本發(fā)明涉及重組單純皰疹病毒，具體地指一種重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP及其對應(yīng)的診斷試劑盒。

背景技術(shù)：

端粒是真核生物染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，其作用是維護(hù)染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，包括防止染色體末端融合，保護(hù)染色體結(jié)構(gòu)基因和避免遺傳信息在復(fù)制中丟失。端粒酶是由小分子RNA和蛋白質(zhì)組成的逆轉(zhuǎn)錄酶,能利用自身RNA為模板合成端粒DNA,彌補(bǔ)隨細(xì)胞有絲分裂逐漸縮短的端粒。其有三個主要組成部分：人端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)、端粒酶相關(guān)蛋白(telomerase-associated protein,TP1/TLP1)、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)。端粒酶RNA在大多數(shù)細(xì)胞中都表達(dá),而人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶是端粒酶的限速成分，僅在端粒酶陽性的細(xì)胞中表達(dá)，與端粒酶活性相關(guān)。盡管一些腫瘤細(xì)胞在重組時通過替代性端粒延長(alternative lengthening of telomeres,ALT)機(jī)制來維持端粒長度,但仍有90％以上的腫瘤細(xì)胞通過上調(diào)hTERT來活化端粒酶，而且hTERT僅在極少數(shù)正常體細(xì)胞中表達(dá)?，F(xiàn)已知端粒酶啟動子(hTERTp)僅在端粒酶活性高的細(xì)胞中啟動轉(zhuǎn)錄過程，這就為腫瘤靶向治療提供了一個很好的契機(jī)。

單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)表達(dá)的感染細(xì)胞蛋白(infected cell proteins,ICPs)分為三個等級：初始(immediate early,IE)、早期(early)和晚期(late)。其中IE蛋白是影響病毒復(fù)制的關(guān)鍵蛋白，包括：ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47，而其中ICP4是最關(guān)鍵的復(fù)制相關(guān)蛋白。如果將ICP4基因的固有啟動子置換成hTERTp，就有可能使HSV選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)繁殖。

人工合成人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子(hTERTp)以替換實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有I型溶瘤單純皰疹病毒(17+毒株)基因組中ICP4原啟動子，構(gòu)建出一種新型病毒HSV-hTERTp_ICP4。該重組病毒能選擇性地在人腫瘤細(xì)胞內(nèi)生長繁殖，而不在人的正常細(xì)胞中繁殖。

構(gòu)建含hTERTp_ICP4表達(dá)盒的質(zhì)粒是構(gòu)建的HSV-hTERTp_ICP4病毒的基礎(chǔ)，用含hTERTp_ICP4表達(dá)盒的質(zhì)粒，我們構(gòu)建了原始的HSV-hTERTp_ICP4，該重組病毒雖然可以選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)繁殖，但繁殖滴度較低(10⁴/ml)。

為了解決繁殖滴度較低的缺陷，迫切需要構(gòu)建一種繁殖滴度較高的病毒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決現(xiàn)有病毒繁殖滴度較低的缺陷，提供了一種重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP，該病毒具有選擇性地高滴度繁殖力，病毒在肝癌細(xì)胞繁殖滴度穩(wěn)定在10⁶以上。

本發(fā)明還提供了一種由重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP制備得到的診斷試劑盒。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP，所述病毒的基因組上的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子和ICP4基因之間插入長度為25bp的DNA片段，且ICP34.5位點(diǎn)插入了GFP表達(dá)盒，其中，DNA片段序列為TTGCCCCAAGCGGCATTTGGGTTCA。

一種重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP的制備方法，包括以下步驟：

1)用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp取代含有ICP4基因的單純皰疹病毒中的ICP4基因啟動子，構(gòu)建該重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4：

