本發(fā)明涉及一種環(huán)境樣品特別是沉積物樣品中微生物胞外DNA的簡易提取方法，該方法借助生物技術(shù)手段，對沉積物樣品進(jìn)行處理，屬于環(huán)境科學(xué)與生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
抗生素抗性基因在自然環(huán)境中廣泛的存在和傳播擴(kuò)散引起了巨大的環(huán)境和健康風(fēng)險(xiǎn)，有必要對自然環(huán)境中抗性基因的數(shù)量進(jìn)行準(zhǔn)確地檢測。環(huán)境中的抗生素抗性基因通常位于一些可移動(dòng)遺傳元件上，如質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等，這些抗性基因可以通過可移動(dòng)遺傳元件的水平轉(zhuǎn)移進(jìn)行傳播和擴(kuò)散。位于細(xì)菌內(nèi)的抗生素抗性基因通常可以通過結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入其他細(xì)菌，而位于細(xì)菌體外的基因則有可能通過轉(zhuǎn)化再次進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的抗生素抗性基因通過不同的方式對抗生素抗性基因的傳播和擴(kuò)散起到不同的作用，因此，對細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外DNA加以區(qū)分對于研究抗生素抗性基因在環(huán)境中的傳播擴(kuò)散尤為重要。
目前對于胞外DNA(eDNA)的提取方法主要有苯酚-氯仿抽提法、微柱吸附法、磁珠吸附法等，但這些方法主要針對組織和血漿中胞外DNA的提取。沉積物介質(zhì)基質(zhì)復(fù)雜，干擾嚴(yán)重，現(xiàn)有方法無法直接用于沉積物中eDNA的提取，因此建立一種高效的沉積物樣品DNA提取方法至關(guān)重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種對于環(huán)境樣本中微生物胞外DNA的提取的方法，以解決目前環(huán)境樣本胞外DNA提取方法的欠缺。依據(jù)本發(fā)明方法可以對沉積物等環(huán)境樣本中的胞外DNA進(jìn)行快速有效地提取，能得到可直接用于后續(xù)分子生物學(xué)操作的高純度DNA，并且可以計(jì)算DNA的提取效率。本發(fā)明關(guān)于提取效率的創(chuàng)造性之處在于向未經(jīng)滅菌的土壤樣品中直接加入內(nèi)標(biāo)胞外DNA。
本發(fā)明提供的從沉積物樣品中高效提取胞外DNA的簡易方法，對于不同的土壤和水體沉積物樣品均具有較好的胞外DNA提取效果，并且該方法引入了DNA提取效率的指標(biāo)，該指標(biāo)是指通過在待提取的土壤樣品中加入已知數(shù)量的內(nèi)標(biāo)胞外DNA CESA9。CESA9是擬南芥中一段纖維素合成酶基因，在對環(huán)境樣本提取胞外DNA之后，對該基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR確定其拷貝數(shù)量，以此計(jì)算出DNA的提取效率。加入內(nèi)標(biāo)胞外DNA之前的沉積物樣品DNA經(jīng)過PCR反應(yīng)檢測不到目的基因CESA9的存在。
本發(fā)明提供的高效提取沉積物中胞外DNA方法的具體步驟為：
第1：胞外DNA內(nèi)標(biāo)基因的構(gòu)建；
第1.1：胞外DNA內(nèi)標(biāo)基因克隆載體的構(gòu)建；
CESA9是擬南芥中一段纖維素合成酶基因，該基因片段作為計(jì)算胞外DNA提取的內(nèi)標(biāo)基因，將這段基因用PCR擴(kuò)增之后進(jìn)行切膠回收，取0.5-4μl PCR與1μl pEASY-T1克隆載體輕輕混合，室溫反應(yīng)5分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上；
第1.2：胞外DNA內(nèi)標(biāo)基因的擴(kuò)增
加連接產(chǎn)物于50μl感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α中，42℃水浴熱激30秒，立即置于冰上2分鐘；加入250μl平衡至室溫的LB培養(yǎng)基，200rpm、37℃培養(yǎng)1小時(shí)；取8μl 500mM IPTG和40μl 20mg/ml X-gal混合，均勻地涂布在準(zhǔn)備好的平板上，37℃培養(yǎng)箱中放置30分鐘。待IPTG和X-gal被吸收后，取200μl菌液均勻地涂布在平板上，在37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；挑選白色克隆接種于LB/AMP+或LB/Kan+的液體培養(yǎng)基中，200rpm、37℃培養(yǎng)6小時(shí)左右；用試劑盒小量提取質(zhì)粒；
第1.3：胞外DNA內(nèi)標(biāo)基因濃度的確定：
對第1.2步提取的質(zhì)粒用核酸濃度測定儀進(jìn)行測定，確定內(nèi)標(biāo)基因濃度；
第2：沉積物樣品胞外DNA提??；
