本發(fā)明涉及植物提取領域，尤其是一種從羅漢果中提取及檢測羅漢果苷的方法。

背景技術：

羅漢果里的葫蘆烷型三萜苷類成分是甜味物質的主要部分，主要為羅漢果苷Ⅳ(mogroside Ⅳ)、羅漢果苷Ⅴ(mogrosideⅤ)，羅漢果苷IV、羅漢果苷V分子結構上相差一個葡萄糖基，理學性質接近，很難分離。公布號為CN104069152 A的發(fā)明專利，公開了一種羅漢果苷Ⅳ含量高的提取物制備方法，羅漢果→磨碎→提取→過濾→濾液→膜分離→吸附分離→洗脫1 →乙醇回收1 →樹脂脫色→干燥→羅漢果甜苷粗品→水稀釋→大孔樹脂吸附→洗脫2 →乙醇回收2→減壓干燥→羅漢果提取物。劉金磊,李典鵬,黃永林等.HPLC法測定不同生長期羅漢果苷ⅡＥ、Ⅲ、Ⅴ的含量[J].廣西植物,2007,27(4):665-668，公開了用HPLC法測定同一產地不同生長期羅漢果中羅漢果苷ⅡE、Ⅲ、V的含量。采用外標法，檢測條件為：色譜柱為ZORBAXSB-C18柱(4.6 mm×150mm，5μrn)；柱溫為25℃；流動相為乙腈-水(體積比25:75)；流速為l mL/min；檢測波長為203 nm；進樣量為20 μL。在上述條件下羅漢果苷ⅡE、羅漢果苷Ⅲ和羅漢果苷V色譜峰與其它組分達到了良好分離。但是沒有從55天果齡羅漢果中提取羅漢果苷IV、苷V及同步檢測的方法報道。

技術實現要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種從55天果齡羅漢果中提取及檢測羅漢果苷IV、苷V的方法，所得到的羅漢果提取物中，羅漢果苷IV含量大于5.0%，羅漢果苷V含量大于15.0%，檢測時，羅漢果苷IV、羅漢果苷V的吸收峰明顯，出峰時間分開，實現同步提取、檢測羅漢果苷IV、羅漢果苷V。

為了解決該技術問題，以質量比計，本發(fā)明采取的技術方案是：

1、前處理

取55天果齡的新鮮羅漢果為原料，稱重、搗碎均勻；得羅漢果漿，備用。選取55天果齡的新鮮羅漢果為了確保原料中羅漢果苷IV、羅漢果苷V的含量都足以滿足同步提取和檢測，便于后面步驟。

2、提取

采用乙醇水溶液加超聲波輔助提取。確保羅漢果苷IV、羅漢果苷V同步充分快速提取。

以質量比例計，優(yōu)選料液比1:2，將60%乙醇水溶液加入羅漢果漿中，控制溫度為50℃，進行提?。挥?3Hz的超聲波輔助提取30min；將料液用離心機在2500r/min離心15min，抽濾；濾渣再用60%乙醇水溶重復提取一次；合并濾液，得到羅漢果初提液。

3、絮凝

用Ca（OH）₂乳濁液進行絮凝。除去羅漢果初提液中的雜質、果膠、蛋白質等，便于層析。

優(yōu)選加入羅漢果漿質量15%的10%Ca（OH）₂乳濁液，進行攪拌絮凝；

發(fā)現羅漢果提取液明顯出現大分子物質聚沉的現象，待降至室溫后，冷藏后取出，用離心機在2500 r/min的速度離心15min，抽濾，得到澄清溶液。

4、回收乙醇。便于層析時D101大孔樹脂對羅漢果苷IV、羅漢果苷V的充分吸附。

將到得澄清溶液濃縮至流浸膏狀態(tài)，回收除去乙醇；加入純水溶解流浸膏，得到提取澄清水溶液；

5、層析。采用D101大孔樹脂對羅漢果提取澄清水溶液進行吸附、分離、純化。

先上柱吸附，然后清洗、洗脫。

過柱條件：上樣液，將得到提取澄清水溶液調到pH為9.0，使用兩倍柱體積每小時的流速過柱；過柱完成后依次用純水、20%乙醇清洗、60%乙醇洗脫，流速都使用每小時兩倍柱體積過柱，60%乙醇洗脫液總用量為 3倍樹脂床體積（BV），收集60%乙醇洗脫液。

