本發(fā)明屬于野生食用菌馴化栽培技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種云南白靈芝(Ganoderma leucocontextum )液體菌種的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

靈芝是祖國(guó)中醫(yī)藥寶庫(kù)中的珍品，素有"仙草"之譽(yù)。東漢時(shí)期的《神農(nóng)本草經(jīng)》、明代李時(shí)珍的《本草綱目》，都對(duì)靈芝的功效有詳細(xì)的極為肯定的記載，在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中也有證實(shí)。靈芝中含有多種活性成分如多糖、甾類、三萜類、堿基、核苷、蟲(chóng)漆酸、有機(jī)鍺以及多種生物堿等，有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗癌等功效。靈芝作為有數(shù)千年藥用歷史的傳統(tǒng)珍貴藥材，藥用價(jià)值很高?，F(xiàn)代藥理學(xué)與臨床實(shí)踐進(jìn)一步證明靈芝有抗氧化、清除自由基、保護(hù)放射性損傷及化學(xué)治療藥物損傷等藥理作用?，F(xiàn)代研究表明, 靈芝能夠有效促進(jìn)新生神經(jīng)元的分化和減少氧化壓力引起的神經(jīng)元毒性,具有神經(jīng)保護(hù)功能, 能夠預(yù)防治療帕金森綜合征(Parkinson’s disease)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病, 在保健品、藥品研發(fā)上具有廣闊的應(yīng)用空間。

云南白靈芝是生長(zhǎng)在云南高海拔地區(qū)的靈芝種類，是靈芝屬(Ganoderma)中少見(jiàn)的低溫型種類，自然生長(zhǎng)在海拔2500米以上區(qū)域，以菌肉是肉質(zhì)、白色、質(zhì)地均勻而得名，價(jià)值很高，非常稀少。在云南省每年能夠收集到的野生云南白靈芝數(shù)量只有幾千公斤，而且越來(lái)越難以采集，物以稀為貴，云南白靈芝的價(jià)格一路飆升，更刺激了云南白靈芝產(chǎn)區(qū)群眾的采集熱情，但這對(duì)云南白靈芝野生資源的破壞是毀滅性的，同時(shí)也制約了云南白靈芝的可持續(xù)利用和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了開(kāi)發(fā)珍稀云南白靈芝資源, 利用本地區(qū)有利條件發(fā)展食藥用菌生產(chǎn), 本發(fā)明的目的在于培育出穩(wěn)定性好，代謝能力強(qiáng)，生產(chǎn)效率高的云南白靈芝原始母種并提供一種新的栽培云南白靈芝的液體菌種規(guī)?；囵B(yǎng)方法，該方法能快速地進(jìn)行云南白靈芝絲體的液體發(fā)酵培養(yǎng)，解決了云南白靈芝的人工栽培、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的菌種供應(yīng)問(wèn)題。

本發(fā)明是一種云南白靈芝液體菌種規(guī)?；a(chǎn)方法。精選自然生長(zhǎng)的云南白靈芝(Ganoderma leucocontextum)子實(shí)體，利用組織分離法獲得純菌株。通過(guò)人工栽培試驗(yàn)，優(yōu)選人工栽培云南白靈芝子實(shí)體進(jìn)行選育，經(jīng)過(guò)5-10代的系統(tǒng)培育得到穩(wěn)定性強(qiáng)，生產(chǎn)效率高的云南白靈芝原始母種。使用固化和液體培養(yǎng)基制備母種，使用液體培養(yǎng)基按照液體菌種培養(yǎng)方法進(jìn)行云南白靈芝絲體的發(fā)酵培養(yǎng)，規(guī)模化生產(chǎn)云南白靈芝原種和栽培種。具有成本低、易實(shí)現(xiàn)、可廣泛地應(yīng)用于云南白靈芝的大規(guī)模人工生產(chǎn)中。本發(fā)明中所提供的培養(yǎng)基和液體菌種生產(chǎn)方法，特別適合云南白靈芝的菌種制備與菌絲體的規(guī)?；后w發(fā)酵培養(yǎng)，利用該培養(yǎng)基和生產(chǎn)方法，可快速進(jìn)行云南白靈芝絲體發(fā)酵培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)云南白靈芝自然資源的可持續(xù)利用。

本發(fā)明的云南白靈芝液體菌種規(guī)?；a(chǎn)方法包括母種的來(lái)源（獲得），固化和液體母種制備、液體原種的制備、液體栽培種的制備。具體如下：