第2.1：沉積物樣品胞外DNA的分離；
稱取1g沉積物樣品于10mL無菌離心管中，取10μg第1.2步提取的內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒加入到樣品中，濃度為2.37×1013CFU/g沉積物；加入4mL 0.12M、pH＝8.0的NaH2PO4溶液和0.2g PVPP(Polyvinyl pyrrolidone)，混合均勻，250rpm、25℃反應(yīng)10分鐘；然后在4℃條件下，10000×g離心10分鐘，取上清液，過0.22μm PVDF濾膜，將濾液存放于冰上；向離心管剩余沉淀中再次加入4mL 0.12M、pH＝8.0的NaH2PO4溶液和0.2g PVPP(Polyvinyl pyrrolidone)，按上述過程操作，重復(fù)兩次之后，將三次所得濾液混合；將濾液在4℃條件下，10000×g離心20分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至新的無菌管中；
第2.2：胞外DNA溶液的獲得；
向第2.1得到的液體中加入1體積的混合溶液，包括50mM Tris-HCl、10mM EDTA和質(zhì)量濃度為1％的CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)，pH＝8.0，65℃水浴30分鐘，4℃條件下，5000×g離心10分鐘，棄上清液；再向離心管中加入1體積的高鹽度的TE緩沖液A重懸10分鐘，所述TE緩沖液A中包括10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA和1M NaCl，pH＝8.0；加入0.6體積的冰異丙醇，在冰上反應(yīng)1小時(shí)，4℃、10000×g離心10分鐘；將沉淀再次重懸于1體積TE緩沖液B，所述TE緩沖液B中包括10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA，pH＝8.0；加入等體積的體積比為苯酚：氯仿：異戊醇＝25:24:1的混合液，上下顛倒混勻進(jìn)行抽提，在4℃下10000×g離心10分鐘，取上層液體置于新的2mL無菌離心管中，重復(fù)此操作一次；用體積比為氯仿：異戊醇＝24:1的混合液再抽提新獲得的上層液體一次，4℃下10000×g離心10分鐘，取出上層液體，置于1.5mL的無菌離心管中；
第2.3：粗DNA的純化溶解；
向第2.2步得到的液體中加入0.1倍體積的2M NaCl溶液和0.6倍體積的異丙醇，-20℃時(shí)靜置60分鐘，10000×g離心15分鐘，棄去上清液，用0.5mL體積比為70％的冷乙醇洗滌沉淀，吹打使DNA浮起，10000×g離心2分鐘，重復(fù)洗滌一次，棄去乙醇后將DNA在真空中進(jìn)行干燥；用30μL的65℃預(yù)熱的TE緩沖液溶解DNA，TE緩沖液為pH＝8.0的10mM Tris-HCl和1mM EDTA混合溶液；
第3：內(nèi)標(biāo)基因的定量；
利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測提取的DNA中所含內(nèi)標(biāo)基因CESA9的拷貝數(shù)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列及退火溫度見實(shí)施例2。
用于計(jì)算DNA提取效率的內(nèi)標(biāo)基因CESA9是擬南芥中一段纖維素合成酶基因，在所要提取DNA的環(huán)境樣品中檢測不到。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：
本發(fā)明所述方法可以將環(huán)境樣本中胞外DNA進(jìn)行分離與純化。通過紫外分光光度計(jì)檢測，提取出的DNA的OD260/OD280可以達(dá)到1.57，OD260/OD230可以達(dá)到1.78，可以進(jìn)行后續(xù)的分子操作，實(shí)用性較強(qiáng)。通過DNA的提取效率分析，該方法的沉積物中胞外DNA提取率可以達(dá)到57％，表明該方法可靠性程度較高。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：沉積物樣品中胞外DNA的提?。?/p>
第1：胞外DNA內(nèi)標(biāo)基因的構(gòu)建；
第1.1：胞外DNA內(nèi)標(biāo)基因克隆載體的構(gòu)建；
將擬南芥中CESA9基因用PCR擴(kuò)增之后進(jìn)行切膠回收，取0.5-4μl PCR與1μl pEASY-T1克隆載體輕輕混合，室溫反應(yīng)5分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上；
第1.2：胞外DNA內(nèi)標(biāo)基因的擴(kuò)增
加連接產(chǎn)物于50μl感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α中，42℃水浴熱激30秒，立即置于冰上2分鐘；加入250μl平衡至室溫的LB培養(yǎng)基，200rpm、37℃培養(yǎng)1小時(shí)；取8μl 500mM IPTG和40μl 20mg/ml X-gal混合，均勻地涂布在準(zhǔn)備好的平板上，37℃培養(yǎng)箱中放置30分鐘。待IPTG和X-gal被吸收后，取200μl菌液均勻地涂布在平板上，在37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；挑選白色克隆接種于LB/AMP+或LB/Kan+的液體培養(yǎng)基中，200rpm、37℃培養(yǎng)6小時(shí)左右；用試劑盒小量提取質(zhì)粒；
