化學結構包括所有可能的列舉的化合物的互變異構形式。

本發(fā)明的化合物一般由商購原料和公知化學技術制備?？梢匀缦潞铣杀景l(fā)明的實施方案。藥物或合成化學領域技術人員易于熟知實施如下所述的合成手段所必不可少的操作步驟和技術。

可以通過在Gineinah等的p.562(Arch.Pharm.Pharm.Med.Chem.2002,11,556-562)所述相似的條件下使合適的肼化合物諸如A和合適的醛，諸如B反應制備實施方案，其中R²＝NH，R³＝N，R⁴＝CH且R⁵＝-芳基。

例如，在質(zhì)子溶劑，諸如C₁-C₆醇中將A與1.1當量的B一起加熱1-24小時，隨后冷卻并且收集沉淀，可以得到C?；蛘撸梢酝ㄟ^蒸發(fā)溶劑并且通過使用硅膠、氧化鋁或C₄-C₁₈反相介質(zhì)的色譜法純化分離產(chǎn)物C。類似方法可以適用于“芳基”被如R⁵中定義的其它基團取代的情況。

可以通過使合適的肼化合物，諸如D和活化的羧酸，諸如E反應制備實施方案，其中R²＝NH，R³＝NR³²，R⁴＝C(O)且R⁵＝雜環(huán)，其中LG為離去基團，諸如鹵素、1-氧基苯并三唑、五氟苯氧基、對-硝基苯氧基等；或化合物E還可以為不對稱羧酸酐，其中可以使用與Nair和Mehta的p.408(Indian J.Chem.1967 5,403-408)中所述相似的條件。

例如，在0℃-溶劑沸點的合適的溫度下，在有堿，諸如吡啶或另一種叔胺存在和任選在有催化劑，諸如4-N,N-二甲氨基吡啶存在下的惰性溶劑，諸如二氯甲烷、1,2-二氯乙烷或N,N-二甲基甲酰胺中用活性酯，諸如雜環(huán)-C(O)-OC₆F₅處理D可以得到F，可以通過蒸發(fā)溶劑，隨后使用硅膠、氧化鋁或C₄-C₁₈反相介質(zhì)的色譜法對其進行分離。易于由相應的羧酸和五氟苯酚，使用碳二亞胺，諸如二環(huán)己基碳二亞胺作為縮合試劑制備E的上述活性酯實例。類似方法可以適用于“雜環(huán)”被如R⁵中定義的其它基團取代的情況。

可以通過使合適的親核體，例如，肼衍生物和在與氮原子相鄰位置上帶有鹵素取代基的雜芳族化合物反應制備前體，諸如A和D。例如，可以使用與Wu等(J.Heterocyclic Chem.1990,27,1559-1563)、Breshears等(J.Am.Chem.Soc.1959,81,3789-3792)或Gineinah等(Arch.Pharm.Pharm.Med.Chem.2002,11,556-562)所述類似的方法，由例如，2,4-二鹵代嘧啶衍生物為原料制備化合物A和D的實例，所述原料中的許多為商購可得，或者易于由本領域技術人員制備。因此，用胺或其它親核體(Z)，任選在有添加的堿存在下處理合適的2,4-二鹵代嘧啶衍生物G，選擇性取代嘧啶環(huán)上的4-鹵素取代基。隨后用第二種親核試劑，諸如肼或肼衍生物任選在溶劑，諸如C₁-C₆醇和任選在有添加的堿存在下處理產(chǎn)物，取代嘧啶環(huán)上的2-鹵素取代基，從而得到為上述結構A和D的實例的化合物。

可以通過諸如下列或其直接修飾的這類方法合成實施方案，其中R²為-NR²²且R³為-C(＝R³³)。可以以合適的環(huán)A衍生物J為原料進行合成，所述的環(huán)A衍生物J帶有與必需的環(huán)氮相鄰的離去基團(LG)。如上所述，上述結構G與結構G與親核體Z的反應產(chǎn)物為這類合適的環(huán)A衍生物J的實例。合適的LG’基團為鹵素、烷硫基、烷基磺?；⑼榛撬狨セ蚍蓟撬狨?。用胺R¹²NH₂處理J對LG’進行取代得到中間體K。該化學轉(zhuǎn)化的實例由Capps等在J.Agric.Food Chem.1993,41,2411-2415中報導，其中R¹²為H且LG’為CH₃SO₂-，并且R¹²為H且LG’為Cl的實例報導在Marshall等的J.Chem.Soc.1951,1004-1015中。

通過同時或依次引入R³、R⁴和R⁵的元素，結構K的中間體轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的化合物。例如，用異氰酸酯R⁶-N＝C＝O各自處理結構K的中間體而在單一步驟中得到結構M的化合物，其為本發(fā)明的化合物，其中R²＝-NR²²-，R³＝-C＝O-，R⁴＝-NH-且R⁵＝-化學鍵-R⁶。將結構K的化合物轉(zhuǎn)化成結構M的化合物的備選方法為本領域技術人員眾所周知，其中，首先引入R³與離去基團(例如對-硝基苯氧基或氯)，隨后用例如胺R⁶-NH₂取代離去基團以便引入R⁵和R⁶。

或者，一般在加熱條件和任選在有溶劑，諸如乙酸乙酯或二烷存在下用試劑，諸如，氨基氰(NH₂-CN)處理結構K的中間體而得到中間體N。氨基氰的備選物為硝基胍或脒基磺酸(NH₂-C(＝NH)-SO₃H)。使用氨基氰進行這類轉(zhuǎn)化的實例由Latham等在J.Org.Chem.1950,15,884中報導。使用硝基胍的實例由Davis在Proc.Natl.Acad.Sci.USA1925,11,72報導。脒基磺酸的應用由Shearer等Bioorg.Med.Chem.Lett.1997,7,1763報導。

按照將中間體A或D轉(zhuǎn)化成由C或F表示的實施方案類似的方式，將中間體K分別轉(zhuǎn)化成由P或Q表示的化合物，它們?yōu)楸景l(fā)明進一步的實施方案。

在上述方案中，用酮S處理A或K以便取代B，其中R如上所述，而分別得到結構T或U的化合物，它們?yōu)楸景l(fā)明進一步的實施方案。

用合適的還原劑諸如金屬(硼、鋁、硅等)氫化物試劑，優(yōu)選一種具有堿性的還原劑選擇性還原U的非-胍基碳-氮雙鍵而得到本發(fā)明的化合物V。

可以如下制備本發(fā)明的實施方案，其中R²＝CO，R³＝-NR^32-，R⁴＝N-且R⁵＝ZR⁷，其中Z為烴鏈且R⁷如上所述。當R³²＝H時，通過轉(zhuǎn)化成相應的?；然蜣D(zhuǎn)化成活性酯或類似的活化衍生物來活化環(huán)A-衍生的羧酸W，上述過程中的許多為本領域眾所周知。用肼處理活化的羧酸得到相應的酰肼Y。用醛或酮處理Y(如果必要，在加熱條件和/或溫和酸催化下)而得到所需的終產(chǎn)物Z。

如果不是商購可得，那么可以通過用氰化物離子處理上述原料J，任選通過加熱或過渡金屬催化以便用氰基殘基取代離去基團LG’，制備環(huán)A-衍生的羧酸W。氰基的堿性或酸性水解得到酸性的羧酸中間體W。

當R³²不為H時，單取代的肼的被保護形式可以用于上述方案以便替代肼。因此，用R³²NHNH-PG，其中PG為氮保護基團，諸如芐氧羰基或叔-丁氧羰基處理來自W的活化羧酸，隨后脫保護并且如上所述用合適的醛或酮處理而得到Z’，其為本發(fā)明的另一個實施方案。

有機合成領域技術人員顯而易見，上述反應過程為列舉的方法中合乎邏輯的擴展的一組廣泛方法的代表。因此，通過上述方法的顯而易見的變型可以制備本發(fā)明要求保護的引入額外的R²、R³、R⁴和R⁵變化形式的本發(fā)明進一步的實施方案。

作為本領域技術人員公認的，有利的是在獲得終產(chǎn)物中使用臨時的保護基團。本文所用的術語"保護基團"指的是可能的反應官能基團的臨時變型，所述的反應官能基團可以防止不需要的化學轉(zhuǎn)化。這類保護基團的實例包括羧酸的酯類、醇的甲硅烷基醚類以及醛和酮分別的縮醛類和酮縮醇類。已經(jīng)綜述了保護基團化學的領域(Greene,T.W.；Wuts,P.G.M.Protective Groups in Organic Synthesis,2^nd ed.；Wiley：New York,1991)。

“突變蛋白”為具有作為在相應基因中出現(xiàn)的作為突變結果而改變的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(Weigel等,1989)。這類突變可以導致編碼的蛋白質(zhì)特性中的一種或多種改變。例如，具有因一種或多種氨基酸改變產(chǎn)生的修飾的催化化學的酶變體為突變蛋白。

本發(fā)明涉及隱含至少一種氨基酸殘基改變的蛋白質(zhì)(術語"氨基酸序列改變(amino acid sequence change)”或"氨基酸序列改變(amino acid sequence alteration)"包括至少一種氨基酸殘基的改變、缺失或添加，或缺失、添加、改變的任意組合)，以使所得突變蛋白相對于所述蛋白質(zhì)的未-突變形式對治療劑的敏感性而言變得(作為突變的結果)對已知治療劑產(chǎn)生抗性。這種特定類型的突變蛋白在下文中稱作theramutein，并且缺乏突變的相應的蛋白質(zhì)在本文中稱作prototheramutein。

本文所用的"prototheramutein"指的是在細胞中內(nèi)源性出現(xiàn)的蛋白質(zhì)，所述的細胞對賦予治療化合物相對無敏感性(即抗性)的突變敏感，否則，所述的治療化合物抑制或活化所述蛋白質(zhì)。因此，"theramutein"指的是在含有相對于蛋白質(zhì)的內(nèi)源性形式而言至少一種氨基酸序列改變的細胞中內(nèi)源性出現(xiàn)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)部分，其中在使至少一個人接觸已知抑制或活化prototheramutein的物質(zhì)后，所述的氨基酸序列改變得到或被鑒定或成為可鑒定，并且經(jīng)顯示或已經(jīng)顯示對指定疾病的發(fā)生或發(fā)展而言具有臨床意義。就確定上句中的目的而言，唯一的是物質(zhì)不需限于用于首次定義theramutein存在目的的化學活性劑。因此，作為定義，theramutein是在其相應的內(nèi)源性基因中隱含了突變的蛋白質(zhì)，其中所述的突變與患者對一般能夠活化或抑制未-突變蛋白的藥物發(fā)生臨床耐受性相關。就指定的theramutein而言，本文所用的術語“相應的prototheramutein”指的是通過突變產(chǎn)生所述的theramutein的prototheramutein。類似地，就指定的prototheramutein而言，相應的theramutein”指的是通過由所述prototheramutein突變產(chǎn)生的theramutein。

