本發(fā)明屬于分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備萊菔素的方法。
二、
背景技術(shù)：
十字花科植物含有硫代葡萄糖苷(簡稱硫苷)，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，在硫代葡萄糖苷酶(黑芥子酶)的催化下，硫代葡萄糖苷水解、重排，生成氰酸酯、異硫氰酸酯、腈類或惡唑烷等化合物。蘿卜硫素是一種異硫氰酸酯，具有抗腫瘤、解毒抗菌、抗氧化的作用，對肝癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、前胃癌有明顯的阻斷作用等，是一種具有市場潛力和經(jīng)濟價值的天然活性物。
現(xiàn)有分離蘿卜硫素的方法有：刊登于《食品與發(fā)酵工程》2011年第37卷第7期，題目為“SP850樹脂分離蘿卜硫素”的論文，該論文公開的方法是：將西蘭花種子粉碎，酶解18h后過濾得到蘿卜硫素溶液，再將蘿卜硫素溶液pH調(diào)節(jié)到3使蛋白質(zhì)失活，過濾得到蘿卜硫素上柱液，最后分別進行SP850樹脂的靜態(tài)和動態(tài)吸附，得到純度為88.7％的蘿卜硫素；申請?zhí)枮?01410321758.5，名稱為“一種利用溶劑萃取法和分子蒸餾法聯(lián)合制備蘿卜硫素的方法”的發(fā)明專利，該專利公開的方法是：利用有機溶劑從蘿卜硫素水解液中萃取并減壓蒸餾得到蘿卜硫素粗提物，再利用分子蒸餾分離純化技術(shù)得到高純度的蘿卜硫素產(chǎn)品。上述兩種方法存在的主要問題是：①選用二氯甲烷、乙酸乙酯等有機溶劑萃取蘿卜硫素，此類溶劑易揮發(fā)或水溶性高，難以完全回收，污染環(huán)境；②用選擇性低的大孔吸附樹脂吸附目標(biāo)物，難以獲得專一性吸附，加之吸附分離時間長達數(shù)小時，而蘿卜硫素在水溶液中30分鐘即開始重排或異構(gòu)化蘿卜硫氰或異噁烷等雜質(zhì)，因此，后續(xù)分離純化的難度大且效率低，難以獲得高純度蘿卜硫素。
三、
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明是針對現(xiàn)有蘿卜硫素分離提純技術(shù)的不足之處，提供一種制備萊菔素的方法。該方法具有操作簡單、高效、連續(xù)性強、溶劑可反復(fù)回收利用，產(chǎn)品純度高且穩(wěn)定等特點。
本發(fā)明的原理是：萊菔素的結(jié)構(gòu)與蘿卜硫氰或異噁烷等顯著不同，與C18色譜柱的結(jié)合力不同，在特定流動相的洗脫下，流出色譜柱的時間出現(xiàn)差異，因此可以用高效液相色譜進行分離純化。萊菔素的異硫氰酸根中的碳原子電子云密度低，可與富電子云的磷氧鍵氧原子形成配位鍵，因而能被例如磷酸三丁酯或三烷基氧化膦等萃取劑萃?。蝗R菔素溶于水和二氯甲烷，而二氯甲烷和水互不相溶，因此，用二氯甲烷可將萊菔素萃取并與水分離。萊菔素沸點高達200℃以上，二氯甲烷的沸點僅為40℃，而在真空條件下，其沸點更低，因此，控制體系的真空度，可在較低溫度下完全蒸發(fā)該溶劑，最終獲得萊菔素產(chǎn)品。
本發(fā)明的目的是通過以下途徑實現(xiàn)的，一種制備萊菔素的方法，以脫脂胭脂蘿卜籽粉為原料，經(jīng)過制備蘿卜硫苷水解液、制備萊菔素粗分離液、配制TBP或TRPO磺化煤油萃取液、制備萊菔素初步純化液、制備純化萊菔素濃縮液及制備萊菔素的步驟，快速制備出純度超過99％的萊菔素。其具體的工藝步驟如下：
(1)制備蘿卜硫苷水解液
現(xiàn)有制備萊菔素的技術(shù)，按照專利號為201510270292.5介紹的方法制備出蘿卜硫苷水解液，用于下步制備萊菔素粗分離液。
(2)制備萊菔素粗分離液