(1)構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pICP4del-hTERTp_ICP4和pICP4del-eGFP

a.用BHK細(xì)胞培養(yǎng)含有ICP4基因的單純皰疹病毒，并純化其基因組DNA；

b.擴(kuò)增ICP4基因上游側(cè)翼序列：以步驟a)中所得病毒基因組DNA為模板，用以下ICP4USf正向引物和ICP4USr反向引物：

ICP4USf正向引物：ccctccagacgcaccggagtcggggg，

ICP4USr反向引物：aagtcgactctagaggatcgatctctgacctgagattggcggcactgaggta

擴(kuò)增出ICP4基因上游側(cè)翼序列；

c.擴(kuò)增ICP4基因下游側(cè)翼序列：以步驟a中所得病毒基因組DNA為模板，用以下ICP4DSf正向引物和ICP4USr反向引物：

ICP4DSf正向引物：aaaagtcgacctgcaggcatgctaacgaggaacgggcagggggc

ICP4DSr反向引物：aaaaaagcttgcatgcccacgtgcgcggggccagacgggct

擴(kuò)增出ICP4基因下游側(cè)翼序列；

將上下游側(cè)翼序列克隆到pSP73質(zhì)粒上，構(gòu)建pICP4del及pICP4del-eGFP質(zhì)粒：將SalI酶切的前述擴(kuò)增出的ICP4基因的上游側(cè)翼序列及SalI/HindIII雙酶切的前述擴(kuò)增出的ICP4基因的下游側(cè)翼序列混合并連接到pSP73的EcoRV/HindIII位點(diǎn)，得到pICP4del；用EcoRI/XhoI從pcDNA3.1-eGFP切下CMV啟動子控制的eGFP表達(dá)盒，經(jīng)T4DNA聚合酶補(bǔ)平末端后插入到pICP4del的EcoRV位點(diǎn)，得到pICP4del-eGFP；

d.分三次PCR擴(kuò)增出ICP4基因中三段序列：

首先，使用以下引物：

ICP4-1st正向引物：ttttttgaattcatggcgtcggagaacaagcagcgcc

ICP4-1st反向引物：tggagccaccccatggcctccgcgt

ICP4-2nd正向引物：cgacgccgcgcagcagtacgccctg

ICP4-2nd反向引物：cggcgggggcgggcccggcgcaccg

ICP4-3rd正向引物：cctcatgtttgacccgcgggccctg

ICP4-3rd反向引物：ttttttctcgagttacagcaccccgtccccctcgaac

以步驟a)中所得病毒基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增出三段基因片段ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd，而后分別將該三段基因片段插入pSP73質(zhì)粒的EcoRV位點(diǎn)構(gòu)建出以下三種質(zhì)粒：pSP73-ICP4-1st、pSP73-ICP4-2nd、pSP73-ICP4-3rd，從該三種質(zhì)粒中用EcoRI和BsrGI剪切出ICP4-1st、用BsrGI和PvuI剪切出ICP4-2nd及用PvuI和XhoI剪切出ICP-3rd待用；

e.從含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp的質(zhì)粒中用NruI和HindIII切下hTERTp片段，取代從pcDNA3-NHN上用NruI和HindIII切除的CMV啟動子，得到質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp，其中，pcDNA3-NHN是在pcDNA3的NheI位點(diǎn)插入NheI-HapI-NheI酶切位點(diǎn)序列所得；

f.將步驟c)中得到的ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd混合并連接到步驟d)得到的pcDNA3-NHN-hTERTp的EcoRI及XhoI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4；

g.用SalI酶切步驟b)得到的含ICP4基因上下游側(cè)翼序列的質(zhì)粒pICP4del，并補(bǔ)平末端待用，用PmeI和HpaI從步驟e)得到的質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4剪切出hTERTp_ICP4表達(dá)盒片段，并將其與該酶切后待用的pICP4del質(zhì)粒連接，構(gòu)建出質(zhì)粒pICP4del-hTERTp_ICP4；

h.構(gòu)建BHK-ICP4輔助細(xì)胞：用EcoRI和XhoI從步驟e)質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4中酶切出ICP4基因，并克隆到pcDNA3中CMV啟動子的下游EcoRI和XhoI位點(diǎn)，得到pcDNA3-CMV-ICP4質(zhì)粒；將該pcDNA3-CMV-ICP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，該pcDNA3-CMV-ICP4質(zhì)粒DNA可重組到BHK細(xì)胞基因組中，使有些BHK重組細(xì)胞獲得對新霉素的抗性和表達(dá)ICP4，用抗菌素G418殺死未重組的BHK細(xì)胞，經(jīng)過幾輪的亞克隆篩選，用RT-PCR方法篩選出表達(dá)ICP4的BHK-ICP4輔助細(xì)胞；

