本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)嬰幼兒免疫力的人工微生態(tài)制劑的制備方法，具體涉及分離、篩選待產(chǎn)母體陰道分泌物中具有益生作用的微生物，制備成為微生態(tài)制劑用于恢復(fù)剖腹產(chǎn)新生兒共生微生物，屬于微生物生物技術(shù)與生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展為人類創(chuàng)造了剖腹產(chǎn)手術(shù), 這種新的分娩方式挽救了無數(shù)產(chǎn)婦和嬰兒的生命, 為保障人類的健康和人口再生長做出了巨大貢獻(xiàn)。在陰道分娩無法達(dá)成, 或經(jīng)陰道分娩可能對產(chǎn)婦或新生兒造成威脅時, 才需要剖腹產(chǎn)。然而近年來，我國剖腹產(chǎn)的孕婦數(shù)量逐年增多，如今我國的剖宮產(chǎn)率已經(jīng)高達(dá)40%-50%，某些地區(qū)甚至更高。
分娩方式的選擇直接影響新生兒共生菌群的組成。在順產(chǎn)的嬰兒中，觀察到微生物組成往往與母體產(chǎn)道和腸道相似，而在剖腹產(chǎn)的嬰兒中，微生物組成往往更接近于母親的皮膚以及醫(yī)院環(huán)境包括醫(yī)護(hù)人員和其它新生兒。陰道分娩兒的菌群定植主要受母親陰道和會陰區(qū)域菌群的影響，剖腹產(chǎn)兒則主要受醫(yī)院環(huán)境的影響。以腸道菌群為例，前者最初的腸道菌群主要是母親陰道和外陰周圍的細(xì)菌，多為乳酸桿菌、普雷沃氏菌、雙歧桿菌等；而后者主要以鏈球菌、葡萄球菌、厭氧球菌、類桿菌、丙酸桿菌為主。其中金黃色葡萄球菌是導(dǎo)致新生兒敗血癥的主要原因，雙歧桿菌數(shù)量則很低甚至沒有，而雙岐桿菌對機(jī)體健康及免疫功能有重要作用。
正常陰道分娩過程中嬰兒經(jīng)過產(chǎn)道時會被產(chǎn)道擠壓，在分娩過程中及出生后不久，母親身體里的細(xì)菌就會通過胎兒呼吸道及消化道最早進(jìn)入胎兒體內(nèi)定植，這個細(xì)菌定植對嬰兒一生的健康非常重要，它為一個基本無菌的新生兒腸道內(nèi)建立起新的微生物生態(tài)系統(tǒng)。這些定植的細(xì)菌主要是在分娩過程，產(chǎn)道環(huán)境微生物起作用的結(jié)果。而新生兒的這一微生物生態(tài)系統(tǒng)的構(gòu)成成分直接影響嬰兒的免疫功能。剖腹產(chǎn)新生兒因出生時沒有經(jīng)產(chǎn)道擠壓、不能及時建立共生菌群。最終造成剖腹產(chǎn)兒的微生物生態(tài)系統(tǒng)的構(gòu)成與順產(chǎn)兒有很大的不同。
大量的研究發(fā)現(xiàn)，剖腹產(chǎn)新生兒中觀察到的微生物組成改變與遠(yuǎn)期多種疾病發(fā)生風(fēng)險升高有著密切的關(guān)系，包括過敏、濕疹、哮喘、肥胖、1型糖尿病、慢性相關(guān)炎癥性疾病等。英國研究人員警告說，剖腹產(chǎn)的孩子比順產(chǎn)的孩子更易患哮喘，剖腹產(chǎn)孩子患哮喘的概率比正常順產(chǎn)的孩子高80%。剖腹產(chǎn)剝奪了孩子最先感覺統(tǒng)合鍛煉的權(quán)利，使得剖腹產(chǎn)兒容易患感統(tǒng)失調(diào)。而且剖腹產(chǎn)令“濕肺癥”增多?？偟膩碚f，與自然分娩相比，剖腹產(chǎn)新生兒的免疫力及抗感染能力比自然分娩的孩子要差。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)不足提供一種增強(qiáng)嬰幼兒免疫力的人工微生態(tài)制劑的制備方法。
本發(fā)明所述方法包括下列步驟：
1、陰道分泌物的收集：在進(jìn)行剖腹產(chǎn)手術(shù)之前1小時，將一塊大小適宜的無菌紗布放置于待產(chǎn)母親的陰道中10min；
2、陰道菌群的保存：將浸有陰道分泌物的紗布浸沒于無菌的PBS溶液中，用無菌鑷子不斷擠壓紗布，使紗布中的陰道分泌物分布于PBS中，離心，取沉淀，在沉淀中加入20%甘油，旋渦振蕩器混勻，-8O ℃下保存；
3、陰道菌群的分離及鑒定:
（1）培養(yǎng)基的制備：配制BSM、MRS、改良的GAM固體培養(yǎng)基和BHI+5%脫脂乳的固體和液體培養(yǎng)基；所述BSM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)雙岐桿菌，MRS培養(yǎng)基用于培養(yǎng)乳酸菌，改良的GAM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)擬桿菌，BHI+5%脫脂乳的固體和液體培養(yǎng)基用于培養(yǎng)總菌；