將蘿卜硫苷水解液泵入管式離心機中，以0.5～1.5×104r/min的轉(zhuǎn)速進行離心分離，分別收集離心清液和離心沉淀。對收集的離心沉淀，為萊菔子分離蛋白，用于加工食品添加劑；對收集的離心清液，泵入截留分子量為0.5～1×104Da的超濾機中，在表壓為0.02～0.2MPa下進行超濾，直至超濾截留液為濾過液的1/8～1/10時止。分別收集超濾濾過液和超濾截留液，對收集的超濾截留液，主要含有多糖，用于加工萊菔子多糖；對收集的超濾濾過液，泵入截留分子量為200～500Da的納濾機中，在表壓為0.1～0.5MPa下進行納濾，直至納濾截留液為濾過液的1/8～1/10時止。分別收集納濾濾過液和納濾截留液，對收集的納濾截留液，主要含小分子肽，用于加工飼料添加劑；對收集的納濾濾過液，即為萊菔素粗分離液，用于制備萊菔素初步純化液。
(3)配制TBP或TRPO磺化煤油萃取液
將磷酸三丁酯(TBP)或三烷基氧化膦(TRPO)在攪拌下分散并溶解于磺化煤油中，配制出濃度為0.05～0.15mol/L的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，用于萃取萊菔素粗分離液中的萊菔素。
(4)制備萊菔素初步純化液
第(3)步結(jié)束后，將第(2)步收集的萊菔素粗分離液泵入萃取釜中，按照萊菔素粗分離液/濃度為0.05～0.15mol/L的TBP或TRPO磺化煤油萃取液的體積比(L/L)為1∶1～3的比例，與TBP或TRPO磺化煤油萃取液混合，在40～80r/min的轉(zhuǎn)速下萃取5～20min，然后靜止5～10min分層。分別收集上層荷載萊菔素的萃取液和下層卸載萊菔素的萃余液，對收集的下層卸載萊菔素的萃余液，泵入生化處理池，進行生物氧化，達標(biāo)后排放；對收集的上層荷載萊菔素的萃取液，加入0.05～0.2mol/L的氯化鈉溶液或氯化鉀溶液進行反萃取5～20min，然后靜止5～10min分層，其中萃取液與濃度0.05～0.2mol/L的氯化鈉溶液或氯化鉀溶液的體積比為1∶1～3。分別收集含萊菔素的氯化鈉或氯化鉀反萃取液和卸載萊菔素的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，對收集的含萊菔素的氯化鈉或氯化鉀反萃取液，即為萊菔素初步純化液，用于下步制備純化萊菔素濃縮液；對收集的卸載萊菔素的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，在0.5～0.8×104r/min的轉(zhuǎn)速下離心5～10min。棄離心下層鹽溶液；收集離心上層清液，即獲得濃度為0.05～0.15mol/L的TBP或TRPO磺化煤油再生萃取液，該再生萃取液可用于下批次再次萃取萊菔素。
(5)制備純化萊菔素濃縮液
將第(4)步收集的萊菔素初步純化液用0.22～0.45μm微孔濾膜過濾后泵入制備色譜，進行第一次制備。制備條件為：流速20～40mL/min、波長254nm、柱溫25℃，在0～30min期間，甲醇/水體積比(L/L)為10％～30％/90％～70％；收集15～18min流出的液體，將其在真空度為0.06～0.09MPa下進行真空濃縮，直至無甲醇味時止。即為純化萊菔素濃縮液，用于下步制備萊菔素。
(6)制備萊菔素
第(5)步完成后，向第(5)步收集的純化萊菔素濃縮液中加入二氯甲烷進行萃取5～10min，純化萊菔素濃縮液/二氯甲烷體積比(L/L)為1∶1～3。萃取完成后靜止5～10min分層。分別收集上層萃取相和下層萃余液，對收集的萃取相，泵入低溫高真空溶劑回收裝置，在溫度為30～45℃、真空度為0.4～40kPa的條件下回收二氯甲烷，直至無二氯甲烷時止。就制備出純度達到99.14％的萊菔素，其收得率為脫脂萊菔子質(zhì)量的0.35～0.5％。對收集的萃余液，泵入生化池進行好氧氧化，達標(biāo)后排放。
本發(fā)明采用了上述技術(shù)手段后主要產(chǎn)生了以下效果：
1、本發(fā)明方法在生產(chǎn)過程中使用超濾、納濾分離，萃取、制備色譜及高壓低溫濃縮等現(xiàn)代化工技術(shù)和設(shè)備，具有操作簡便，分離精準(zhǔn)，條件溫和，節(jié)約能源，生產(chǎn)成本低等特點；
2、本發(fā)明采用TBP或TRPO磺化煤油萃取液萃取、分離萊菔素粗分離液中的萊菔素，具有分離效果明顯，操作簡便，萃取劑可回收利用等優(yōu)點；