因此，本領域技術人員顯而易見，當編碼theramutein的基因限于內(nèi)源性出現(xiàn)的基因時，theramutein的定義不包括由導致疾病的病原體，諸如病毒和細菌編碼的蛋白質(zhì)。本文所用的術語"內(nèi)源性基因"指的是自攝入以后已經(jīng)至少以其未突變形式存在于生物體的染色體中的基因。本文所用的術語"細胞"指的是活的真核細胞，無論是在生物體，還是維持在生物體外合適的實驗室組織或器官培養(yǎng)條件下。

在本發(fā)明的一個方面中，theramutein為相對于該蛋白質(zhì)的通常存在的“野生型”形式(即prototheramutein)而言首次改變的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另一個方面中，theramutein為蛋白質(zhì)變體(prototheramutein)，即其自身已經(jīng)為突變蛋白。在另一個實施方案中，theramutein與先前存在的theramutein相比可以得到進一步突變。在這類情況中，可以將第一種theramutein(諸如p210BCR-ABL的T315I突變體(參見下文)視為"初級"theramutein，而隨后(已經(jīng)突變的)T315I變體的突變可以稱作二級theramutein、三級theramutein等。作為下文中典型的，本發(fā)明的突變蛋白為脫離“野生型”Bcr-Abl抑制劑抑制的Bcr-Abl酪氨酸激酶的變體。這類Bcr-Abl突變蛋白相對于Bcr-Abl的更常見或“野生型”形式而言得到改變(也稱作突變蛋白)，以這類方式改變蛋白質(zhì)的特性。

可以理解主要關注的突變蛋白為相對于其prototheramutein而言具有相同、增加或減少的比活性，并且不受能夠抑制prototheramutein的活性劑抑制或難以受到其抑制的theramutein。同樣，另一種主要關注的theramutein為具有相同、增加或減少的比活性(相對于其prototheramutein而言)并且不受能夠活化prototheramutein的活性劑活化或難以受到其活化的theramutein。其它變化形式對本領域技術人員而言顯而易見。進一步理解theramuteins可以包括天然存在或通常觀察到的蛋白質(zhì)變體，例如，由特定基因的不同等位基因表達的變體。在某些情況中，這類變體就其正常細胞功能而言可能并不顯著，其中功能差異僅在有差別抑制或活化變體細胞功能的活性劑存在下變得明顯。例如，特定酶的天然存在的變體可以具有基本上不同的活性譜，但調(diào)節(jié)一種變體的治療劑可能對調(diào)節(jié)另一種變體無效。

可以理解，本發(fā)明的一個方面在于鑒定針對在治療指定疾病過程中產(chǎn)生或變得占優(yōu)勢(通過任何機制)的theramutein具有活性的活性劑，另一個方面在于鑒定針對在未受侵害個體群體中常見的突變蛋白具有活性的活性劑，但其中所述的突變蛋白對已經(jīng)批準的藥物的調(diào)節(jié)的敏感性較低，并且其中突變蛋白的活性譜變化在疾病狀態(tài)中變得重要(且由此首次鑒定為theramutein)，諸如，在所述的疾病狀態(tài)中，該突變蛋白得到超表達或參與信號傳導過程，否則成為異常調(diào)節(jié)。例如，腫瘤性疾病可以因非theramutein或其prototheramutein的細胞成分的異常調(diào)節(jié)所致，并且仍然可使用prototheramutein抑制劑治療，而相同的治療對存在theramutein的情況有效性較低或無效。這可能是一種結果，其中觀察到特定腫瘤類型對抗癌藥的反應在個體中改變，所述的個體表達抗癌藥定向于的酶的不同變體(Lynch等,2004)。在此處，變體在治療疾病的過程中可以不產(chǎn)生或變得占優(yōu)勢，但預先存在于健康群體中并且僅根據(jù)其對建立的治療的特定過程中改變的反應性來檢測。

本文所用的術語蛋白質(zhì)的“激動劑”和“活化劑”可以互換使用?；罨瘎?激動劑)限于結合和活化指定蛋白質(zhì)功能的物質(zhì)。除非另有說明，"活化劑"、"激動劑"和"蛋白質(zhì)的活化劑"在含義上相同。通過活化劑激活可以是部分或完全的。同樣，本文所用的術語蛋白質(zhì)的“拮抗劑”和“抑制劑”可以互換使用。抑制劑(拮抗劑)限于結合和抑制指定蛋白質(zhì)的功能的物質(zhì)。描述物質(zhì)“抑制”蛋白質(zhì)指的含義是指該物質(zhì)在細胞中結合蛋白質(zhì)并且降低蛋白質(zhì)的活性，但實質(zhì)上不減少細胞中蛋白質(zhì)的量。類似地，描述物質(zhì)“活化”蛋白質(zhì)，諸如prototheramutein或theramutein是指該物質(zhì)增加細胞中蛋白質(zhì)的限定的功能，但基本上不改變細胞中蛋白質(zhì)的水平。除非另有說明，"抑制劑"、"拮抗劑"和"蛋白質(zhì)的抑制劑"也為同義詞。抑制劑的抑制可以為部分或完全的。調(diào)節(jié)劑為活化劑或抑制劑。作為實例，"PKC_β1的活化劑"應解釋為指結合并且活化PKC_β1的物質(zhì)。類似地，“p210^Bcr-Abl的抑制劑”為結合并且抑制p210^Bcr-Abl功能的物質(zhì)。描述物質(zhì)"抑制蛋白質(zhì)"要求該物質(zhì)結合所述蛋白質(zhì)以便發(fā)揮其抑制作用。類似地，描述物質(zhì)"活化蛋白質(zhì)X"是指該物質(zhì)結合并且活化蛋白質(zhì)X。術語“結合(bind(s))”、“結合(binding)”和“結合(binds to)”在描述兩種物質(zhì)之間相互作用方面(例如酶-底物、蛋白質(zhì)-DNA、受體-配體等)具有其在生物化學領域中通常的含義。本文所用的術語“結合(binds to)”在討論物質(zhì)與其相應靶蛋白之間相關性的上下文中和“與…相互作用”為同義詞。本文所用的描述物質(zhì)對蛋白質(zhì)“起作用”、“影響”蛋白質(zhì)、“發(fā)揮其對蛋白質(zhì)的作用”等以及所有這類相關術語含義一致(正如本領域技術人員充分了解的)，即所述物質(zhì)活化或抑制所述蛋白質(zhì)。

首次定義了將內(nèi)源性蛋白質(zhì)的突變形式抑制或活化至大于相應未-突變對應蛋白(counterpart protein)的程度的概念，并且在本文中稱作陽性"特異性缺口"。一般來說，并且以使用抑制劑的情況作為實例，特異性缺口指的是在基于細胞的試驗系統(tǒng)中抑制theramutein的可比的條件下，指定物質(zhì)與如下情況之一相比的能力之間的差異：

a)在可比的條件下相同物質(zhì)抑制prototheramutein的能力；或

b)在可比的條件下第二種物質(zhì)(通常為prototheramutein的已知抑制劑)抑制theramutein的能力；或

c)在可比的條件下第二種物質(zhì)抑制prototheramutein的能力。

當對兩種不同物質(zhì)(分別測試的)單獨對theramutein的作用之間進行比較時，將結果稱作同源性特異性缺口測定。

或者，當對兩種不同物質(zhì)(一般，但不總是)的作用之間進行比較時，分別將其中之一用于對theramutein的測試，而另一種用于對prototheramutein的測試，將結果稱作異源性特異性缺口(SG)測定。因此，作為上述給出的(a)和(c)為異源性特異性缺口(SG)測定的實例(盡管在兩種情況中均使用相同的物質(zhì))，而(b)為特異性特異性缺口測定的實例。

附圖3涉及的內(nèi)容為在理解和闡明這些概念中的信息。

在情況涉及活化劑時應用類似的結果。對本領域技術人員即刻顯而易見的是，本文所用的術語“可比的條件”包括測試兩種不同的化合物，例如在相同濃度下(諸如比較兩種緊密相關的化合物以便測定相對功效)，或通過將兩種在其相應IC₅₀值下測試的不同化合物對相應prototheramutein和theramutein的作用進行比較。本領域技術人員易于認可其它有用的變化形式和可比的條件。

因此，在該方法應用的一個實施方案中，對theramutein更為有效的物質(zhì)具有"陽性特異性缺口"?！傲?、無效或無"特異性缺口表示在物質(zhì)對theramutein的作用與其對prototheramutein的作用之間不存在顯著的可測定的差異(不過，這類化合物可能在其抑制或活化theramutein及其相應prototheramutein的能力方面相當有用)，并且"陰性特異性缺口"表示在指定濃度下的物質(zhì)對指定theramutein的有效性低于對theramutein的相應prototheramutein形式或另一種相當形式(諸如可以隱含一種不同的突變)的有效性。對后者化合物類別的關注程度一般低于前者化合物的類別，但除外以下情況：其中化合物如此有效，使得其對theramutein的相對較低作用從治療功效的前景來看并無實際的擔憂。本領域技術人員易于識別以適合于他或她需求的方式量化特異性缺口評價的各種手段。

本發(fā)明還提供了用于鑒定表現(xiàn)出所需特異性缺口的化合物的方式。鑒定這類化合物并且使用體外基于細胞的試驗系統(tǒng)測定其抑制或活化theramutein的能力，其中將物質(zhì)對該蛋白質(zhì)的突變內(nèi)源性形式的細胞功能的作用與相同藥物對該蛋白質(zhì)非-突變內(nèi)源性形式的細胞功能的作用進行比較。

因此，所述系統(tǒng)能夠發(fā)現(xiàn)這類化合物，所述化合物能夠結合theramutein并且對所述theramutein的細胞功能發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用大于對其相應prototheramutein的細胞功能發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用。此外，該系統(tǒng)能夠發(fā)現(xiàn)這類化合物，所述化合物能夠結合theramutein并且對theramutein的細胞功能發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用至少大于或大于上述已知化合物能夠?qū)ο鄳猵rototheramutein的細胞功能發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，為以下結果篩選和鑒定化合物：1)對theramutein的有效性至少與原始藥物對prototheramutein的有效性相同；和/或2)對prototheramutein的有效性與對theramutein的有效性類似(即展示出小或基本上為零的特異性缺口)。