第1.3：胞外DNA內(nèi)標(biāo)基因濃度的確定：
對第1.2步提取的質(zhì)粒用核酸濃度測定儀進(jìn)行測定，確定內(nèi)標(biāo)基因濃度；
第2：沉積物樣品胞外DNA提?。?/p>
第2.1：沉積物樣品胞外DNA的分離；
稱取1g沉積物樣品于10mL無菌離心管中，取10μg第1.2步提取的內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒加入到樣品中，濃度為2.37×1013CFU/g沉積物；加入4mL 0.12M、pH＝8.0的NaH2PO4溶液和0.2g PVPP(Polyvinyl pyrrolidone)，混合均勻，250rpm、25℃反應(yīng)10分鐘；然后在4℃條件下，10000×g離心10分鐘，取上清液，過0.22μm PVDF濾膜，將濾液存放于冰上；向離心管剩余沉淀中再次加入4mL 0.12M、pH＝8.0的NaH2PO4溶液和0.2g PVPP(Polyvinyl pyrrolidone)，按上述過程操作，重復(fù)兩次之后，將三次所得濾液混合；將濾液在4℃條件下，10000×g離心20分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至新的無菌管中；
第2.2：胞外DNA溶液的獲得；
向第2.1得到的液體中加入1體積的混合溶液，包括50mM Tris-HCl、10mM EDTA和質(zhì)量濃度為1％的CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)，pH＝8.0，65℃水浴30分鐘，4℃條件下，5000×g離心10分鐘，棄上清液；再向離心管中加入1體積的高鹽度的TE緩沖液A重懸10分鐘，所述TE緩沖液A中包括10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA和1M NaCl，pH＝8.0；加入0.6體積的冰異丙醇，在冰上反應(yīng)1小時(shí)，4℃、10000×g離心10分鐘；將沉淀再次重懸于1體積TE緩沖液B，所述TE緩沖液B中包括10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA，pH＝8.0；加入等體積的體積比為苯酚：氯仿：異戊醇＝25:24:1的混合液，上下顛倒混勻進(jìn)行抽提，在4℃下10000×g離心10分鐘，取上層液體置于新的2mL無菌離心管中，重復(fù)此操作一次；用體積比為氯仿：異戊醇＝24:1的混合液再抽提新獲得的上層液體一次，4℃下10000×g離心10分鐘，取出上層液體，置于1.5mL的無菌離心管中；
第2.3：粗DNA的純化溶解；
向第2.2步得到的液體中加入0.1倍體積的2M NaCl溶液和0.6倍體積的異丙醇，-20℃時(shí)靜置60分鐘，10000×g離心15分鐘，棄去上清液，用0.5mL體積比為70％的冷乙醇洗滌沉淀，吹打使DNA浮起，10000×g離心2分鐘，重復(fù)洗滌一次，棄去乙醇后將DNA在真空中進(jìn)行干燥；用30μL的65℃預(yù)熱的TE緩沖液溶解DNA，TE緩沖液為pH＝8.0的10mM Tris-HCl和1mM EDTA混合溶液；
第3：提取胞外DNA質(zhì)量檢測；
利用核酸蛋白檢測儀對所提取的DNA進(jìn)行OD260/OD280、OD260/OD230的測定。
利用實(shí)施例1所述方法提取來自沉積物樣品中的微生物胞外DNA。利用核酸蛋白檢測儀對所提取的DNA進(jìn)行OD260/OD280、OD260/OD230的測定，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示用本發(fā)明中的方法提取來自沉積物中的胞外DNA其OD260/OD280值接近1.30，說明提取樣品中蛋白質(zhì)殘留較少；其OD260/OD230值不低于1.60，說明腐殖酸類等的其它雜質(zhì)少；因此，本發(fā)明適合提取沉積物樣品中微生物胞外DNA。此外本發(fā)明的應(yīng)用范圍不僅包括沉積物，對于土壤等介質(zhì)提取的DNA質(zhì)量較高。
表1：提取沉積物樣品中微生物胞外DNA純度檢測
實(shí)施例2：PCR檢驗(yàn)沉積物中微生物胞外DNA提取效率；
(1)目的基因引物序列
(2)定性PCR反應(yīng)程序
(3)熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)
(4)定性PCR反應(yīng)體系
(5)定量PCR反應(yīng)體系
表2：提取沉積物樣品中微生物胞外DNA提取效率檢測
利用實(shí)施例2所述方法檢測可得對沉積物樣品中的微生物胞外DNA的提取效率均高于44％，最高可達(dá)57％。因此，本發(fā)明適合提取沉積物樣品中微生物胞外DNA。此外本發(fā)明的應(yīng)用范圍不僅包括沉積物，對于土壤等介質(zhì)提取的DNA質(zhì)量和提取效率也較高。