3、本發(fā)明采用二氯甲烷萃取萊菔素濃縮液，快速脫除萊菔素中的水，使萊菔素更加穩(wěn)定，且二氯甲烷沸點低，在高真空下快速蒸發(fā)回收，進而獲得純度達到99.14％、產(chǎn)率為脫脂萊菔子質(zhì)量0.35～0.5％的萊菔素產(chǎn)品；
4、本發(fā)明使用制備型液相色譜分離萊菔素，制備色譜的塔板數(shù)極高，分離精準(zhǔn)，其流動相經(jīng)處理后可回用，顯著降低了溶劑消耗；
5、本發(fā)明生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，均得到有效利用，無“三廢”產(chǎn)生，是典型的綠色生產(chǎn)工藝，便于推廣應(yīng)用。
四、具體實施方式
下面結(jié)合具體實施方式，進一步說明本發(fā)明。
實施例1
(1)制備蘿卜硫苷水解液
現(xiàn)有制備萊菔素的技術(shù)，按照專利號為201510270292.5介紹的方法制備出蘿卜硫苷水解液，用于下步制備萊菔素粗分離液。
(2)制備萊菔素粗分離液
將蘿卜硫苷水解液泵入管式離心機中，以0.5×104r/min的轉(zhuǎn)速進行離心分離，分別收集離心清液和離心沉淀。對收集的離心沉淀，為萊菔子分離蛋白，用于加工食品添加劑；對收集的離心清液，泵入截留分子量為0.5×104Da的超濾機中，在表壓為0.02MPa下進行超濾，直至超濾截留液為濾過液的1/8時止。分別收集超濾濾過液和超濾截留液，對收集的超濾截留液，主要含有多糖，用于加工萊菔子多糖；對收集的超濾濾過液，泵入截留分子量為200Da的納濾機中，在表壓為0.1MPa下進行納濾，直至納濾截留液為濾過液的1/8時止。分別收集納濾濾過液和納濾截留液，對收集的納濾截留液，主要含小分子肽，用于加工飼料添加劑；對收集的納濾濾過液，即為萊菔素粗分離液，用于制備萊菔素初步純化液。
(3)配制TBP或TRPO磺化煤油萃取液
將磷酸三丁酯(TBP)或三烷基氧化膦(TRPO)在攪拌下分散并溶解于磺化煤油中，配制出濃度為0.05mol/L的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，用于萃取萊菔素粗分離液中的萊菔素。
(4)制備萊菔素初步純化液
第(3)步結(jié)束后，將第(2)步收集的萊菔素粗分離液泵入萃取釜中，按照萊菔素粗分離液/濃度為0.05mol/L的TBP或TRPO磺化煤油萃取液的體積比(L/L)為1∶1的比例，與TBP或TRPO磺化煤油萃取液混合，在40r/min的轉(zhuǎn)速下萃取5min，然后靜止5min分層。分別收集上層荷載萊菔素的萃取液和下層卸載萊菔素的萃余液，對收集的下層卸載萊菔素的萃余液，泵入生化處理池，進行生物氧化，達標(biāo)后排放；對收集的上層荷載萊菔素的萃取液，加入0.05mol/L的氯化鈉溶液或氯化鉀溶液進行反萃取5min，然后靜止5min分層，其中萃取液與濃度0.05mol/L的氯化鈉溶液或氯化鉀溶液的體積比為1∶1。分別收集含萊菔素的氯化鈉或氯化鉀反萃取液和卸載萊菔素的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，對收集的含萊菔素的氯化鈉或氯化鉀反萃取液，即為萊菔素初步純化液，用于下步制備純化萊菔素濃縮液；對收集的卸載萊菔素的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，在0.5×104r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min。棄離心下層鹽溶液；收集離心上層清液，即獲得濃度為0.05mol/L的TBP或TRPO磺化煤油再生萃取液，該再生萃取液可用于下批次再次萃取萊菔素。
(5)制備純化萊菔素濃縮液
將第(4)步收集的萊菔素初步純化液用0.22μm微孔濾膜過濾后泵入制備色譜，進行第一次制備。制備條件為：流速20mL/min、波長254nm、柱溫25℃，在0～30min期間，甲醇/水體積比(L/L)為10％～30％/90％～70％；收集15～18min流出的液體，將其在真空度為0.06MPa下進行真空濃縮，直至無甲醇味時止。即為純化萊菔素濃縮液，用于下步制備萊菔素。