在本發(fā)明的一個實施方案中，超表達所關注的theramutein的細胞用于鑒定為至少選擇的theramutein的抑制劑或活化劑(即結合和抑制或結合和活化)的化學活性劑。這些化學活性劑還可以為prototheramutein乃至相同prototheramutein的其它theramuteins的抑制劑或活化劑。本文所用的術語"化學活性劑"和"化合物"可以互換使用，并且兩術語僅指具有至多，但不一定包括2000原子質(zhì)量單位(道爾頓)的分子量的物質(zhì)。這類物質(zhì)有時稱作“小分子”。除非另有說明，本文所用的術語物質(zhì)僅指化學活性劑/化合物，并且不指生物活性劑。本文所用的"生物活性劑"為包括蛋白質(zhì)、多肽類和核酸的分子并且具有等于或大于2000原子質(zhì)量單位(道爾頓)的分子。

按照本發(fā)明選擇theramutein并且用于基于細胞的試驗系統(tǒng)，設計該系統(tǒng)是為了鑒定為theramutein的抑制劑或活化劑的活性劑。如果已知兩種或多種不同theramuteins來源于相同的prototheramutein，那么優(yōu)先選擇最具有抗性的可利用theramutein用于試驗系統(tǒng)。一般來說，使用首先給予并且已知抑制或活化prototheramutein且針對theramutein"出現(xiàn)"的藥物測定theramutein與其未-突變對應體(prototheramutein)相比較對指定化學活性劑的抗性程度。例如，通過分析IC₅₀或AC₅₀值測定這類抗性程度的方法為眾所周知的并且在本領域中是標準的，且在本文中未重復。然而，因果關系并非是必不可少的或應在使用自身指定的治療劑治療患者與隨后theramutein的出現(xiàn)之間進行推斷。而為實施本發(fā)明所需的是按照本文的教導適當選擇正確的theramutein。

因此，例如，在實驗室中產(chǎn)生，但尚未在臨床相關性上得以證實的已知蛋白質(zhì)的隨機產(chǎn)生的定向位點突變體并非用于本發(fā)明范圍內(nèi)的合適的突變蛋白。當然，不會將這類突變蛋白劃為theramuteins。

例如，在獲得p210^Bcr-Abl突變體的潛在抑制劑的嘗試中，Huron等(2003)使用了重組c-abl制品并且篩選了一系列已知抑制c-src酪氨酸激酶活性的化合物。作者對他們的化合物進行了c-abl激酶試驗并且鑒定了在8nM時為對c-ab1最有效的化合物。然而當測試該化合物(PD166326)抗各種p210^Bcr-Abl theramuteins時，它表現(xiàn)出對突變體中的某些，諸如p210^{Bcr-Abl-E255K}的活性，但發(fā)現(xiàn)p210^{Bcr-Abl-T315I} theramutein保留了10倍以上的抗性(Huron等 2003,表3)。此外，在每種情況中，化合物對p210^Bcr-Abl theramuteins的作用仍然顯著低于它對野生型p210^Bcr-Abl的作用。當測試化合物對p210^{Bcr-Abl-T315I}突變體的活性時，它不能將活性抑制到任何可評估的程度(p.1270,左手欄，第二段；另外，參見附圖4)。因此披露的化合物能夠抑制對STI-571產(chǎn)生部分抗性的theramutein，但對Bcr-Abl的T315I突變體無活性，在當時已知所述的theramutein為對STI-571表現(xiàn)出最大抗性的theramutein。因此，精確和簡單而言，Huron的方法無法鑒定p210^Bcr-AblT315I theramutein的有效抑制劑。

實際上，在披露本發(fā)明，包括本文首次描述的詳述方法以及本文提供的組合物前，世界上尚無人在任何地方成功地鑒定一種化學活性劑，更不必說一種能夠鑒定將p210^Bcr^-AblT315I theramutein有效抑制至等于或高于STI-571能夠?qū)σ吧蚿210^Bcr-Abl蛋白質(zhì)所抑制的程度的化學活性劑的方法(參見Shah等,Science,2004年8月；O'Hare等,Blood,2004；Tipping等,Leukemia,2004；Weisberg等,Leukemia,2004)。

不能過分強調(diào)這類化合物可能非常有用，因為目前尚無用于發(fā)展成p210^Bcr^-Abl-T315I theramutein-介導的甲磺酸伊馬替尼(imatinib)-抗性狀態(tài)的患者的備選方法。一旦患者發(fā)生這類抗性，則沒有可利用的其它有效備用手段，且死亡是肯定的。本文所述的方法提供了用于鑒定、從藥理學方式上表征和化學合成p210^{Bcr-Abl-T315I} theramutein的有效抑制劑的第一個報導的方法。此外，本領域技術人員立即認可了這種手段在任何高度藥物抗性theramutein中的可應用性和會推廣性。

在本發(fā)明中，使用展示出謹慎選擇的表型特征(如下所述)的測試細胞，所述的特征與在適當條件下細胞中特定所關注的theramutein(TOI)的存在和功能活性相關。從定性上看，這一結果與表達prototheramutein的細胞展示出的表型特征相同。表型特征(即細胞的非-基因型特征)為觀察到(測定的)、選擇和/或隨后用于如本文所述試驗方法限定的特性。表型特征的表達是對細胞中theramutein的總體活性的反應，并且為theramutein的絕對量及其比活性的結果。表型特征通?？勺鳛閠heramutein活性水平升高的結果觀察到并且在表達少量theramutein或少量其相應的prototheramutein的細胞中并不明顯。此外，通常可以證實通過用theramutein的抑制劑或活化劑調(diào)節(jié)theramutein的比活性調(diào)節(jié)表型特征，不過，這并非是始終如一的情況，因為TOI的抑制劑或活化劑在本領域技術人員從事這類項目時可能并非始終可得。因此，為了確定隨后用于為試驗目的的指定測試細胞的表型特征的目的，本領域技術人員還可以使用能夠增加或減少theragene表達的物質(zhì)，由此使得相應theramutein的水平增加或減少。這使得本領域技術人員可以模擬某些類型的theramutein活化劑或抑制劑(諸如theramutein的自殺性抑制劑，為不可逆結合和共價修飾TOI而賦予其持久無活性的化學活性劑類型)，但實際上為了精確了解隨后用于建立有用的細胞試驗系統(tǒng)的合適表型特征的目的而可以使用這類化合物。有助于這類目的的本領域技術人員已知的實例包括利用反義DNA寡核苷酸、小干涉RNAs、其它基于RNA干涉的方法和含有誘導型啟動子系統(tǒng)的載體構建體。在這種方式中，選擇的表型特征與測試細胞中theramutein的活性相關。對theramuteins值得注意的是，選擇的表型特征通常也由超表達prototheramutein的細胞展示，且其中表型特征由已知的prototheramutein的抑制劑或活化劑調(diào)節(jié)。

表型特征單純?yōu)榉羌毎蛐吞卣鞯募毎卣鳌３绫疚呐兜倪m當確定的表型特征在按照本發(fā)明某些實施方案的教導產(chǎn)生有用的細胞試驗系統(tǒng)目的中的具體需求外，對用于或適合于適當和有效實施本發(fā)明的術語任意類型或性質(zhì)的表型特征沒有其它限制。實際上，本領域技術人員必須能夠選擇將建立用于他或她需求的適當?shù)幕诩毎脑囼灥膽米畲蠡募毎娜我馓卣鳌１硇吞卣骺梢詾槎炕蚨ㄐ缘牟⑶铱芍苯佑^察或測定(例如可用裸眼或用顯微鏡)，但最常見的是使用本領域技術人員公知的標準自動化實驗室設備和試驗操作步驟間接測定所述特征。術語"可觀察到"指的是可以測定特征，否則就是在適當條件下可通過無論何種方式，包括使用任意類型的實驗室可利用的儀器操作測。術語"可測定"與"測定的"的含義不同。特征對于本領域技術人員來說是可以檢測的但不在任意指定的時間測定，這取決于本領域技術人員選擇如何設計試驗系統(tǒng)。例如，在尋找prototheramutein(或theramutein)活化劑的過程中，需要僅在添加能夠活化POI的已知活化劑或測試物質(zhì)后檢測相關表型特征。這提供了使在試驗中由測試細胞產(chǎn)生的信號強度最大化的能力。

表型特征包括但不限于生長特征、轉(zhuǎn)化狀態(tài)、分化狀態(tài)、底物磷酸化狀態(tài)、催化活性、跨細胞膜的離子流(鈣、鈉、氯化物、鉀、氫離子等)、pH改變、第二信使分子或其它胞內(nèi)化學種類，諸如cAMP、磷酸肌醇類、環(huán)核苷酸的變動、基因表達的調(diào)節(jié)等?？蛇B續(xù)(例如細胞生長率)，或在一定時間期限后(例如細胞培養(yǎng)物的最終密度)或瞬時(例如突變蛋白的調(diào)節(jié)導致突變蛋白底物磷酸化瞬時改變，或離子流的瞬時流量跨膜，或胞內(nèi)cAMP水平升高或降低)觀察到或測定細胞特征。在某些實施方案中，可以僅在有prototheramutein或theramutein調(diào)節(jié)劑存在下檢測選擇的表型特征。對可以為測定而選擇的特征沒有指定的限制。本文所用的術語“細胞的特征”和“表型特征”以及單純的“特征”在用以指用物質(zhì)處理測試細胞后完整細胞或細胞的亞細胞部分的具體可測定特性時的含義是相同的。例如，表型特征可以為灶性形成，當將在超表達選擇的蛋白質(zhì)的細胞在有該蛋白質(zhì)活化劑存在下培養(yǎng)，或胞內(nèi)代謝物或離子，諸如cAMP、鈣、鈉、氯化物、鉀、鋰、磷脂酰肌醇、cGMP、碳酸氫鹽等的水平瞬時增加或降低時，這種灶性形成變得可以觀察到。本領域技術人員顯而易見，在細胞接觸測試物質(zhì)后，可以對細胞的亞細胞部分測定如此測定(檢測)的特征。然而，必須對完整細胞而非亞細胞部分用物質(zhì)進行最初的處理，由此使該物質(zhì)接觸所述細胞。

為細胞內(nèi)測定而選擇的特征不一定為theramutein或prototheramutein本身內(nèi)在物理或化學特性(諸如僅是細胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)的量(質(zhì)量))，而必須是因細胞內(nèi)部theramutein活性產(chǎn)生而由此影響不同于theramutein本身的細胞特征的特征，正如上文詳細討論的。例如，如果theramutein為能夠進行自磷酸化的蛋白激酶，所述的自磷酸化即該酶能夠通過從其自身上的ATP中轉(zhuǎn)移末端磷酸部分而催化自身磷酸化的過程，那么可能不適合于選擇TOI的磷酸化狀態(tài)作為用于測定的細胞的合適的表型特征。這是因為這類特征不會反映出TOI對其它細胞成分的活性。正如本領域技術人員已知的，自磷酸化不必然反映出細胞中蛋白激酶的活性，因為已知蛋白激酶的突變體保留了足以進行自磷酸化的酶活性，但失去了在細胞內(nèi)進行信號轉(zhuǎn)導的能力。White等的經(jīng)典論文(1988)在這方面既具有教導性，又值得關注。