(2)剔除基因組中ICP4基因啟動子并插入端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp啟動子：

a.用BHK細(xì)胞培養(yǎng)該含有ICP4基因的單純皰疹病毒，并提取病毒基因組DNA；

b.將步驟A中該病毒基因組DNA與步驟1)的b)小步驟得到的質(zhì)粒pICP4del-eGFP共轉(zhuǎn)入步驟1)的g)小步驟得到的BHK-ICP4輔助細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)同源重組，該質(zhì)粒pICP4del-eGFP中綠色熒光蛋白GFP表達(dá)盒置換了該含有ICP4基因的單純皰疹病毒HSV的ICP4基因，使得重組病毒的毒斑發(fā)綠色熒光，經(jīng)過幾輪的噬斑純化，挑選綠色熒光毒斑，純化出重組病毒HSV-d4GFP；

c.培養(yǎng)HSV-d4GFP病毒，并提取基因組DNA；

d.將重組病毒HSV-d4GFP的基因組DNA和步驟1)中f小步驟得到質(zhì)粒pICP4del-hTERTp_ICP4的DNA共轉(zhuǎn)入BHK-ICP4輔助細(xì)胞中，經(jīng)同源重組，hTERTp_ICP4表達(dá)盒置換了該重組病毒HSV-d4GFP的綠色熒光蛋白GFP表達(dá)盒，使新重組病毒的毒斑不發(fā)綠色熒光，經(jīng)過幾輪的噬斑純化，挑選無熒光毒斑，純化出該重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4；

2)構(gòu)建重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep

(1)按以下序列合成互補(bǔ)的、長度為145個堿基的DNA片段，分別為hp-ICP4正和hp-ICP4負(fù)。其中N序列(25個堿基)為隨機(jī)堿基，兩側(cè)翼已知序列一側(cè)與HSV-hTERTp_ICP4上端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子的3’端序列同源，另一側(cè)與ICP4基因5’端序列同源；

hp-ICP4正：

CCGCGAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAATTCATGGCGTCGGAGAACAAGCAGCGCCCCGGCTCCCCGGGCCCCACCGACGGGCCG

hp-ICP4負(fù)：

CGGCCCGTCGGTGGGGCCCGGGGAGCCGGGGCGCTGCTTGTTCTCCGACGCCATGAATTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTCGCGG

(2)構(gòu)建重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep：

提取HSV-hTERTp_ICP4病毒基因組DNA與上述合成的DNA片段hp-ICP4正和hp-ICP4負(fù)同源重組，用肝癌細(xì)胞HepG-2篩選，得到針對肝癌細(xì)胞高滴度的HSV-hTERTp_ICP4_Hep(簡稱HSV_Hep)；

(3)培養(yǎng)純化HSV_Hep重組病毒并提取病毒基因組DNA，對端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子與ICP4基因結(jié)合部測序，確定25個堿基的序列為TTGCCCCAAGCGGCATTTGGGTTCA；

3)構(gòu)建重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP

(1)構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pdICP34.5-eGFP

a.用BHK-ICP4細(xì)胞培養(yǎng)HSV-hTERTp_ICP4，并純化其基因組DNA；

b.擴(kuò)增ICP34.5基因上游側(cè)翼序列：以步驟a中所得病毒基因組DNA為模板，用以下ICP34.5USf正向引物和ICP34.5USr反向引物：