(6)制備萊菔素
第(5)步完成后，向第(5)步收集的純化萊菔素濃縮液中加入二氯甲烷進行萃取5min，純化萊菔素濃縮液/二氯甲烷體積比(L/L)為1∶1。萃取完成后靜止5min分層。分別收集上層萃取相和下層萃余液，對收集的萃取相，泵入低溫高真空溶劑回收裝置，在溫度為30℃、真空度為0.4kPa的條件下回收二氯甲烷，直至無二氯甲烷時止。就制備出純度達到99.14％的萊菔素，其收得率為脫脂萊菔子質(zhì)量的0.35～0.5％。對收集的萃余液，泵入生化池進行好氧氧化，達標(biāo)后排放。
實施例2
(1)制備蘿卜硫苷水解液
現(xiàn)有制備萊菔素的技術(shù)，按照專利號為201510270292.5介紹的方法制備出蘿卜硫苷水解液，用于下步制備萊菔素粗分離液。
(2)制備萊菔素粗分離液
將蘿卜硫苷水解液泵入管式離心機中，以1.0×104r/min的轉(zhuǎn)速進行離心分離，分別收集離心清液和離心沉淀。對收集的離心沉淀，為萊菔子分離蛋白，用于加工食品添加劑；對收集的離心清液，泵入截留分子量為0.75×104Da的超濾機中，在表壓為0.1MPa下進行超濾，直至超濾截留液為濾過液的1/9時止。分別收集超濾濾過液和超濾截留液，對收集的超濾截留液，主要含有多糖，用于加工萊菔子多糖；對收集的超濾濾過液，泵入截留分子量為300Da的納濾機中，在表壓為0.3MPa下進行納濾，直至納濾截留液為濾過液的1/9時止。分別收集納濾濾過液和納濾截留液，對收集的納濾截留液，主要含小分子肽，用于加工飼料添加劑；對收集的納濾濾過液，即為萊菔素粗分離液，用于制備萊菔素初步純化液。
(3)配制TBP或TRPO磺化煤油萃取液
將磷酸三丁酯(TBP)或三烷基氧化膦(TRPO)在攪拌下分散并溶解于磺化煤油中，配制出濃度為0.10mol/L的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，用于萃取萊菔素粗分離液中的萊菔素。
(4)制備萊菔素初步純化液
第(3)步結(jié)束后，將第(2)步收集的萊菔素粗分離液泵入萃取釜中，按照萊菔素粗分離液/濃度為0.10mol/L的TBP或TRPO磺化煤油萃取液的體積比(L/L)為1∶2的比例，與TBP或TRPO磺化煤油萃取液混合，在60r/min的轉(zhuǎn)速下萃取12min，然后靜止8min分層。分別收集上層荷載萊菔素的萃取液和下層卸載萊菔素的萃余液，對收集的下層卸載萊菔素的萃余液，泵入生化處理池，進行生物氧化，達標(biāo)后排放；對收集的上層荷載萊菔素的萃取液，加入0.12mol/L的氯化鈉溶液或氯化鉀溶液進行反萃取12min，然后靜止8min分層，其中萃取液與濃度0.12mol/L的氯化鈉溶液或氯化鉀溶液的體積比為1∶2。分別收集含萊菔素的氯化鈉或氯化鉀反萃取液和卸載萊菔素的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，對收集的含萊菔素的氯化鈉或氯化鉀反萃取液，即為萊菔素初步純化液，用于下步制備純化萊菔素濃縮液；對收集的卸載萊菔素的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，在0.6×104r/min的轉(zhuǎn)速下離心8min。棄離心下層鹽溶液；收集離心上層清液，即獲得濃度為0.10mol/L的TBP或TRPO磺化煤油再生萃取液，該再生萃取液可用于下批次再次萃取萊菔素。
(5)制備純化萊菔素濃縮液
將第(4)步收集的萊菔素初步純化液用0.22μm微孔濾膜過濾后泵入制備色譜，進行第一次制備。制備條件為：流速30mL/min、波長254nm、柱溫25℃，在0～30min期間，甲醇/水體積比(L/L)為10％～30％/90％～70％；收集15～18min流出的液體，將其在真空度為0.08MPa下進行真空濃縮，直至無甲醇味時止。即為純化萊菔素濃縮液，用于下步制備萊菔素。
(6)制備萊菔素