術語"反應性表型特征"指的是對指定蛋白質(zhì)(prototheramutein或theramutein)的抑制劑或活化劑起反應的細胞特征。將術語"已知的治療劑"定義為在世界范圍內(nèi)的國家中對人給藥用于治療疾病的任意活性劑。

作為本文中與p210^Bcr-Abl及其theramuteins相關的典型的有用的表型特征為細胞生長和增殖失調(diào)。注意相同或相似試驗可以適用于許多不同所關注的蛋白質(zhì)。例如，生長、增殖和/或分化失調(diào)為因各種不同細胞蛋白質(zhì)超表達產(chǎn)生的常見表型特征。本發(fā)明的重要教導在于通過超表達選擇的蛋白質(zhì)而導致這類表型特征出現(xiàn)，所述的特征變得在合適的條件下與選擇的蛋白質(zhì)的存在、量和比活性相關，并且這種相關性能夠使得本領域技術人員根據(jù)需要鑒定所關注的theramutein(TOI)的抑制劑或活化劑。因此，表型特征為對選擇的蛋白質(zhì)的水平和/或比活性改變的反應。這類反應性表型特征在本文中稱作“表型反應(phenoresponse)”。

盡管并非始終必要，但是通常有利的是使用表達高水平theramutein的細胞并且選擇因theramutein超表達產(chǎn)生的表型特征。這是因為與theramutein功能相關的表型特征一般比theramutein被超表達至更大程度時更加可區(qū)分(更易于測定)。此外，在theramutein的功能水平增加時，對theramutein調(diào)節(jié)劑的反應觀察到的表型反應通常得到擴大。如果以另一種方式表達，那么在超表達theramutein的細胞觀察到的選擇的表型反應對theramutein的調(diào)節(jié)劑特別敏感。

優(yōu)選theramutein在測試細胞中得到穩(wěn)定表達。穩(wěn)定表達theramutein導致細胞中的水平在試驗過程中保持相對不會改變。例如，刺激或活化信號傳導途徑中的成分后為不應期，在此過程中，信號傳導因所述成分的減量調(diào)節(jié)而受到抑制。就本發(fā)明的theramuteins而言，這類減量調(diào)節(jié)通常通過人工超表達theramutein而足以克服。如果以另一種方式表達，那么充分維持表達，即在試驗過程中觀察到的這些表型特征改變主要是因theramutein抑制或活化，而非其水平改變所致，即使theramutein的減量調(diào)節(jié)隨之發(fā)生也是如此。由于這些原因，所以盡管優(yōu)選theramutein的穩(wěn)定表達，但是在轉(zhuǎn)染后可以使用theramutein的瞬時表達，條件是選擇的表型特征可測定并且試驗系統(tǒng)的期限比其在這類系統(tǒng)中隨時間預計的瞬時表達的theramutein的水平進行性下降短。由于這些原因，優(yōu)選穩(wěn)定表達的細胞系(美國專利US4,980,281)。

本發(fā)明優(yōu)選的藥物篩選方法包括下列步驟：

1)鑒定需要新抑制劑或活化劑的theramutein?？梢允褂脴藴始夹g對合適的theramutein進行鑒定(參見，Gorre等,Science,2001；另外，參見PCT/US02/18729)。簡單的說，鑒定使用已知或可疑的prototheramutein的活化劑或抑制劑給予治療有效的治療過程且隨后已經(jīng)表現(xiàn)出與疾病復發(fā)一致的臨床征兆和癥狀的患者，并且獲得來源于這類患者的細胞或組織。使用標準實驗室技術，諸如RT-PCR測定prototheramutein的序列并且與已知prototheramutein基因或cDNA序列的預先測定的核酸序列進行比較。如果存在，那么鑒定突變并且再次使用標準方法與基于細胞或更常用的基于細胞的試驗系統(tǒng)中prototheramutein的功能的功能抗性建立相關。一旦證實了誘導抗性的突變，那么所述的一種或多種經(jīng)證實的突變體包括可以用于如本文所述的隨后方法限定的theramutein。

2)提供表達所關注的theramutein并且展示出可觀察到(可測定的)表型特征的測試細胞，已經(jīng)預先證實所述的表型特征對theramutein，或更常見的是相應的prototheramutein的抑制劑或活化劑有反應。將已經(jīng)預先證實對所關注的theramutein(TOI)和/或所關注的prototheramutein(pTOI)有反應的特異性表型特征在本文中首次定義為“表型反應(phenoresponse)”。本發(fā)明的一個實施方案在于所述表型反應在鑒定能夠成為TOI抑制劑或活化劑的化合物的目的中的確定應用。這一過程可以通過使用應用過度產(chǎn)生指定的TOI并且已經(jīng)鑒定和表征了適當?shù)谋硇头磻募毎档母吡魍亢Y選來進行?；蛘?，可以使用應用更一般性的細胞系表型特征(按照本文的教導并不定為表型反應)的高流通量初級篩選且然后按照本文的教導使用二次篩選，以便從并非所關注的theramutein的抑制劑或活化劑的假陽性化合物中區(qū)分確實為陽性的“命中數(shù)”的化合物，即所關注的theramutein的抑制劑或活化劑。在一個實施方案中，選擇天然表達theramutein的細胞，以便反應性表型特征在對本領域技術人員而言顯而易見的適當培養(yǎng)條件下存在。在其它實施方案中，theramutein在某些情況中在宿主細胞中得到超表達，否則，該宿主細胞完全不表達theramutein。這一過程通常包括構建表達載體，可以將該表達載體導入合適的宿主細胞并且使用標準載體系統(tǒng)和方法超表達(Gorre等,2001；Housey等,1988)。在一個實施方案中，超表達產(chǎn)生的theramutein水平至少約3倍于該蛋白質(zhì)通常存在于細胞中的量?；蛘?，該量至少約為通常存在于細胞中的量的10倍。在另一個實施方案中，該量至少約為通常存在于細胞中的量的20倍或更優(yōu)選至少約為50倍。

3)提供表達相應于所關注的theramutein的prototheramutein的對照細胞。當本文所述的某些突變蛋白也為酶時，它們通常保留了催化活性并且由此對照細胞通常展示出基本上與測試細胞相同的表型特征。不過，這種表型特征不需要如兩種細胞那樣進行定量。例如，使prototheramutein再活化的突變蛋白就其在細胞中的底物中的一種或多種而言也可以增加、減少乃至影響其比活性。作為結果，它可以將選擇的表型特征展示出較大或較小的程度。因此，在某些情況中，需要調(diào)整prototheramutein和theramutein之一或它們兩者的表達，以便測試和對照細胞將表型特征展示至近似相同的程度。例如，均可以使用標準方法，通過由啟動子表達蛋白質(zhì)達到這一目的，其中可以通過調(diào)整存在的誘導物的量來調(diào)整啟動子的活性(例如，參見Maniatis等)。

本領域技術人員顯而易見，適當定義的表型反應在表達prototheramutein與theramutein的細胞系中可以存在定量差異作為與其相應的prototheramutein之間比活性差異(如果有的話)的結果。誘導Theramutein的突變可以增加或減少所述theramutein相對于相應的prototheramutein而言的比活性。當將表達theramutein的細胞系與表達prototheramutein的細胞系進行比較時，優(yōu)選選擇的表型反應在兩種細胞類型中定性地相同。因此，本領域技術人員可以選擇將表達theramutein的細胞系的活性與表達prototheramutein的細胞系的活性校準或反之亦然。這類歸一化法在本領域中是標準的。例如，參見Bolstad等(2003)。

或者，本領域技術人員還可以希望使用未修飾的宿主細胞或僅隱含了表達載體作為用于某些實驗操作步驟的對照細胞的宿主細胞(宿主細胞為導入了編碼theramutein的表達載體而產(chǎn)生測試細胞的細胞)。這可能就是研究人員僅對所關注的theramutein的特異性抑制劑或活化劑感興趣，而與所述化合物是否還對所關注的prototheramutein(pTOI)有效無關的情況[取代工作活性]。

4)然后在合適的條件下將測試和對照細胞維持或使其增殖(不過不一定在同時)在生長培養(yǎng)基(乃至在完整動物體內(nèi))中，以便可以表達和檢測表型反應?？梢杂胮rototheramutein的已知調(diào)節(jié)劑或用測試物質(zhì)處理表達prototheramutein的對照細胞，并且用測試化合物處理測試細胞以便確定它們是否如所述物質(zhì)以預計方式調(diào)節(jié)表型反應的能力所測定的對theramutein具有活性?；蛘撸€可以根據(jù)本領域技術人員選擇用于研究的特定表型反應的不同取代不表達prototheramutein的對照細胞。然后檢測物質(zhì)對測試細胞的作用，并且任選地同時或在另一時間測試對對照細胞的作用，并且比較結果。

在本發(fā)明的一個實施方案中，根據(jù)以例如與prototheramutein的已知調(diào)節(jié)劑改變表達prototheramutein的對照細胞的表型反應相同的方式調(diào)節(jié)測試細胞的表型反應的能力快速鑒定對測試細胞具有活性的物質(zhì)。在另一個實施方案中，可以通過調(diào)節(jié)測試細胞中theramutein的活性而對未修飾(不表達prototheramutein和/或theramutein)的對照細胞幾乎或沒有作用的能力來鑒定活性物質(zhì)。例如，本領域技術人員易于理解該手段的許多變化形式可以用于鑒定為對theramutein更為有效或?qū)rototheramutein和一種或多種相應的具體theramuteins等效的調(diào)節(jié)劑。

可以觀察到和/或測定其它表型反應，并且包括：例如，檢測prototheramutein的底物和檢測通過theramutein活性調(diào)節(jié)的基因表達的改變。在最簡單的術語中，本領域技術人員預先建立的與theramutein的功能活性相關性的細胞的任意特征適用于這類方法。然而，在選擇指定特征的過程中，本領域技術人員必須首先按照作為本文詳述中給出的教導驗證所述的特征滿足作為表型反應的標準。本領域技術人員還可以希望將使用表達theramutein的細胞的表型反應與表達prototheramutein的細胞的表型反應校準。