ICP34.5USf：CTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTG

ICP34.5USr：

GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCGCGGGCGCGCTCCTGACCGCGGG

擴(kuò)增出ICP34.5基因上游側(cè)翼序列；

c.擴(kuò)增ICP34.5基因下游側(cè)翼序列：以步驟a)中所得病毒基因組DNA為模板，用以下ICP34.5DSf正向引物和ICP34.5DSr反向引物：

ICP34.5DSf：

GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCA

ICP34.5DSr：TTCTTCCCTCTTCTCCCGCCCTCCA

擴(kuò)增出ICP34.5基因下游側(cè)翼序列；

d.連接ICP34.5基因上下游側(cè)翼序列：以步驟b)和c)得到的ICP34.5上下游側(cè)翼序列為模版，用ICP34.5USf和ICP34.5DSr擴(kuò)增連接ICP34.5基因上下游側(cè)翼序列；

e.將上下游側(cè)翼序列克隆到pSP72質(zhì)粒上，構(gòu)建pdICP34.5；

f.從pcDNA3.1-eGFP獲得eGFP表達(dá)序列并插入到pdICP34.5的AfeI位點(diǎn)，得到pdICP34.5-eGFP；

(2)構(gòu)建HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP

a.用HEPG-2細(xì)胞培養(yǎng)HSV-hTERTp_ICP4_Hep(簡稱HSV_Hep)，并純化其基因組DNA；

b.將步驟A中該病毒基因組DNA與步驟(1)f中該質(zhì)粒pdICP34.5-eGFP共轉(zhuǎn)入肝癌Hep-2細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)同源重組，該質(zhì)粒pdICP34.5-eGFP中綠色熒光蛋白GFP表達(dá)盒置換了含有ICP34.5基因的單純皰疹病毒HSV_Hep的ICP34.5基因，使得重組病毒的毒斑發(fā)綠色熒光，經(jīng)過幾輪的噬斑純化，挑選綠色熒光毒斑，純化出重組病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP(簡稱HSV_Hep-GFP)。

本發(fā)明還提供了一種重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP在制備腫瘤的診斷試劑盒中的應(yīng)用。

所述診斷試劑盒由重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP、APC標(biāo)記的人CD45抗體和紅細(xì)胞裂解液組成。

進(jìn)一步地，所述單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP含量為5E6-5E7CCID50/ml，所述PEcy5標(biāo)記的人CD45抗體的含量為0.1～0.5mg/ml。

再進(jìn)一步地，所述紅細(xì)胞裂解液中含有含有氯化銨、乙二胺四乙酸二鈉、碳酸氫鉀和超純水，其中，所述紅細(xì)胞裂解液中，氯化銨的含量為0.10～0.20M、乙二胺四乙酸二鈉的含量為0.5～2mM、碳酸氫鉀的含量為5～15mM。優(yōu)選地，氯化銨的含量為0.15M、乙二胺四乙酸二鈉的含量為1mM、碳酸氫鉀的含量為10mM。

本發(fā)明的理論基礎(chǔ)

啟動子和其調(diào)控基因之間的堿基序列組成可能會影響基因的表達(dá)量，而病毒早期蛋白ICP4表達(dá)量的高低又可影響病毒在細(xì)胞中的繁殖能力及滴度。在HSV-hTERTp_ICP4基礎(chǔ)上，我們用同源重組方法在病毒基因組的hTERTp與ICP4之間定點(diǎn)插入合成的隨機(jī)核苷酸短序列(25nt)，并用不同種類的腫瘤細(xì)胞篩選繁殖滴度較高的重組病毒。我們意外地發(fā)現(xiàn)啟動子(hTERTp)和基因(ICP4)之間序列的變化導(dǎo)致了不同的重組病毒在不同類型腫瘤細(xì)胞中的繁殖滴度出現(xiàn)了較大的差異。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明用合成的隨機(jī)核苷酸短序列與HSV1-hTERTp_ICP4病毒基因組進(jìn)行定點(diǎn)重組(在hTERTp與ICP4之間)。短序列的改變不但可以增加病毒的繁殖滴度，還可以使不同病毒針對不同類型腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生選擇性地高滴度繁殖。如有的病毒在肝癌細(xì)胞繁殖較好，有的病毒則在肝癌細(xì)胞產(chǎn)生更高的滴度等等。