第(5)步完成后，向第(5)步收集的純化萊菔素濃縮液中加入二氯甲烷進行萃取8min，純化萊菔素濃縮液/二氯甲烷體積比(L/L)為1∶2。萃取完成后靜止8min分層。分別收集上層萃取相和下層萃余液，對收集的萃取相，泵入低溫高真空溶劑回收裝置，在溫度為38℃、真空度為20kPa的條件下回收二氯甲烷，直至無二氯甲烷時止。就制備出純度達到99.14％的萊菔素，其收得率為脫脂萊菔子質(zhì)量的0.35～0.5％。對收集的萃余液，泵入生化池進行好氧氧化，達標(biāo)后排放。
實施例3
(1)制備蘿卜硫苷水解液
現(xiàn)有制備萊菔素的技術(shù)，按照專利號為201510270292.5介紹的方法制備出蘿卜硫苷水解液，用于下步制備萊菔素粗分離液。
(2)制備萊菔素粗分離液
將蘿卜硫苷水解液泵入管式離心機中，以1.5×104r/min的轉(zhuǎn)速進行離心分離，分別收集離心清液和離心沉淀。對收集的離心沉淀，為萊菔子分離蛋白，用于加工食品添加劑；對收集的離心清液，泵入截留分子量為1×104Da的超濾機中，在表壓為0.2MPa下進行超濾，直至超濾截留液為濾過液的1/10時止。分別收集超濾濾過液和超濾截留液，對收集的超濾截留液，主要含有多糖，用于加工萊菔子多糖；對收集的超濾濾過液，泵入截留分子量為500Da的納濾機中，在表壓為0.5MPa下進行納濾，直至納濾截留液為濾過液的1/10時止。分別收集納濾濾過液和納濾截留液，對收集的納濾截留液，主要含小分子肽，用于加工飼料添加劑；對收集的納濾濾過液，即為萊菔素粗分離液，用于制備萊菔素初步純化液。
(3)配制TBP或TRPO磺化煤油萃取液
將磷酸三丁酯(TBP)或三烷基氧化膦(TRPO)在攪拌下分散并溶解于磺化煤油中，配制出濃度為0.15mol/L的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，用于萃取萊菔素粗分離液中的萊菔素。
(4)制備萊菔素初步純化液
第(3)步結(jié)束后，將第(2)步收集的萊菔素粗分離液泵入萃取釜中，按照萊菔素粗分離液/濃度為0.15mol/L的TBP或TRPO磺化煤油萃取液的體積比(L/L)為1∶3的比例，與TBP或TRPO磺化煤油萃取液混合，在80r/min的轉(zhuǎn)速下萃取20min，然后靜止10min分層。分別收集上層荷載萊菔素的萃取液和下層卸載萊菔素的萃余液，對收集的下層卸載萊菔素的萃余液，泵入生化處理池，進行生物氧化，達標(biāo)后排放；對收集的上層荷載萊菔素的萃取液，加入0.2mol/L的氯化鈉溶液或氯化鉀溶液進行反萃取20min，然后靜止10min分層，其中萃取液與濃度0.2mol/L的氯化鈉溶液或氯化鉀溶液的體積比為1∶3。分別收集含萊菔素的氯化鈉或氯化鉀反萃取液和卸載萊菔素的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，對收集的含萊菔素的氯化鈉或氯化鉀反萃取液，即為萊菔素初步純化液，用于下步制備純化萊菔素濃縮液；對收集的卸載萊菔素的TBP或TRPO磺化煤油萃取液，在0.8×104r/min的轉(zhuǎn)速下離心10min。棄離心下層鹽溶液；收集離心上層清液，即獲得濃度為0.15mol/L的TBP或TRPO磺化煤油再生萃取液，該再生萃取液可用于下批次再次萃取萊菔素。
(5)制備純化萊菔素濃縮液
將第(4)步收集的萊菔素初步純化液用0.45μm微孔濾膜過濾后泵入制備色譜，進行第一次制備。制備條件為：流速40mL/min、波長254nm、柱溫25℃，在0～30min期間，甲醇/水體積比(L/L)為10％～30％/90％～70％；收集15～18min流出的液體，將其在真空度為0.09MPa下進行真空濃縮，直至無甲醇味時止。即為純化萊菔素濃縮液，用于下步制備萊菔素。
(6)制備萊菔素
第(5)步完成后，向第(5)步收集的純化萊菔素濃縮液中加入二氯甲烷進行萃取10min，純化萊菔素濃縮液/二氯甲烷體積比(L/L)為1∶3。萃取完成后靜止10min分層。分別收集上層萃取相和下層萃余液，對收集的萃取相，泵入低溫高真空溶劑回收裝置，在溫度為45℃、真空度為40kPa的條件下回收二氯甲烷，直至無二氯甲烷時止。就制備出純度達到99.14％的萊菔素，其收得率為脫脂萊菔子質(zhì)量的0.35～0.5％。對收集的萃余液，泵入生化池進行好氧氧化，達標(biāo)后排放。