6、減壓濃縮，干燥。

將收集到的60%乙醇洗脫液減壓濃縮回收乙醇，得到濃縮液；將濃縮液進一步干燥，得到有高含量的羅漢果苷IV、羅漢果苷V的羅漢果提取物。

在此基礎上，用HPLC法對羅漢果提取物中羅漢果甜苷IV和甜苷V同時進行含量測定，檢測步驟如下：

1、標準品的制備

用萬分之一天平精確地稱量8.2mg 98.56%的羅漢果甜苷V標準品，置于10mL的容量瓶，用甲醇定容至刻度。在25℃下用超聲波藥品處理機超聲15min，溶解。并用微孔濾膜過濾所得溶液，將過濾后的液體置于進樣瓶待檢測。

再精確稱量3.0mg 98.79%的羅漢果甜苷IV標準品，處理方法和上述方法相同，最后置于進樣瓶待檢測，做好標記。

2、供試品的制備

精確稱量30mg左右的羅漢果提取物樣品，置于10ml的容量瓶，分別做好標記，并用甲醇定容至刻度，超聲波處理15min后，用針筒吸取樣品上清液，并經過微孔濾膜處理，將過濾后的樣品液置于進樣瓶待檢測，做好標記。

3、色譜柱條件

C18柱（4.6 mm×150mm），乙腈-水溶液的質量比例為21:79；檢測波長設為203nm；流速1 mL/min，柱溫25℃，進樣量10μL，跑柱30min。

4、處理流動相

將乙腈和純水分別通過過濾裝置，乙腈采用有機系濾膜，純水采用水系濾膜；過濾是為了除去液體里的顆粒雜質，防止大顆粒物質進入高效液相色譜儀從而損壞儀器。

將過濾后的液體分裝到干凈的流動相瓶子，并用保鮮膜封住瓶口，留一個小孔，再超聲處理20min，超聲處理流動相是為了除去液體里的氣泡。

所述的前處理、超聲波水-乙醇提取、濃縮、柱層析、干燥、HPLC檢測都為已知技術。

本發(fā)明具有下列優(yōu)點和特性：

1、組合技術新穎。

采用取55天果齡的新鮮羅漢果為原料，采用60%乙醇水溶液加超聲波輔助提取，控制料液比1:2，溫度為50℃，用53Hz的超聲波輔助提取30min；離心，用羅漢果漿質量15%的10% Ca（OH）₂乳濁液絮凝、離心、過濾、濃縮回收乙醇；采用D101大孔樹脂對羅漢果提取澄清水溶液進行分離、純化。pH為9.0，使用兩倍柱體積每小時的流速過柱；過柱完成后依次用純水、20%乙醇清洗、60%乙醇洗脫；收集60%乙醇洗脫液，減壓濃縮、干燥；得到有高含量的羅漢果苷IV、羅漢果苷V的羅漢果提取物。用HPLC法對提取物進行含量測定，色譜柱條件為C18柱（4.6 mm×150mm），乙腈-水溶液的質量比例為21:79；檢測波長設為203nm；流速1 mL/min，柱溫25℃，進樣量10μL，跑柱30min。檢測時，羅漢果苷IV、羅漢果苷V的吸收峰明顯，出峰時間分開，所得到的羅漢果提取物中，羅漢果苷IV含量大于5.0%，羅漢果苷V含量大于15.0%，實現羅漢果苷IV、羅漢果苷V同步提取和檢測。這些技術特征組合在一起，順序不能顛倒、密不可分、互相支持，共同作用，才能得到所屬的技術效果，組合技術方案不是已知技術，不是簡單的疊加，具有突出的實質性特點和顯著的進步。

2、提取和檢測方法組合在一起，實現羅漢果苷IV、羅漢果苷V同步高含量提取和檢測，為研究羅漢果果齡與羅漢果苷IV、羅漢果苷V含量變化打下基礎，具有實用性。

附圖說明

圖1：55天果齡羅漢果提取物HPLC圖譜

圖2：羅漢果苷Ⅳ和苷V標準品混合進樣HPLC圖譜。

具體實施方式

以下結合實施例，進一步說明本發(fā)明。

實施例1

高含量羅漢果苷IV、羅漢果苷V提取物同步提取方法：

1、取55天果齡的新鮮羅漢果2個，擦凈并稱重作好記錄，搗碎機搗碎，得到羅漢果漿；以固液比1:2加入60%的乙醇水溶液，置于超聲波儀器中。超聲條件：超聲波儀器頻率53HZ、功率100W、溫度50℃，超聲30min后取出，冷卻后紗布過濾，取濾液，將濾渣用相同法提取3次，合并3次濾液，待用。