可以通過本領域技術人員眾所周知的各種方法測定適合于檢測的特征。這類方法包括但不限于：檢測適當標記的蛋白質(zhì)的熒光(FACS)；用于檢測蛋白質(zhì)表達的免疫組織化學(IHC)；競爭放射性配體結合測定；固相基質(zhì)印跡技術，諸如細胞提取物的RNA印跡、DNA印跡和蛋白質(zhì)印跡；逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)；酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)；磷酸化測定；凝膠阻留測定；膜電位干擾等?？梢栽谑褂脺y試物質(zhì)處理后檢測完整細胞上的相關表型特征，或者在使用測試物質(zhì)處理完整細胞后檢測在細胞的亞細胞部分上的相關表型特征。

一旦鑒定了對表達theramutein的測試細胞具有所需作用的化合物，就需要(但不一定)獨立地驗證所鑒定的化合物通過直接結合機制對theramutein發(fā)揮其作用，即按照本發(fā)明的教導，這些化合物滿足作為theramutein的抑制劑或活化劑(作為理想的)的標準(讀者如上所述涉及的術語"活化劑"和"抑制劑"的定義)。可以使用本領域技術人員公知的大量標準結合測定法達到這一目的，包括純化的蛋白質(zhì)樣品或使用用合適的prototheramutein或theramutein轉(zhuǎn)染的細胞與如通過聲科學法所述的合適的對照品進行的完整細胞結合測定法。由于這類方法為本領域中充分確立的，所以不在此處重復它們。大量參考文獻文本綜合討論了這類技術(例如，參見Foreman和Johansen,2002；Enna S.J.等(1991)Current Protocols in Pharmacology,Wiley&Sons,Incorporated；Bonifacino,J.S.等(1999)Current Protocols in Cell Biology,Wiley&Sons,Incorporated).還參見Housey,G.M.1988,Chapter 4及其中的參考文獻；另外，參見Horowitz等,1981。

在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，該方法用于鑒定為p210^{Bcr-Abl-T315I}theramutein的抑制劑的物質(zhì)。使用標準方法在Ba/F3(鼠)細胞中各自表達prototheramutein和theramutein，并且觀察到的表型反應為生長特征(謹慎確定的細胞培養(yǎng)物的末端細胞密度和在沒有白細胞介素-3(IL-3)存在下的生長)。還可以任選使用未修飾的宿主細胞或僅含有表達載體的宿主細胞或它們兩者。在另一個實施方案中，將測試細胞單獨與或不與涉及的已知抑制劑或活化劑一起使用。

另一種有用的測定法為測定p210^{Bcr-Abl-T315I}的直接底物的磷酸化狀態(tài)。一種這類底物為Crkl(Gorre等,Science 293：876-80(2001))，即一種介導Bcr-Abl與Ras之間的連接的銜接蛋白。CRKL的磷酸化狀態(tài)為細胞中p210^Bcr-Abl的信號傳導活性的代表。另一種下游底物為p62DOK。對這些目的而言，任意這類底物均可滿足，當然，條件是已經(jīng)證實所述底物的磷酸化在細胞內(nèi)部發(fā)生，并且不非簡單地如上所述為TOI或PTOI的自磷酸化活動。還可以監(jiān)測其它信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)成分，包括src族激酶、STAT5、PI3激酶、raf激酶、RAS、MEK、ERK1和ERK2、JNK1、2和3、MLK1、2和3、MKK4、MKK7、AKT、mTOR、HSP90等。

作為本文中的典型，已經(jīng)鑒定了T315I theramutein的抑制劑。此外，這些抑制劑還對野生型prototheramutein p210^Bcr-Abl-wt具有不同程度的活性。

按照本發(fā)明，對需要的哺乳動物給予治療有效量的調(diào)節(jié)p210^Bcr-Abl theramutein的功能活性的一種或多種化合物。本文所用的術語“給予”指的是通過可以實現(xiàn)尋找的結果的任意方法將本發(fā)明的化合物遞送給哺乳動物。例如，可以通過口服、非腸道(靜脈內(nèi)或肌內(nèi))、局部、透皮或通過吸入給予它們。本文所用的術語“哺乳動物”用以包括，但不限于人、實驗室動物、馴養(yǎng)寵物和農(nóng)場動物?！爸委熡行Я俊敝傅氖窃趯Σ溉閯游锝o藥時有效產(chǎn)生所需治療作用，諸如抑制激酶活性、抑制癌細胞生長和分裂等的化合物用量。

本發(fā)明提供了治療哺乳動物疾病的方法，通過對該哺乳動物給予有效量的theramutein的調(diào)節(jié)劑來進行。按照本發(fā)明治療的合適的疾病包括但不限于已經(jīng)對預先給予的藥物產(chǎn)生抗性的復發(fā)性腫瘤或其它增殖性病癥。該方法還用于克服個體中存在對因治療靶標中的等位基因差異產(chǎn)生的藥物治療的敏感性方面的變化形式。例如，已經(jīng)廣泛證實了在CML中p210^Bcr-Abl酪氨酸激酶信號傳導的作用，因為p210^Bcr-Abl的theramuteins在CML的藥物抗性復發(fā)中具有作用。此外，不同的p210^Bcr-Abl的突變蛋白表現(xiàn)出對p210^Bcr-Abl的抑制劑的可變敏感性。盡管某些theramuteins在藥物療法過程中出現(xiàn)，但是其它可能預先存在于群體中。對后面這些實例并不公認為theramuteins，直到疾病狀態(tài)隨之發(fā)生并且隨后用已知類型的治療劑治療時為止。僅在所述治療后，這類預先存在的theramuteins顯示出其自身在導致隱含theramutein的患者中的疾病發(fā)展的相對非-反應性方面的臨床顯著性。

在本發(fā)明的一個實施方案中，給予theramutein調(diào)節(jié)劑與一種或多種抗腫瘤劑。可以使用任意合適的抗腫瘤劑，諸如化療劑、放射或其組合?？鼓[瘤藥可以為烷化劑或抗代謝物。烷化劑的實例包括但不限于順鉑、環(huán)磷酰胺、美法侖和達卡巴嗪?？勾x物的實例包括但不限于多柔比星、柔紅霉素和紫杉醇、吉西他濱和拓撲異構酶抑制劑伊立替康(CPT-11)、氨基喜樹堿、喜樹堿、DX-8951f、托泊替康(拓撲異構酶I抑制劑)和依托泊苷(VP-16；拓撲異構酶II抑制劑)和替尼泊苷(VM-26；拓撲異構酶II抑制劑)。當抗腫瘤藥為放射時，放射源可以在所治療患者的體外(外線束放療-EBRT)或體內(nèi)(近距離放射療法-BT)。所給予的抗腫瘤劑的劑量取決于許多因素，包括：例如，活性劑的類型、所治療的腫瘤的類型和嚴重程度以及活性劑的給藥途徑。然而，應強調(diào)本發(fā)明并不限于任何特定的劑量、給藥途徑或合并給予theramutein條件的化療劑或其它治療方案的組合。

可以將目前本領域中公知或評價的抗腫瘤劑分成不同類型，包括：例如，有絲分裂抑制劑；烷化劑；抗代謝物；嵌入抗生素；生長因子抑制劑；細胞周期抑制劑；酶；拓撲異構酶抑制劑；抗存活劑；生物學反應修飾劑；抗激素和抗血管發(fā)生劑，可以將所有這類活性劑與theramuteins的抑制劑或活化劑一起給藥。

可以將theramutein的調(diào)節(jié)劑與中和涉及腫瘤生長的其它受體的抗體一起給藥。此外，可以將theramutein的調(diào)節(jié)劑與另外調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導途徑的成分，優(yōu)選與在一種或多種其它信號轉(zhuǎn)導途徑中具有活性并且對這些途徑而言為常見的信號轉(zhuǎn)導途徑中的成分一起給藥。在本發(fā)明的一個實施方案中，將theramutein調(diào)節(jié)劑與特異性結合表皮生長因子受體(EGFR)的受體拮抗劑聯(lián)用。特別優(yōu)選抗原結合蛋白，這些蛋白結合EGFR的胞外域并且阻斷結合其配體中的一種或多種和/或中和配體-誘導的EGFR活化。EGFR拮抗劑可以為結合EGFR或EGFR配體并且抑制和EGFR與其配體結合的抗體。EGFR的配體的實例包括：例如，EGF、TGF-α、雙調(diào)蛋白、肝素-結合EGF(HB-EGF)和β動物纖維素。認為EGF和TGF-α為導致EGFR-介導的刺激的主要內(nèi)源性配體，不過，已經(jīng)證實TGF-α在促進血管發(fā)生中更為有效。應理解EGFR拮抗劑可以在外部結合EGFR的胞外部分，可以抑制，也可以不抑制配體的結合，或在化學活性劑的情況下，在內(nèi)部結合酪氨酸激酶結構域。結合EGFR的EGFR拮抗劑的實例包括但不限于生物制劑，諸如對EGFR具有特異性的抗體(及其功能等效物)；和化學活性劑(小分子)，諸如對EGFR的胞質(zhì)域直接起作用的合成激酶抑制劑。

腫瘤發(fā)生中涉及的生長因子受體的其它實例為血管內(nèi)皮生長因子(VEGFR-1和VEGFR-2)、血小板衍生的生長因子(PDGFR)、神經(jīng)生長因子(NGFR)、成纖維細胞生長因子(FGFR)等的受體。

在聯(lián)合療法中，在使用另一種活性劑開始治療之前、過程中或之后給予theramutein抑制劑及其任意的組合，即在使用抗腫瘤藥療法開始之前和過程中，在之前和之后，在過程中和之后或在之前、過程中和之后。例如，可以在開始放療前1-30天，優(yōu)選3-20天，更優(yōu)選5-12天給予theramutein抑制劑。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，在使用抗體療法前、與之同時或更優(yōu)選在其后給予化療。

在本發(fā)明中，可以將任意合適的方法或途徑用于給予本發(fā)明的theramutein抑制劑，并且任選共同給予抗腫瘤劑和/或其它受體拮抗劑。按照本發(fā)明使用的抗腫瘤藥方案包括認為最適合于治療患者腫瘤病情的任意方案。不同的惡性腫瘤可能需要使用特異性抗腫瘤抗體和特異性抗腫瘤劑，這需要基于患者與患者的不同來決定。給藥途徑包括：例如，口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌內(nèi)給藥。給予的拮抗劑劑量取決于許多因素，包括：例如，拮抗劑的類型、所治療的腫瘤的類型和嚴重程度以及拮抗劑的給藥途徑。然而，應強調(diào)本發(fā)明并不限于任何特定的方法和給藥途徑。

合適的載體包括：例如，水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一種或多種及其組合。載體可以進一步包括少量輔助物質(zhì)，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑，它們可以增加作為活性組分的theramutein調(diào)節(jié)劑的貯存期限或有效性。作為本領域眾所周知的，可以將組合物配制成對哺乳動物給藥后使活性組分快速、持續(xù)或延緩釋放的劑型。