附圖說明

圖1為病毒感染細(xì)胞對比圖；

圖中，圖1A為病毒感染HepG-2細(xì)胞對比圖；

圖1B為病毒感染HuH7細(xì)胞對比圖；

圖1C為病毒感染7721細(xì)胞對比圖；

圖2為肝癌的CTC檢測圖。

具體實(shí)施方式

為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

一種重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP的制備方法，包括以下步驟：

1)用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp取代含有ICP4基因的單純皰疹病毒中的ICP4基因啟動子，構(gòu)建該重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4：

(1)構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pICP4del-hTERTp_ICP4和pICP4del-eGFP

a.用BHK細(xì)胞培養(yǎng)含有ICP4基因的單純皰疹病毒，并純化其基因組DNA；

b.擴(kuò)增ICP4基因上游側(cè)翼序列：以步驟a)中所得病毒基因組DNA為模板，用以下ICP4USf正向引物和ICP4USr反向引物：

ICP4USf正向引物：ccctccagacgcaccggagtcggggg，

ICP4USr反向引物：aagtcgactctagaggatcgatctctgacctgagattggcggcactgaggta

擴(kuò)增出ICP4基因上游側(cè)翼序列；

c.擴(kuò)增ICP4基因下游側(cè)翼序列：以步驟a中所得病毒基因組DNA為模板，用以下ICP4DSf正向引物和ICP4USr反向引物：

ICP4DSf正向引物：aaaagtcgacctgcaggcatgctaacgaggaacgggcagggggc

ICP4DSr反向引物：aaaaaagcttgcatgcccacgtgcgcggggccagacgggct

擴(kuò)增出ICP4基因下游側(cè)翼序列；

將上下游側(cè)翼序列克隆到pSP73質(zhì)粒上，構(gòu)建pICP4del及pICP4del-eGFP質(zhì)粒：將SalI酶切的前述擴(kuò)增出的ICP4基因的上游側(cè)翼序列及SalI/HindIII雙酶切的前述擴(kuò)增出的ICP4基因的下游側(cè)翼序列混合并連接到pSP73的EcoRV/HindIII位點(diǎn)，得到pICP4del；用EcoRI/XhoI從pcDNA3.1-eGFP切下CMV啟動子控制的eGFP表達(dá)盒，經(jīng)T4DNA聚合酶補(bǔ)平末端后插入到pICP4del的EcoRV位點(diǎn)，得到pICP4del-eGFP；

d.分三次PCR擴(kuò)增出ICP4基因中三段序列：

首先，使用以下引物：

ICP4-1st正向引物：ttttttgaattcatggcgtcggagaacaagcagcgcc

ICP4-1st反向引物：tggagccaccccatggcctccgcgt

ICP4-2nd正向引物：cgacgccgcgcagcagtacgccctg

ICP4-2nd反向引物：cggcgggggcgggcccggcgcaccg

ICP4-3rd正向引物：cctcatgtttgacccgcgggccctg

ICP4-3rd反向引物：ttttttctcgagttacagcaccccgtccccctcgaac

以步驟a)中所得病毒基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增出三段基因片段ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd，而后分別將該三段基因片段插入pSP73質(zhì)粒的EcoRV位點(diǎn)構(gòu)建出以下三種質(zhì)粒：pSP73-ICP4-1st、pSP73-ICP4-2nd、pSP73-ICP4-3rd，從該三種質(zhì)粒中用EcoRI和BsrGI剪切出ICP4-1st、用BsrGI和PvuI剪切出ICP4-2nd及用PvuI和XhoI剪切出ICP-3rd待用；