1、精選自然生長(zhǎng)的云南白靈芝(Ganoderma leucocontextum)子實(shí)體，利用組織分離法獲得純菌株。通過(guò)人工栽培試驗(yàn)，優(yōu)選人工栽培云南白靈芝子實(shí)體進(jìn)行選育，經(jīng)過(guò)5-10代的系統(tǒng)培育得到穩(wěn)定性好，代謝能力強(qiáng)，生產(chǎn)效率高的云南白靈芝原始母種；

2、配制擴(kuò)大母種：

A、母種液體搖瓶種子培養(yǎng)：挑取0.5-2㎝³大小的云南白靈芝原始試管母種，加入1-10mL無(wú)菌水，在無(wú)菌條件下使用振蕩器震蕩2-10分鐘，使之成糊狀，接入裝有100-500mL母種液體培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行液體母種培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：旋轉(zhuǎn)式搖床100-300轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為10-30℃，培養(yǎng)5-20天成為成熟液體母種；

B、固化母種擴(kuò)繁培養(yǎng)：將云南白靈芝原始試管母種挑取米粒大小的1-5塊轉(zhuǎn)接入含有母種固化培養(yǎng)基的250-500mL三角瓶中，接種塊間距1-5厘米，在10-30℃條件下培養(yǎng)10-20天菌落基本相連接即成為成熟固化母種；

所述液體培養(yǎng)基由葡萄糖5-10g，麥芽糖5-10g，鮮香蕉泥10-20g，鮮土豆泥10-20g，蛋白胨1-3g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂0.5g,水1000 mL組成，pH自然；母種固化培養(yǎng)基是在上述液體培養(yǎng)基中添加瓊脂10-20g配制而成；

3、原種液體搖瓶種子培養(yǎng)：

A、在500-1000mL搖瓶中裝入150-800mL液體培養(yǎng)基，0.14 MPa高壓蒸汽滅菌20-40分鐘，待冷卻到室溫后，嚴(yán)格無(wú)菌操作按液體培養(yǎng)基體積百分比1-10%的接種量接入成熟液體母種進(jìn)行液體原種培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：旋轉(zhuǎn)式搖床100-300轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為10-30℃，培養(yǎng)10-20天成為成熟液體原種；

B、在500-1000mL搖瓶中裝入150-800mL原種液體培養(yǎng)基，0.14 MPa高壓蒸汽滅菌20-40分鐘，待冷卻到室溫后，嚴(yán)格按無(wú)菌操作程序，將經(jīng)過(guò)高速分散器分散后的成熟固化母種接種到搖瓶中，接種量為每250-500mL三角瓶的成熟固化母種分散后接種5-10瓶500-1000mL搖瓶，接種后進(jìn)行原種液體搖瓶種子培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：旋轉(zhuǎn)式搖床100-300轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為10-30℃，培養(yǎng)10-20天成為成熟液體原種；

原種液體培養(yǎng)基組成為：葡萄糖15-30g，麥芽糖15-30g，蛋白胨3-5g，酵母粉3-5g，磷酸氫二鉀2-4g，硫酸鎂1-2g, 硫酸鋅0.2g、氯化錳0.2g、硫酸亞鐵0.2g、單寧0.1g,水1000mL組成，pH自然；

4、栽培種發(fā)酵罐培養(yǎng)：

以發(fā)酵培養(yǎng)基體積百分比1-10%的接種量把成熟液體原種接入裝有100-300升無(wú)菌發(fā)

酵培養(yǎng)基的栽培種子罐進(jìn)行液體栽培種培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度10-30℃，通氣量1:0.3-0.8V/V·min，攪拌速度50-200轉(zhuǎn)/分鐘，保持罐壓0.02-0.10 MPa，經(jīng)過(guò)10-20天通氣培養(yǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即可得到云南白靈芝液體菌種；

原種液體培養(yǎng)基組成為：10-30目細(xì)麩皮2-10g,葡萄糖10-20g，麥芽糖10-20g，蛋白胨2-3g，酵母粉2-3g，磷酸氫二鉀2-4g，硫酸鎂1-2g, 硫酸鋅0.2g、氯化錳0.2g、硫酸亞鐵0.2g、單寧0.1g,水1000mL組成，pH自然；