本發(fā)明的組合物可以為各種形式。它們包括：例如，固體、半固體和液體劑型，諸如片劑、丸劑、粉劑、液體溶液、分散液或混懸液、脂質(zhì)體、栓劑、可注射和可輸注溶液。優(yōu)選的劑型取決于指定的給藥方式和治療應用。

可以按照制藥領域中眾所周知的方式制備本發(fā)明的這類組合物。在制備組合物的過程中，通常將活性組分與載體混合或用載體稀釋組合物和/或?qū)⒔M合物包封在載體內(nèi)，所述的載體用作稀釋劑，它可以為固體、半固體或液體物質(zhì)，它起活性組分的媒介物、賦形劑或介質(zhì)的作用。因此，組合物可以為片劑、錠劑、小藥囊、扁囊劑、酏劑、混懸液、氣溶膠(作為固體或在液體介質(zhì)中)、含有例如達10％重量的活性化合物的軟膏劑、軟和硬明膠膠囊、栓劑、注射溶液、混懸液、無菌包裝的粉末和作為局部貼劑。

應理解可以將本發(fā)明的方法和組合物對任意合適的哺乳動物給藥，諸如家兔、大鼠或小鼠。更優(yōu)選所述的哺乳動物為人。

本發(fā)明的化合物還可以作為鹽存在。在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選給予藥物上可接受的鹽。藥物上可接受的鹽指的是本發(fā)明化合物的酸加成的鹽或堿加成的鹽，其中將所得抗衡離子理解為在本領域中一般對藥物應用而言是可接受的。藥物上可接受的鹽可以為本發(fā)明化合物與無機酸或有機酸形成的鹽。優(yōu)選得到與無機酸形成的鹽，所述的無機酸諸如：例如，鹽酸、氫溴酸、磷酸或硫酸，或優(yōu)選得到與有機羧酸或磺酸形成的鹽，所述的有機羧酸或磺酸諸如：例如，乙酸、馬來酸、富馬酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸、苯甲酸或甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸或萘二磺酸。藥物上可接受的鹽還可以為本發(fā)明化合物的金屬或銨鹽。特別優(yōu)選得到：例如，鈉、鉀、鎂或鈣的鹽，并且還特別優(yōu)選得到來源于氨或有機胺類的銨鹽，所述的有機胺類諸如：例如，乙胺、二-或三乙胺、二-或三乙醇胺、二環(huán)己胺、二甲氨基乙醇、精氨酸、賴氨酸、乙二胺或2-苯乙胺(參見Berge等J.Pharm.Sci.1977,66,1-19)。

1.在本申請的上下文中，參照了各種公開文獻、參考文獻正文、教科書、技術手冊、專利和專利公開文獻。將這些公開文獻、專利、專利申請和其它對比文件教導的和披露的內(nèi)容完整地引入本申請作為參考，以便更完整地描述本發(fā)明涉及的本領域的狀態(tài)。

2.應理解和預計本領域技術人員可以實施本文披露的本發(fā)明的原理的變化形式并且認為這類變型包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

3.下列實施例進一步解釋本發(fā)明，但不應視為以任何方式限定本發(fā)明的范圍。常用方法，諸如那些用于載體和質(zhì)粒構建、將編碼多肽類的基因插入這類載體和質(zhì)粒、將質(zhì)粒導入宿主細胞以及基因和基因產(chǎn)物的表達及其測定的方法的詳細描述可以獲自大量公開文獻，包括：Sambrook,J等,(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2^nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Coligan,J.等(1994)Current Protocols in Immunology,Wiley&Sons,Incorporated；Enna,S.J.等(1991)Current Protocols in Pharmacology,Wiley&Sons,Bonifacino,J.S.等(1999)Current Protocols in Cell Biology,Wiley&Sons；和U.S.Patent4,980,281。將所有本文提及的參考文獻完整地引入。

實施例

p210^{Bcr-Abl-T315I}為對甲磺酸伊馬替尼的抑制作用產(chǎn)生抗性的p210Bcr-Abl蛋白質(zhì)(p210^Bcr-Abl)的theramutein(Gleevec,STI-571)。315位上的突變將蘇氨酸轉(zhuǎn)化成異亮氨酸殘基，并且為在抗性或復發(fā)性患者中觀察到的幾種突變之一。然而，這種特定的突變體為鑒定的最具抗性的這類theramutein。

為用于超表達p210^{Bcr-Abl-T315I} theramutein改造的Ba/F3細胞系測定表型反應。測定相對于未轉(zhuǎn)化的Ba/F3細胞和表達p210^Bcr-Abl-wt prototheramutein的Ba/F3細胞而言的表型反應。表型反應為T315I突變體在類似的培養(yǎng)條件下生長至高于對照組的未轉(zhuǎn)化Ba/F3細胞系的細胞飽和密度并且在維持對照組未轉(zhuǎn)化的Ba/F3細胞系所需的白細胞介素3(IL-3)不存在下生長的能力。按照上述給出的教導定義和表征表型反應。

使用的檢測系統(tǒng)為高速細胞成像和計數(shù)系統(tǒng)，其中將3μl的細胞樣品體積順序通過5μl光學微量比色池注射、數(shù)字成像并且以電方式貯存、掃描且然后計數(shù)，所有操作均在基于微型計算機的控制系統(tǒng)中進行。該系統(tǒng)具有對來自小至500μl的培養(yǎng)物的樣品進行直接細胞計數(shù)的能力，并且提供來自含有少至12,500個細胞的培養(yǎng)樣品的具有統(tǒng)計學意義的總細胞計數(shù)。所有展示出細胞計數(shù)和存活率試驗的圖均使用數(shù)據(jù)獲取和分析用的該系統(tǒng)。在進行細胞計數(shù)的同時，該系統(tǒng)還能夠通過區(qū)分計數(shù)、成像的細胞測定總體細胞存活率，所述的計數(shù)、成像的細胞從吸收錐蟲藍染料(計為"未存活"細胞)的細胞中排除錐蟲藍(計為"存活"細胞)。將錐蟲藍注入細胞樣品，此后即刻依次將樣品注入微量比色池以便同時進行細胞計數(shù)和成像。

將系統(tǒng)整合入高流通量篩選裝置的工作流程以便提供靈敏和精確的細胞計數(shù)和細胞存活率試驗系統(tǒng)，它更可靠并且較不易于發(fā)生基于代謝存活率的細胞試驗，諸如XTT或Alamar藍的混雜效應。

最初，以一般在10-20μM范圍的濃度篩選約113,000種化合物，以便鑒定能夠通過任意方式影響超表達p210^{Bcr-Abl-T315I} theramutein的Ba/F3細胞(Ba/F3T315I細胞)生長的亞群。

總計約11,760種化合物表現(xiàn)出大于50％的生長抑制作用，認為這相當于約4500種不同的化學類型。使用相同細胞系重新測試這些化合物產(chǎn)生了化合物反應性數(shù)據(jù)庫，然后將其分類并且根據(jù)表現(xiàn)出最高總體生長抑制作用的那些化合物進行等級排序。然后在使用Ba/F3T315I作為測試細胞和野生型Ba/F3作為對照細胞的確定的基于細胞的試驗系統(tǒng)中按照本發(fā)明的方法從該等級排序的數(shù)據(jù)庫中重新篩選最高評分的130種化合物(基于在測試化合物的最低濃度下觀察到的最大程度的生長抑制作用)。所關注的化合物為那些與未轉(zhuǎn)化的野生型Ba/F3細胞相比區(qū)別抑制表達p210^{Bcr-Abl-T315I} theramutein的Ba/F3細胞生長的化合物。鑒定滿足所需標準的6種化合物并且還使用Ba/F3p210^Bcr-Abl-wt細胞系(Ba/F3P210細胞)進一步詳細分析這些化合物中的某些。因缺乏可利用的來自化學供應商的額外物質(zhì)而導致一種化合物不能用于進一步測試。在使用上述細胞系的額外基于細胞的試驗和使用分離自野生型P210Bcr-Abl和P210T315I突變體激酶結構域的人重組產(chǎn)生的120Kd激酶結構域片段的不含細胞的純化蛋白激酶試驗中獨立地評價剩余的5種化合物。

所有5種化合物均如自磷酸化活性抑制所測定的抑制p210^{Bcr-Abl-T315I} 120Kd活性，如附圖4中所示。因此，在篩選的113,000種以上的化合物中的6種最高評分的化合物中，這6種中的至少5種直接抑制p210^{Bcr-Abl-T315I}突變體。值得注意的是，化合物5看起來在SDS聚丙烯酰胺凝膠上使重組蛋白質(zhì)帶鋪展開。這種情況在銀染色的凝膠上也是明顯的(數(shù)據(jù)未顯示)?？赡艿那闆r是這種化合物實際上可以為能夠共價交聯(lián)POI以便持久抑制其活性的"自殺"抑制劑，但這一結果需要進一步研究。

本文所述的教導和結果共同提供了結論性證據(jù)，即該系統(tǒng)能夠鑒定選擇的theramutein的抑制劑或活化劑，并且本領域技術人員立即意識到這類系統(tǒng)在僅進行顯而易見的最小變型的情況下就易應用于任意其它theramutein。

證實Ba/F3T315I細胞系與野生型未轉(zhuǎn)化Ba/F3細胞相比的生長抑制作用的基于細胞的試驗結果的有代表性的實例如附圖1和2中所示。這些化合物在野生型Ba/F3未轉(zhuǎn)化細胞(不表達p210^Bcr-Abl-wt或p210^{Bcr-Abl-T315I})的生長和存活率相對不受影響的濃度下抑制表達T315I theramutein的細胞生長并且降低其存活率，而表達prototheramutein和theramutein的細胞基本上得到抑制。在某些情況中，對表達T315I的細胞的抑制程度甚至大于對表達P210prototheramutein的細胞的抑制程度(例如，參見附圖3，右手側(cè)，化合物3對P210和T315I細胞的結果。

概括地說，本文提供的方法提供了用于產(chǎn)生或鑒定任意指定theramutein的調(diào)節(jié)劑的可推廣方法形式的基本發(fā)展。結果結論性地證實了該方法在鑒定關鍵需求的化合物方面的能力，這些化合物用于克服在某些患者群體中一致性地成為致命性的并且目前不可治療的具體類型的獲得性藥物抗性。此外，對本領域技術人員顯而易見的是，可以使用顯而易見的變型將本文所述的技術和方法直接廣泛應用于任何具有臨床意義的可能的theramutein。