e.從含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp的質(zhì)粒中用NruI和HindIII切下hTERTp片段，取代從pcDNA3-NHN上用NruI和HindIII切除的CMV啟動子，得到質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp，其中，pcDNA3-NHN是在pcDNA3的NheI位點(diǎn)插入NheI-HapI-NheI酶切位點(diǎn)序列所得；

f.將步驟c)中得到的ICP4-1st、ICP4-2nd和ICP4-3rd混合并連接到步驟d)得到的pcDNA3-NHN-hTERTp的EcoRI及XhoI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4；

g.用SalI酶切步驟b)得到的含ICP4基因上下游側(cè)翼序列的質(zhì)粒pICP4del，并補(bǔ)平末端待用，用PmeI和HpaI從步驟e)得到的質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4剪切出hTERTp_ICP4表達(dá)盒片段，并將其與該酶切后待用的pICP4del質(zhì)粒連接，構(gòu)建出質(zhì)粒pICP4del-hTERTp_ICP4；

h.構(gòu)建BHK-ICP4輔助細(xì)胞：用EcoRI和XhoI從步驟e)質(zhì)粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4中酶切出ICP4基因，并克隆到pcDNA3中CMV啟動子的下游EcoRI和XhoI位點(diǎn)，得到pcDNA3-CMV-ICP4質(zhì)粒；將該pcDNA3-CMV-ICP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，該pcDNA3-CMV-ICP4質(zhì)粒DNA可重組到BHK細(xì)胞基因組中，使有些BHK重組細(xì)胞獲得對新霉素的抗性和表達(dá)ICP4，用抗菌素G418殺死未重組的BHK細(xì)胞，經(jīng)過幾輪的亞克隆篩選，用RT-PCR方法篩選出表達(dá)ICP4的BHK-ICP4輔助細(xì)胞；

(2)剔除基因組中ICP4基因啟動子并插入端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp啟動子：

a.用BHK細(xì)胞培養(yǎng)該含有ICP4基因的單純皰疹病毒，并提取病毒基因組DNA；

b.將步驟A中該病毒基因組DNA與步驟1)的b)小步驟得到的質(zhì)粒pICP4del-eGFP共轉(zhuǎn)入步驟1)的g)小步驟得到的BHK-ICP4輔助細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)同源重組，該質(zhì)粒pICP4del-eGFP中綠色熒光蛋白GFP表達(dá)盒置換了該含有ICP4基因的單純皰疹病毒HSV的ICP4基因，使得重組病毒的毒斑發(fā)綠色熒光，經(jīng)過幾輪的噬斑純化，挑選綠色熒光毒斑，純化出重組病毒HSV-d4GFP；

c.培養(yǎng)HSV-d4GFP病毒，并提取基因組DNA；

d.將重組病毒HSV-d4GFP的基因組DNA和步驟1)中f小步驟得到質(zhì)粒pICP4del-hTERTp_ICP4的DNA共轉(zhuǎn)入BHK-ICP4輔助細(xì)胞中，經(jīng)同源重組，hTERTp_ICP4表達(dá)盒置換了該重組病毒HSV-d4GFP的綠色熒光蛋白GFP表達(dá)盒，使新重組病毒的毒斑不發(fā)綠色熒光，經(jīng)過幾輪的噬斑純化，挑選無熒光毒斑，純化出該重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4；

2)構(gòu)建重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep

(1)按以下序列合成互補(bǔ)的、長度為145個堿基的DNA片段，分別為hp-ICP4正和hp-ICP4負(fù)。其中N序列(25個堿基)為隨機(jī)堿基，兩側(cè)翼已知序列一側(cè)與HSV-hTERTp_ICP4上端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子的3’端序列同源，另一側(cè)與ICP4基因5’端序列同源；

hp-ICP4正：

CCGCGAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAATTCATGGCGTCGGAGAACAAGCAGCGCCCCGGCTCCCCGGGCCCCACCGACGGGCCG

hp-ICP4負(fù)：

CGGCCCGTCGGTGGGGCCCGGGGAGCCGGGGCGCTGCTTGTTCTCCGACGCCATGAATTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTCGCGG

(2)構(gòu)建重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep：

提取HSV-hTERTp_ICP4病毒基因組DNA與上述合成的DNA片段hp-ICP4正和hp-ICP4負(fù)同源重組，用肝癌細(xì)胞HepG-2篩選，得到針對肝癌細(xì)胞高滴度的HSV-hTERTp_ICP4_Hep(簡稱HSV_Hep)；