采用本發(fā)明培育的菌株和工藝培養(yǎng)云南白靈芝種可以快速和規(guī)模化培養(yǎng)，與傳統(tǒng)的固體發(fā)酵方式培養(yǎng)菌種相比，培養(yǎng)基的配方簡(jiǎn)單，降低了生產(chǎn)成本，云南白靈芝液體菌種在此條件下生長(zhǎng)良好，極大地縮短了菌種培養(yǎng)時(shí)間。本發(fā)明工藝生產(chǎn)的菌絲體在液體狀態(tài)下主要是依靠斷裂的菌絲體片段作為新的生長(zhǎng)點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上培養(yǎng)獲得大量菌絲。由于采用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的強(qiáng)壯菌種，保證了菌種接種后的及時(shí)萌發(fā)和定植生長(zhǎng)，能有效形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)保證發(fā)菌質(zhì)量，解決了云南白靈芝人工栽培、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展過(guò)程中的一些關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題。具有成本低、易實(shí)現(xiàn)、可廣泛地應(yīng)用于云南白靈芝的大規(guī)模人工生產(chǎn)中。本發(fā)明中所提供的培養(yǎng)基和液體菌種生產(chǎn)方法，特別適合云南白靈芝的菌種制備與菌絲體的規(guī)?；后w發(fā)酵培養(yǎng)，利用該培養(yǎng)基和生產(chǎn)方法，可快速進(jìn)行云南白靈芝絲體發(fā)酵培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)云南白靈芝自然資源的可持續(xù)利用和產(chǎn)業(yè)化。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

1、云南白靈芝原始母種的獲得：

精選自然生長(zhǎng)的云南白靈芝(Ganoderma leucocontextum)子實(shí)體，利用組織分離法獲得純菌株。通過(guò)人工栽培試驗(yàn)，優(yōu)選人工栽培云南白靈芝子實(shí)體進(jìn)行選育，經(jīng)過(guò)5-10代的系統(tǒng)培育得到穩(wěn)定性好，代謝能力強(qiáng)，生產(chǎn)效率高的云南白靈芝原始母種；

2、配制擴(kuò)大母種：

母種液體搖瓶種子培養(yǎng)：挑取1㎝³大小的云南白靈芝原始試管母種，加入5mL無(wú)菌水，在無(wú)菌條件下使用振蕩器震蕩5分鐘，使之成糊狀，接入裝有150mL母種液體培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行液體母種培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：旋轉(zhuǎn)式搖床150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為20-30℃，培養(yǎng)10天成為成熟液體母種；

所述液體培養(yǎng)基由葡萄糖10g，麥芽糖5g，鮮香蕉泥20g，鮮土豆泥10g，蛋白胨2g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂0.5g,水1000 mL組成，pH自然；

3、原種液體搖瓶種子培養(yǎng)：

在500mL搖瓶中裝入200mL液體培養(yǎng)基，0.14 MPa高壓蒸汽滅菌30分鐘，待冷卻到室溫后，嚴(yán)格無(wú)菌操作按液體培養(yǎng)基體積百分比2%的接種量接入成熟液體母種進(jìn)行液體原種培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：旋轉(zhuǎn)式搖床150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為20-30℃，培養(yǎng)10天成為成熟液體原種；

原種液體培養(yǎng)基組成為：葡萄糖30g，麥芽糖15g，蛋白胨5g，酵母粉3g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂1g, 硫酸鋅0.2g、氯化錳0.2g、硫酸亞鐵0.2g、單寧0.1g,水1000mL組成，pH自然；

4、栽培種發(fā)酵罐培養(yǎng)：

以發(fā)酵培養(yǎng)基體積百分比5%的接種量把成熟液體原種接入裝有150升無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基的栽培種子罐進(jìn)行液體栽培種培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度20-30℃，通氣量1:0.3-0.8V/V·min，攪拌速度100轉(zhuǎn)/分鐘，保持罐壓0.02-0.10 MPa，經(jīng)過(guò)10-20天通氣培養(yǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即可得到云南白靈芝液體菌種；

原種液體培養(yǎng)基組成為：10-30目細(xì)麩皮5g,葡萄糖20g，麥芽糖10g，蛋白胨3g，酵母粉2g，磷酸氫二鉀4g，硫酸鎂2g, 硫酸鋅0.2g、氯化錳0.2g、硫酸亞鐵0.2g、單寧0.1g,水1000mL組成，pH自然；