值得注意的是，在100,000種以上化合物的初步篩選中，其中約10,000種化合物表現(xiàn)出一定程度的生長抑制作用，當使用本文詳述的方法重新篩選最有效的生長抑制物質(zhì)時，鑒定了6種不同的化合物并且隨后測試的所有化合物在使用T315I突變體的不含細胞的純化蛋白激酶試驗中均表現(xiàn)出了抑制活性(一種化合物不能用于進一步測試)?；谶@類值得注意的結果，本領域技術人員立即明確基于上述部分和引入本文作為參考的對比文件中的教導的表型反應的適當選擇和確定，該方法可以有效地應用于鑒定任意theramutein的抑制劑或活化劑。例如，本領域技術人員使用上述知識容易地設計分析系統(tǒng)來鑒定來源于其它prototheramuteins的theramuteins的抑制劑，已知所述的其它prototheramuteins顯示出賦予藥物抗性的突變，諸如c-kit基因產(chǎn)物或表皮生長因子(EGF)受體(EGFR)或血小板衍生的生長因子(PDGF)受體α和β。在使用該方法時，就方法用于在其相應的表型反應是可檢測的任意哺乳動物細胞類型中表達的任意指定theramutein的能力而言，推斷應沒有限制。

將所有涉及的任意公開文獻、專利或其它引用的參考文獻引入本文作為參考。

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本發(fā)明涉及以下實施方式：

1.治療人腫瘤性疾病或增殖性障礙的方法，包括給予治療有效量的具有通式I的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

各個R¹²和R¹³獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；或R¹²和R¹³可以與它們所連接的氮一起形成可以任選含有一個額外雜原子的5-至7-元環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R²選自-CR²¹_a-、-NR²²_b-和-(C＝R²³)-；

各個R²¹獨立地選自H、鹵素、-NH₂、-N(H)(C_1-3烷基)、-N(C_1-3烷基)₂、-O-(C_1-3烷基)、OH和C_1-3烷基；

各個R²²獨立地選自H和C_1-3烷基；

R²³選自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

R³選自-CR³¹_c-、-NR³²_d-和-(C＝R³³)-；

各個R³¹基團選自H、鹵素、-NH₂、-N(H)(R⁰),-N(R⁰)₂、-O-R⁰,OH和C_1-3烷基；

各個R³²基團選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、

C(O)R⁰、芳基和雜環(huán)；

R³³選自O、S、N-R³⁴和N-OR⁰；

R³⁴選自H、NO₂、CN、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁴選自-CR⁴¹_e-、-NR⁴²_f-、-(C＝R⁴³)-和-O-；

各個R⁴¹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

各個R⁴²基團選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、

C(O)R⁰、芳基和雜環(huán)；

各個R⁴³選自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

條件是當R²為-NR²²_b-且R⁴為-NR⁴²_f-時，R³不為-NR³²_d-；且R³和R⁴不同時分別選自-(C＝R³³)-和-(C＝R⁴³)-；

R⁵選自-Y-R⁶和-Z-R⁷；

Y選自化學鍵、O、NR⁰；

R⁶選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁷為H或選自芳基和雜環(huán)；

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

a為1或2；

b為0或1；

c為1或2；

d為0或1；

e為1或2；并且

f為0或1。

2.實施方式1所述的方法，其中X¹為N。

3.實施方式2所述的方法，其中X²為N。

4.實施方式1所述的方法，包括給予治療有效量的具有通式I_a的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R²²各自獨立地選自H和C_1-3烷基；

R³選自-CR³¹_c-、-NR³²_d-和-(C＝R³³)-；

各個R³¹基團選自H、鹵素、-NH₂、-N(H)(R⁰)、-N(R⁰)₂、-O-R⁰、OH和C_1-3烷基；

各個R³²基團選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、

C(O)R⁰、芳基和雜環(huán)；

R³³選自O、S、N-R³⁴和N-OR⁰；

R³⁴選自H、NO₂、CN、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁴選自-CR⁴¹_e-、-NR⁴²_f-、-(C＝R⁴³)-和-O-；

各個R⁴¹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

各個R⁴²基團選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、

C(O)R⁰、芳基和雜環(huán)；

各個R⁴³選自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

條件是當R⁴為-NR⁴²_f-時，R³不為-NR³²_d-；且R³和R⁴不同時分別選自-(C＝R³³)-和-(C＝R⁴³)-；

R⁵選自-Y-R⁶和-Z-R⁷；

Y選自化學鍵、O、N-R⁰；

R⁶選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁷為H或選自芳基和雜環(huán)；

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

a為1或2；

b為0或1；

c為1或2；

d為0或1；

e為1或2；且

f為0或1。

5.實施方式4所述的方法，其中X¹為N。

6.實施方式5所述的方法，其中X²為N。

7.實施方式1所述的方法，包括給予治療有效量的具有通式I_b的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

各個R²²獨立地選自H和C_1-3烷基；

各個R³²基團選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、

C(O)R⁰、芳基和雜環(huán)；

R⁴選自-CR⁴¹_e-、-(C＝R⁴³)-和-O-；

各個R⁴¹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

各個R⁴³選自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

R⁵選自-Y-R⁶和-Z-R⁷；

Y選自化學鍵、O、N-R⁰；

R⁶選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁷為H或選自芳基和雜環(huán)；

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

a為1或2；

b為0或1；

c為1或2；

d為0或1；

e為1或2；且

f為0或1。

8.實施方式7所述的方法，其中X¹為N。

9.實施方式8所述的方法，其中X²為N。

10.實施方式1所述的方法，包括給予治療有效量的具有通式II的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R⁸選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)組成的組；

R⁹選自-Y-R⁶和-Z-R⁷；

Y選自化學鍵、O、N-R⁰；

R⁶選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁷為H或選自芳基和雜環(huán)；且

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

11.實施方式10所述的方法，其中X¹為N。

12.實施方式11所述的方法，其中X²為N。

13.實施方式1所述的方法，包括給予治療有效量的具有通式II_a的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R⁸選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)組成的組；

X³為N、CH或C-R⁵⁰；

R⁵¹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

r為0-4；

s為0-4；

m為0-4；且

R⁰各自獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

14.實施方式13所述的方法，其中X¹為N。

15.實施方式14所述的方法，其中X²為N。

16.實施方式1所述的方法，包括給予治療有效量的具有通式II_b的化合物：

其中：

R¹⁴選自H和F；

R⁸選自選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)組成的組；

X³為N、CH或C-R⁶⁰；

各個R⁶⁰獨立地選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR⁰、鹵素、芳基和雜環(huán)組成的組；

R⁶¹選自芳基和雜環(huán)；

R⁶²選自芳基和雜環(huán)；

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

h為0-4；

i為0-4；且

j為0-4。

17.實施方式1所述的方法，包括給予治療有效量的具有通式III的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R¹⁰選自-Y'-R¹⁸；

R¹⁸選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CF₃、芳基和雜環(huán)組成的組；且

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

18.實施方式17所述的方法，其中X¹為N。

19.實施方式18所述的方法，其中X²為N。

20.實施方式1所述的方法，包括給予治療有效量的具有通式III_a的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

X³為N、CH或C-R⁵⁰；

R⁵¹選自H、烷基、環(huán)烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

r為0-4；

s為0-4；

m為0-4；且

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

21.實施方式20所述的方法，其中X¹為N。

22.實施方式21所述的方法，其中X²為N。

23.實施方式1所述的方法，包括給予治療有效量的具有通式IV的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R²²選自H和C_1-3烷基；

R³⁴選自H、NO₂、CN、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁴⁴選自H、烷基、環(huán)烷基、-(C＝O)R⁰、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁴⁵選自-Y"-R¹⁹；

Y"選自化學鍵、O、NR⁰-和帶有1-4個碳原子并且任選地被鹵素、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、C(O)N(R⁰)₂、CN、CF₃、N(R⁰)₂、NO₂和OR⁰中的一個或多個取代的烴鏈；

R¹⁹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CF₃、芳基和雜環(huán)；且

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

24.實施方式23所述的方法，其中X¹為N。

25.實施方式24所述的方法，其中X²為N。

26.實施方式1所述的方法，包括給予治療有效量的具有通式V的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R²²選自H和C_1-3烷基；

R³⁴選自H、NO₂、CN、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁵⁵選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁵⁶選自-Y"-R¹⁹；

R¹⁹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CF₃、芳基和雜環(huán)組成的組；且

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

27.實施方式26所述的方法，其中X¹為N。

28.實施方式27所述的方法，其中X²為N。

29.實施方式1所述的方法，包括給予治療有效量的具有通式V_a的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R⁵⁵選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

X³為N或C-R⁵⁰；

R⁵¹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

r為0-4；

s為0-4；

m為0-4；且

R⁰各自獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

30.實施方式29所述的方法，其中X¹為N。

31.實施方式30所述的方法，其中X²為N。

32.實施方式1所述的方法，包括給予治療有效量的具有通式VI的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R⁵⁵選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁵⁶選自-Y"-R¹⁹；

R¹⁹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CF₃、芳基和雜環(huán)組成的組；且

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

33.實施方式32所述的方法，其中X¹為N。

34.實施方式33所述的方法，其中X²為N。

35.實施方式1所述的方法，包括給予治療有效量的具有通式VI_a的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R⁵⁵選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

X³為N或C-R⁵⁰；

R⁵¹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

r為0-4；

s為0-4；

m為0-4；且

R⁰各自獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

36.實施方式35所述的方法，其中X¹為N。

37.實施方式36所述的方法，其中X²為N。

38.抑制P210^{BCR-ABL-T315I} theramutein的方法，包括對人給予具有通式I的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R²選自-CR²¹_a-、-NR²²_b-和-(C＝R²³)-；

各個R²¹獨立地選自H、鹵素、-NH₂、-N(H)(C_1-3烷基)、-N(C_1-3烷基)₂、-O-(C_1-3烷基)、OH和C_1-3烷基；

各個R²²獨立地選自H和C_1-3烷基；

R²³選自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

R³選自-CR³¹_c-、-NR³²_d-和-(C＝R³³)-；

各個R³¹基團選自H、鹵素、-NH₂、-N(H)(R⁰)、-N(R⁰)₂、-O-R⁰、OH和C_1-3烷基；

各個R³²基團選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳基和雜環(huán)；

R³³選自O、S、N-R³⁴和N-OR⁰；

R³⁴選自H、NO₂、CN、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁴選自-CR⁴¹_e-、-NR⁴²_f-、-(C＝R⁴³)-和-O-；

R⁴¹各自選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

各個R⁴²基團選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳基和雜環(huán)；

R⁴³各自選自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

條件是當R²為-NR²²_b-且R⁴為-NR⁴²_f-時，R³不為-NR³²_d-；且R³和R⁴不同時分別選自-(C＝R³³)-和-(C＝R⁴³)-；

R⁵選自-Y-R⁶和-Z-R⁷；

Y選自化學鍵、O、NR⁰；

R⁶選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

Z為帶有1-4個碳原子的烴鏈，并且任選地被鹵素、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、C(O)N(R⁰)₂、CN、CF₃、N(R⁰)₂、NO₂和OR⁰中的一個或多個取代；