(3)培養(yǎng)純化HSV_Hep重組病毒并提取病毒基因組DNA，對端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子與ICP4基因結(jié)合部測序，確定25個堿基的序列為TTGCCCCAAGCGGCATTTGGGTTCA；

3)構(gòu)建重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP

(1)構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pdICP34.5-eGFP

a.用BHK-ICP4細(xì)胞培養(yǎng)HSV-hTERTp_ICP4，并純化其基因組DNA；

b.擴(kuò)增ICP34.5基因上游側(cè)翼序列：以步驟a中所得病毒基因組DNA為模板，用以下ICP34.5USf正向引物和ICP34.5USr反向引物：

ICP34.5USf：CTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTG

ICP34.5USr：

GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCGCGGGCGCGCTCCTGACCGCGGG

擴(kuò)增出ICP34.5基因上游側(cè)翼序列；

c.擴(kuò)增ICP34.5基因下游側(cè)翼序列：以步驟a)中所得病毒基因組DNA為模板，用以下ICP34.5DSf正向引物和ICP34.5DSr反向引物：

ICP34.5DSf：

GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCA

ICP34.5DSr：TTCTTCCCTCTTCTCCCGCCCTCCA

擴(kuò)增出ICP34.5基因下游側(cè)翼序列；

d.連接ICP34.5基因上下游側(cè)翼序列：以步驟b)和c)得到的ICP34.5上下游側(cè)翼序列為模版，用ICP34.5USf和ICP34.5DSr擴(kuò)增連接ICP34.5基因上下游側(cè)翼序列；

e.將上下游側(cè)翼序列克隆到pSP72質(zhì)粒上，構(gòu)建pdICP34.5；

f.從pcDNA3.1-eGFP獲得eGFP表達(dá)序列并插入到pdICP34.5的AfeI位點(diǎn)，得到pdICP34.5-eGFP；

(2)構(gòu)建HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP

A.用HEPG-2細(xì)胞培養(yǎng)HSV-hTERTp_ICP4_Hep(簡稱HSV_Hep)，并純化其基因組DNA；

B.將步驟A中該病毒基因組DNA與步驟(1)f中該質(zhì)粒pdICP34.5-eGFP共轉(zhuǎn)入肝癌HepG-2細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)同源重組，該質(zhì)粒pdICP34.5-eGFP中綠色熒光蛋白GFP表達(dá)盒置換了含有ICP34.5基因的單純皰疹病毒HSV_Hep的ICP34.5基因，使得重組病毒的毒斑發(fā)綠色熒光，經(jīng)過幾輪的噬斑純化，挑選綠色熒光毒斑，純化出重組病毒HSV-hTERTp_ICP4_Hep-GFP(簡稱HSV_Hep-GFP)。

實(shí)施例2HSV_Hep-GFP選擇性地在肝癌細(xì)胞中繁殖并產(chǎn)生高滴度病毒：

將HSV_HEP-GFP以MOI＝0.01分別感染肝癌細(xì)胞(HuH7、HepG-2、7721)、肺癌細(xì)胞(A549、PG)、胃癌細(xì)胞BGC823、結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29、人紅白血病細(xì)胞TF-1、淋巴瘤細(xì)胞U937、乳腺癌細(xì)胞MD-MB-231、咽部鱗癌細(xì)胞Fadu、黑色素瘤細(xì)胞A375，于6、12、24、48、72小時檢測病毒滴度。結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示HSV_HEP-GFP感染肝癌細(xì)胞效果最好，24小時或之后病毒繁殖滴度明顯高于(2個對數(shù)以上)其它癌種細(xì)胞繁殖病毒能達(dá)到的滴度。