栽培種發(fā)酵罐培養(yǎng)完畢將液體菌種按無(wú)菌操作轉(zhuǎn)移到其他容器妥善保存，并盡快應(yīng)用于云南白靈芝的規(guī)模化人工栽培生產(chǎn)中。

實(shí)施例 2：

1、云南白靈芝原始母種的獲得：

與“實(shí)施例1”相同；

2、配制擴(kuò)大母種：

固化母種擴(kuò)繁培養(yǎng)：將云南白靈芝原始試管母種挑取米粒大小的5塊轉(zhuǎn)接入含有母種固化培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，接種塊間距3-5厘米，在20-30℃條件下培養(yǎng)10-20天菌落基本相連接即成為成熟固化母種；

所述固化培養(yǎng)基由鮮香蕉泥20g，瓊脂15g，鮮土豆泥10g，葡萄糖10g，麥芽糖5g，蛋白胨2g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂0.5g,水1000 mL組成，pH自然；

3、原種液體搖瓶種子培養(yǎng)：

在500mL搖瓶中裝入200mL原種液體培養(yǎng)基，0.14 MPa高壓蒸汽滅菌30分鐘，待冷卻到室溫后，嚴(yán)格按無(wú)菌操作程序，將經(jīng)過(guò)高速分散器分散后的成熟固化母種接種到搖瓶中，接種量為每500mL三角瓶的成熟固化母種分散后接種10瓶500mL搖瓶，接種后進(jìn)行原種液體搖瓶種子培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：旋轉(zhuǎn)式搖床200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為20-30℃，培養(yǎng)10-20天成為成熟液體原種；

原種液體培養(yǎng)基組成為：葡萄糖15g，麥芽糖30g，蛋白胨3g，酵母粉5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂1g, 硫酸鋅0.2g、氯化錳0.2g、硫酸亞鐵0.2g、單寧0.1g,水1000mL組成，pH自然；

（4）栽培種發(fā)酵罐培養(yǎng)：

與“實(shí)施例1”相同；

栽培種發(fā)酵罐培養(yǎng)完畢將液體菌種按無(wú)菌操作轉(zhuǎn)移到其他容器妥善保存，并盡快應(yīng)用于云南白靈芝的規(guī)?；斯ぴ耘嗌a(chǎn)中。

實(shí)施例 3：

1、云南白靈芝原始母種的獲得：

與“實(shí)施例1”相同；

2、配制擴(kuò)大母種：

與“實(shí)施例1”相同；

3、原種液體搖瓶種子培養(yǎng)：

在1000mL搖瓶中裝入700mL液體培養(yǎng)基，0.14 MPa高壓蒸汽滅菌40分鐘，待冷卻到室溫后，嚴(yán)格無(wú)菌操作按液體培養(yǎng)基體積百分比10%的接種量接入成熟液體母種進(jìn)行液體原種培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：旋轉(zhuǎn)式搖床250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為20-30℃，培養(yǎng)10天成為成熟液體原種；

原種液體培養(yǎng)基組成為：葡萄糖15g，麥芽糖30g，蛋白胨4g，酵母粉4g，磷酸氫二鉀4g，硫酸鎂2g, 硫酸鋅0.2g、氯化錳0.2g、硫酸亞鐵0.2g、單寧0.1g,水1000mL組成，pH自然；

4、栽培種發(fā)酵罐培養(yǎng)：

以發(fā)酵培養(yǎng)基體積百分比10%的接種量把成熟液體原種接入裝有200升無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基的栽培種子罐進(jìn)行液體栽培種培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度20-30℃，通氣量1:0.3-0.8V/V·min，攪拌速度150轉(zhuǎn)/分鐘，保持罐壓0.02-0.10 MPa，經(jīng)過(guò)10天通氣培養(yǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即可得到云南白靈芝液體菌種；

原種液體培養(yǎng)基組成為：10-30目細(xì)麩皮10g,葡萄糖10g，麥芽糖15g，蛋白胨2g，酵母粉2g，磷酸氫二鉀4g，硫酸鎂2g, 硫酸鋅0.2g、氯化錳0.2g、硫酸亞鐵0.2g、單寧0.1g,水1000mL組成，pH自然；

栽培種發(fā)酵罐培養(yǎng)完畢將液體菌種按無(wú)菌操作轉(zhuǎn)移到其他容器妥善保存，并盡快應(yīng)用于云南白靈芝的規(guī)?；斯ぴ耘嗌a(chǎn)中。