（2）培養(yǎng)方式：將陰道分泌物從-8O ℃的冰柜中取出，取陰道分泌物加入到無菌的PBS溶液中，按101～108比例稀釋；分別取100μL102、104、106涂板，厭氧和需氧條件下培養(yǎng)48h；
（3）挑菌接種：于無菌超凈工作臺中根據(jù)平板中菌落的形態(tài)、大小、顏色、邊緣整齊與否、隆起與否和降解乳糖與否，挑出單菌落接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中；
（4）革蘭染色：取10μL菌液，涂板于載玻片上，置于電子顯微鏡下觀察菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)；
（5）測序：根據(jù)革蘭染色的結(jié)果選出不同的細(xì)菌用于測序，確定陰道分泌物中各種微生物的種屬關(guān)系；
4、具有益生作用微生物的篩選：根據(jù)測序結(jié)果篩選出具有益生作用的微生物混合并進(jìn)行培養(yǎng)。
5、陰道菌群凍干粉的制備：往菌液中加入等量的20%的滅菌脫脂乳，均勻混合，冷凍干燥后，制成凍干粉。
6、陰道益生菌群凍干粉的應(yīng)用：在新生兒產(chǎn)下前，用無菌的生理鹽水溶解凍干粉，配成溶液，待剖腹產(chǎn)新生兒產(chǎn)下1-3分鐘后，用無菌紗布蘸取溶液依次擦拭新生兒的嘴部、面部、肛門等身體的其他部位。
7、新生兒共生微生物的鑒定：為驗證這種分離篩選陰道益生菌群移植的方法是否可以恢復(fù)新生兒共生微生物。在新生兒出生的1、3、7、14、21及30天這六個時間點分別在受試母嬰的肛門、口腔及皮膚等部位共采集了樣本，采用16S rRNA測序的方法鑒定其群落組成。
本發(fā)明的有益效果：該方法直接從待產(chǎn)孕婦陰道分泌物中分離陰道有益菌，將可能的致病菌排除，用于建立和恢復(fù)剖腹產(chǎn)嬰幼兒身體各部位菌群結(jié)構(gòu)重建，具有簡單方便、安全有效、可操作、可商品化等優(yōu)點，有助于更好地增強(qiáng)和提高剖腹產(chǎn)新生兒的抗感染能力和免疫功能。
具體實施方式
本發(fā)明所述方法包括下列步驟：
1、陰道分泌物的收集：在進(jìn)行剖腹產(chǎn)手術(shù)之前1小時，將一塊大小適宜的無菌紗布放置于待產(chǎn)母親的陰道中10min；
2、陰道菌群的保存：將浸有陰道分泌物的紗布浸沒于無菌的PBS溶液中，用無菌鑷子不斷擠壓紗布，使紗布中的陰道分泌物分布于PBS中，離心，取沉淀，在沉淀中加入20%甘油，旋渦振蕩器混勻，-8O ℃下保存；
3、陰道菌群的分離及鑒定:
（1）培養(yǎng)基的制備：配制BSM、MRS、改良的GAM固體培養(yǎng)基和BHI+5%脫脂乳的固體和液體培養(yǎng)基；所述BSM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)雙岐桿菌，MRS培養(yǎng)基用于培養(yǎng)乳酸菌，改良的GAM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)擬桿菌，BHI+5%脫脂乳的固體和液體培養(yǎng)基用于培養(yǎng)總菌；
（2）培養(yǎng)方式：將陰道分泌物從-8O ℃的冰柜中取出，取陰道分泌物加入到無菌的PBS溶液中，按101～108比例稀釋；分別取100μL102、104、106涂板，厭氧和需氧條件下培養(yǎng)48h；
（3）挑菌接種：于無菌超凈工作臺中根據(jù)平板中菌落的形態(tài)、大小、顏色、邊緣整齊與否、隆起與否和降解乳糖與否，挑出單菌落接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中；
（4）革蘭染色：取10μL菌液，涂板于載玻片上，置于電子顯微鏡下觀察菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)；
（5）測序：根據(jù)革蘭染色的結(jié)果選出不同的細(xì)菌用于測序，確定陰道分泌物中各種微生物的種屬關(guān)系；
4、具有益生作用微生物的篩選：根據(jù)測序結(jié)果篩選出具有益生作用的微生物混合并進(jìn)行培養(yǎng)。
5、陰道菌群凍干粉的制備：往菌液中加入等量的20%的滅菌脫脂乳，均勻混合，冷凍干燥后，制成凍干粉。
6、陰道益生菌群凍干粉的應(yīng)用：在新生兒產(chǎn)下前，用無菌的生理鹽水溶解凍干粉，配成溶液，待剖腹產(chǎn)新生兒產(chǎn)下1-3分鐘后，用無菌紗布蘸取溶液依次擦拭新生兒的嘴部、面部、肛門等身體的其他部位。
7、新生兒共生微生物的鑒定：為驗證這種分離篩選陰道益生菌群移植的方法是否可以恢復(fù)新生兒共生微生物。在新生兒出生的1、3、7、14、21及30天這六個時間點分別在受試母嬰的肛門、口腔及皮膚等部位共采集了樣本，采用16S rRNA測序的方法鑒定其群落組成。