實(shí)施例3HSV_Hep-GFP較HSV_ICP4在肝癌細(xì)胞中產(chǎn)生更高滴度的病毒

將HSV_HEP及HSV_ICP4以MOI＝0.01分別感染肝癌細(xì)胞HuH7、HepG-2、7721，于6、12、24、48、72小時檢測病毒滴度。結(jié)果見圖1-3。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示HSV_HEP感染3種肝癌細(xì)胞，24小時或之后病毒繁殖滴度均達(dá)到10⁶以上，而HSV_ICP4雖然能在3種肝癌細(xì)胞中繁殖，但病毒滴度較低，峰值僅達(dá)10⁴。兩種病毒感染肝癌細(xì)胞，其繁殖滴度相差2個對數(shù)。

實(shí)施例4、腫瘤檢測試劑盒檢測肝癌病人血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)

實(shí)驗(yàn)分兩組，肝癌病人50例、正常志愿者50例。每例受試人員均按以下步驟檢測：

1)采外周靜脈血4ml，1800r/min(根據(jù)不同型號離心機(jī)調(diào)整期轉(zhuǎn)速，以500g為準(zhǔn))離心5min；

2)去上層血漿(切忌破壞白細(xì)胞層，可適當(dāng)保留部分血漿)，將收集的細(xì)胞轉(zhuǎn)入50ml離心管中；

3)加24ml紅細(xì)胞裂解液，輕輕混勻，室溫靜置5～10min，直至溶液變透亮，1800r/min離心5min；

4)去上清，加入5ml PBS，用移液槍輕輕吹打混勻，1800r/min離心5min；

5)去上清，加入2ml DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，混勻，每孔1ml分鋪至細(xì)胞培養(yǎng)板的2個孔；

6)每孔加入100μl HSV_Hep-GFP，然后輕輕晃動細(xì)胞培養(yǎng)板，使所有試劑充分混勻，置37℃，5％CO₂孵育1h；

7)孵育完成后，向每個樣本孔加入1ml DMEM完全培養(yǎng)基(DMEM完全培養(yǎng)基配置：將FBS與DMEM培養(yǎng)基按1:9進(jìn)行混合)，然后輕輕晃動細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)37℃，5％CO₂孵育20～24h；

8)將同一樣本2個樣本孔的培養(yǎng)樣本轉(zhuǎn)移到1只孵育管中，1800r/min離心5min；

9)去上清，加入4ml PBS，用移液槍輕輕吹打混勻，1800r/min離心5min；

10)去上清，加入800μl PBS重懸細(xì)胞，混勻，然后在避光條件下加入200μl APC標(biāo)記的人CD45抗體，混勻，室溫避光孵育30min(APC熒光信號在見光條件下，容易淬滅，因此務(wù)必要保證避光保存和反應(yīng))；

11)孵育完成后，加入3ml PBS，混勻，1500r/min離心5min。去上清，加入150μlPBS重懸，混勻，吸出后用流式細(xì)胞儀檢查計(jì)數(shù)APC陰性且發(fā)綠色熒光的細(xì)胞。本法陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為≥4個綠色熒光細(xì)胞/4ml血。

如圖2所示：肝癌病人4ml血中檢出CTC(綠色熒光細(xì)胞)均大于6(中位值為30)；健康志愿者對照組的4ml血中絕大多數(shù)檢測不到CTC細(xì)胞，少數(shù)幾位健康志愿者血中檢測的細(xì)胞數(shù)也不超過閾值。

其它未詳細(xì)說明的部分均為現(xiàn)有技術(shù)。盡管上述實(shí)施例對本發(fā)明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，人們還可以根據(jù)本實(shí)施例在不經(jīng)創(chuàng)造性前提下獲得其他實(shí)施例，這些實(shí)施例都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。