R⁷為H或選自芳基和雜環(huán)；

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

a為1或2；

b為0或1；

c為1或2；

d為0或1；

e為1或2；且

f為0或1。

39.實施方式38所述的方法，包括給予治療有效量的具有通式I_a的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

各個R²²獨立地選自H和C_1-3烷基；

R³選自-CR³¹_c-、-NR³²_d-,和-(C＝R³³)-；

各個R³¹基團選自H、鹵素、-NH₂、-N(H)(R⁰)、-N(R⁰)₂、-O-R⁰、OH和C_1-3烷基；

各個R³²基團選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳基和雜環(huán)；

R³³選自O、S、N-R³⁴和N-OR⁰；

R³⁴選自H、NO₂、CN、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁴選自-CR⁴¹_e-、-NR⁴²_f-、-(C＝R⁴³)-和-O-；

各個R⁴¹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

各個R⁴²基團選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳基和雜環(huán)；

各個R⁴³選自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

條件是當R⁴為-NR⁴²_f-時，R³不為-NR³²_d-；且R³和R⁴不同時分別選自-(C＝R³³)-和-(C＝R⁴³)-；

R⁵選自-Y-R⁶和-Z-R⁷；

Y選自化學鍵、O、N-R⁰；

R⁶選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁷為H或選自芳基和雜環(huán)；

R⁰各自獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

a為1或2；

b為0或1；

c為1或2；

d為0或1；

e為1或2；且

f為0或1。

40.實施方式38所述的方法，包括給予具有通式I_b的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

各個R²²獨立地選自H和C_1-3烷基；

各個R³²基團選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳基和雜環(huán)；

R⁴選自-CR⁴¹_e-、-(C＝R⁴³)-和-O-；

R⁴¹各自選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

各個R⁴³選自O、S、N-R⁰和N-OR⁰；

R⁵選自-Y-R⁶和-Z-R⁷；

Y選自化學鍵、O、N-R⁰,

R⁶選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁷為H或選自芳基和雜環(huán)；

R⁰各自獨立地選自H、烷基,環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

a為1或2；

b為0或1；

c為1或2；

d為0或1；

e為1或2；且

f為0或1。

41.實施方式38所述的方法，包括給予具有通式II的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R⁸選自選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)組成的組；

R⁹選自-Y-R⁶和-Z-R⁷；

Y選自化學鍵、O、N-R⁰；

R⁶選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁷為H或選自芳基和雜環(huán)；且

R⁰各自獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

42.實施方式38所述的方法，包括給予具有通式II_a的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

各個R¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR¹¹、-(CH₂)_pC(O)(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pC(O)N(R¹²)(R¹³)、-(CH₂)_pC(O)O(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pN(R¹¹)C(O)R¹¹、(CH₂)_pN(R¹²)(R¹³)、-N(R¹¹)SO₂R¹¹、-OC(O)N(R¹²)(R¹³)、-SO₂N(R¹²)(R¹³)、鹵素、芳基和雜環(huán)組成的組，并且另外或可選地，相鄰環(huán)原子上的兩個R¹基團形成含有0-3個雜原子的5-或6-元稠合環(huán)；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R⁸選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)組成的組；

X³為N、CH或C-R⁵⁰；

R⁵¹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

r為0-4；

s為0-4；

m為0-4；且

R⁰各自獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

43.實施方式38所述的方法，包括給予具有通式II_b的化合物：

其中：

R¹⁴選自H和F；

R⁸選自選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)組成的組；

X³為N、CH或C-R⁶⁰；

各個R⁶⁰獨立地選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR⁰、鹵素、芳基和雜環(huán)組成的組；

R⁶¹選自芳基和雜環(huán)；

R⁶²選自芳基和雜環(huán)；

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

h為0-4；

i為0-4；且

j為0-4。

44.實施方式38所述的方法，包括給予具有通式III的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R¹⁰選自-Y'-R¹⁸；

R¹⁸選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CF₃、芳基和雜環(huán)組成的組；且

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

45.實施方式38所述的方法，包括給予具有通式III_a的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

R¹各自獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR¹¹、-(CH₂)_pC(O)(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pC(O)N(R¹²)(R¹³)、

-(CH₂)_pC(O)O(CH₂)_qR¹¹、-(CH₂)_pN(R¹¹)C(O)R¹¹、-(CH₂)_pN(R¹²)(R¹³)、-N(R¹¹)SO₂R¹¹、-OC(O)N(R¹²)(R¹³)、-SO₂N(R¹²)(R¹³)、鹵素、芳基和雜環(huán)組成的組，并且另外或可選地，相鄰環(huán)原子上的兩個R¹基團形成含有0-3個雜原子的5-或6-元稠合環(huán)；

n為0-6；

各個R¹¹各自獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

X³為N、CH或C-R⁵⁰；

各個R⁵⁰獨立地選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR⁵¹、-(CH₂)_rC(O)(CH₂)_sR⁵¹、-(CH₂)_rC(O)N(R⁵²)(R⁵³)、

-(CH₂)_rC(O)O(CH₂)_sR⁵¹、-(CH₂)_rN(R⁵¹)C(O)R⁵¹、-(CH₂)_rN(R⁵²)(R⁵³)、-N(R⁵¹)SO₂R⁵¹、-OC(O)N(R⁵²)(R⁵³)、-SO₂N(R⁵²)(R⁵³)、鹵素、芳基和雜環(huán)組成的組，并且另外或可選地，相鄰環(huán)原子上的兩個R⁵⁰基團形成含有0-3個雜原子的5-或6-元稠合環(huán)；

R⁵¹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

r為0-4；

s為0-4；

m為0-4；且

R⁰各自獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

46.實施方式38所述的方法，包括給予具有通式IV的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R²²選自H和C_1-3烷基；

R³⁴選自H、NO₂、CN、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁴⁴選自H、烷基、環(huán)烷基、-(C＝O)R⁰、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁴⁵選自-Y"-R¹⁹；

R¹⁹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CF₃、芳基和雜環(huán)組成的組；且

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

47.實施方式38所述的方法，包括給予具有通式V的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R²²選自H和C_1-3烷基；

R³⁴選自H、NO₂、CN、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁵⁵選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁵⁶選自-Y"-R¹⁹；

R¹⁹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CF₃、芳基和雜環(huán)組成的組；且

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

48.實施方式38所述的方法，包括給予具有通式V_a的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R⁵⁵選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

X³為N或C-R⁵⁰；

R⁵¹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

r為0-4；

s為0-4；

m為0-4；且

R⁰各自獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

49.實施方式38所述的方法，包括給予具有通式VI的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R⁵⁵選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

R⁵⁶選自-Y"-R¹⁹；

R¹⁹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CF₃、芳基和雜環(huán)組成的組；且

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

50.實施方式38所述的方法，包括給予具有通式VI_a的化合物：

其中：

環(huán)A為5-、6-或7-元環(huán)或7-至12-元稠合雙環(huán)；

X¹選自N、N-R⁰或C-R¹；

X²選自N、N-R⁰或C-R¹；

虛線表示任選的雙鍵；

n為0-6；

各個R¹¹獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

p為0-4；

q為0-4；

R⁵⁵選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

X³為N或C-R⁵⁰；

R⁵¹選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

r為0-4；

s為0-4；

m為0-4；且

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)。

51.具有通式II_b的化合物：

其中：

R¹⁴選自H和F；

R⁸選自選自H、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、CO₂R⁰、C(O)R⁰、芳烷基、芳基和雜環(huán)組成的組；

X³為N、CH或C-R⁶⁰；

各個R⁶⁰獨立地選自烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、CN、CF₃、NO₂、OR⁰、鹵素、芳基和雜環(huán)組成的組；

R⁶¹選自芳基和雜環(huán)；

R⁶²選自芳基和雜環(huán)；

各個R⁰獨立地選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基和雜環(huán)；

h為0-4；

i為0-4；且

j為0-4。

52.用于確定物質(zhì)是否為能夠引起可檢測到的表型反應的theramutein的抑制劑或活化劑的方法，該方法包括：

a)將以基本上恒定水平表達theramutein的第一種細胞與所述物質(zhì)一起溫育；

b)將以基本上恒定水平表達相應的prototheramutein的第二種細胞與已知的prototheramutein的抑制劑或活化劑一起溫育；

c)將第二種細胞對已知的prototheramutein的抑制劑或活化劑的表型反應與第一種細胞對所述物質(zhì)的表型反應進行比較；和

d)確定將第一種細胞的表型反應抑制或活化至至少與用已知的prototheramutein的抑制劑或活化劑抑制或活化第二種細胞的表型反應相同的程度，由此將所述物質(zhì)鑒定為theramutein的抑制劑或活化劑。

53.實施方式52所述的方法，其中表達theramutein的細胞對所述物質(zhì)的表型反應大于表達prototheramutein的細胞對已知的theramutein的抑制劑或活化劑的表型反應。

54.用于確定物質(zhì)是否為theramutein的特異性抑制劑或特異性活化劑的方法，該方法包括：

a)提供表達theramutein和產(chǎn)生可檢測到的表型反應的測試細胞；

b)用所述物質(zhì)處理該測試細胞；

c)檢驗處理的細胞以便確定是否可以通過用所述物質(zhì)處理調(diào)節(jié)表型反應。

55.實施方式52或54所述的方法，其中theramutein或prototheramutein為信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)的成分。

56.實施方式52或54所述的方法，其中theramutein或prototheramutein為酶。

57.實施方式52或54所述的方法，其中theramutein或prototheramutein為蛋白激酶。

58.實施方式52或54所述的方法，其中theramutein或prototheramutein為酪氨酸激酶。

59.實施方式52或54所述的方法，其中theramutein或prototheramutein為受體酪氨酸激酶。

60.實施方式52或54所述的方法，其中prototheramutein為p210^Bcr-Abl。

61.實施方式52或54所述的方法，其中theramutein為p210^Bcr-Abl的T315I突變體。

62.實施方式52或54所述的方法，其中表型反應為細胞的培養(yǎng)、形態(tài)或瞬時特征的改變。

63.實施方式52或54所述的方法，其中表型反應包括theramutein胞內(nèi)底物的磷酸化。

64.實施方式52或54所述的方法，其中在細胞的亞細胞部分上檢測到表型反應。

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該技術已申請專利。僅供學習研究，如用于商業(yè)用途，請聯(lián)系技術所有人。
技術研發(fā)人員：杰勒德·M·豪斯;
技術所有人：杰勒德·M·豪斯;
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