加入羅漢果漿重量的15%的10% Ca（OH）₂懸濁液，并進行攪拌，此時會發(fā)現羅漢果提取液明顯出現大分子物質聚沉的現象，待溫度降至室溫后，將裝著羅漢果溶液的燒杯放入冰箱，2小時后取出，將溶液分批放入離心管，在離心機以2500 r/min的速度15min，合并上清液，最后抽濾得到澄清溶液。

（1）上柱

將處理過的澄清透明的羅漢果提取液置于大燒杯中，用4%的鹽酸調節(jié)pH為9.0，避免由pH過高引起的吸附效果不好。

因為提取液過堿，皂苷成分多數會以離子形態(tài)存在，而D101樹脂只能吸附分子形態(tài)物質；利用虹吸現象控制液體滴進柱子的速度，避免大量的液體灌入引起層析柱內樹脂表面不平整。

（2）調節(jié)流速

利用層析柱底部的閥控制上樣速度，速度為2BV/h；速度過慢會導致試驗周期過長，影響實驗效率，速度太快使樹脂吸附皂苷類物質不完全；柱體積為200ml；用10ml的量筒精確測量每分鐘流出的液體，推算準確的流出速度。

（3）水洗、20%乙醇洗脫

待羅漢果提取液完全通過樹脂后，用蒸餾水進行清洗，清洗掉除了吸附在樹脂之外的雜質等大顆粒物質，直到流出液為澄清透明狀。

再用20%乙醇來洗脫樹脂，除去部分水溶性雜質，速度控制在2BV/h。低濃度乙醇洗脫下來的洗脫液甜苷含量很低，而且還含有一些水溶性雜質，比如多糖類物質。

（4）60%乙醇洗脫

配制60%乙醇進行洗脫，速度控制在2BV/h，收集洗脫液500ml；

（5）濃縮干燥

將收集的500ml洗脫液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮回收乙醇，得到濃縮液；濃縮液用烘箱干燥，得到到含有羅漢果苷IV、羅漢果苷V的羅漢果提取物。經檢測計算，新鮮羅漢果提取物的提取率達到1.7%。

用HPLC法檢測步驟如下：

1）標準品的制備

用萬分之一天平精確地稱量8.2mg 98.56%的羅漢果甜苷V標準品，置于10mL的容量瓶，用甲醇定容至刻度，在25℃下用超聲波藥品處理機超聲15min，溶解，并用微孔濾膜過濾所得溶液，將過濾后的液體置于進樣瓶待檢測。再精確稱量3.0mg 98.79%的羅漢果甜苷IV標準品，處理方法和上述方法相同，最后置于進樣瓶待檢測，做好標記。

2）供試品的制備

精確稱量30mg左右的樣品，置于10mL的容量瓶，分別做好標記，并用甲醇定容至刻度，超聲波處理15min后，用針筒吸取樣品上清液，并經過微孔濾膜處理，將過濾后的樣品液置于進樣瓶待檢測，做好標記。

3）色譜柱條件

C18柱（4.6 mm×150mm），乙腈-水溶液的質量比例為21:79；檢測波長設為203nm；流速1 mL/min，柱溫25℃，進樣量10μL，跑柱30min。

4）處理流動相

將乙腈和純水分別通過過濾裝置，乙腈采用有機系濾膜，純水采用水系濾膜；過濾是為了除去液體里的顆粒雜質，防止大顆粒物質進入高效液相色譜儀從而損壞儀器。

將過濾后的液體分裝到干凈的流動相瓶子，并用保鮮膜封住瓶口，留一個小孔，再超聲處理20min，超聲處理流動相是為了除去液體里的氣泡。

5）樣品檢測

按照上述方法步驟進行檢測。圖1為55天果齡羅漢果提取物HPLC圖譜，圖2為羅漢果苷Ⅳ和苷V標準品混合進樣HPLC圖譜。將55天果齡的羅漢果所得的提取物進行檢測，檢測時，羅漢果苷IV、羅漢果苷V的吸收峰明顯，出峰時間分開，55天果齡所得到的羅漢果提取物中，羅漢果苷IV含量為5.02%，羅漢果苷V含量為15.77%。

按照上述方法步驟將不同果齡的羅漢果分別進行提取，將所得提取物進行檢測，得到的檢測結果見表1。

由表1結果可見，不同果齡的羅漢果所含有的羅漢果苷IV、羅漢果苷V是不同的，變化規(guī)律也不一樣。

本方法實現同步提取和檢測羅漢果苷IV、羅漢果苷V，對羅漢果苷IV、羅漢果苷V與果齡的關系研究有著指導意義。

表1 不同果齡羅漢果苷IV、羅漢果苷V含量檢測結果