本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種利用微量通氣提高菌株對抑制物抗性的方法。

背景技術(shù)：

木質(zhì)纖維素原料轉(zhuǎn)化為生物燃料，如乙醇，可緩解對于汽油的需求，并且可將多樣化天然草培育，可持續(xù)農(nóng)業(yè)，森林學結(jié)合一起而減少CO₂的積累；而且，利用木質(zhì)纖維素乙醇為交通工具的燃料，相比于汽油可減少88％溫室氣體的排放，而這遠遠高于使用玉米乙醇所減少的18％；[Yi-Kai Su.,Laura B.Willis.,Thomas W.Jeffries.,Effects of Aeration on Growth,Ethanol and Polyol Accumulation by Spathaspora passalidarum NRRL Y-27907and Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124.Biotechnology and Bioengineering.2015；112:457–469.]

木質(zhì)纖維素原料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等成分組成；纖維素和半纖維素水解后可產(chǎn)生葡萄糖、木糖、阿拉伯糖以及其他單糖，但木質(zhì)纖維素原料必須經(jīng)過預處理后，才能被生物酶所水解；在木質(zhì)纖維素原料預處理過程中生成的一些毒性副產(chǎn)物，對后續(xù)發(fā)酵過程存在抑制作用，不利于生物轉(zhuǎn)化的進行；

木質(zhì)纖維素來源和處理方式的不同，預處理時產(chǎn)生的抑制物的種類和含量也不盡相同，其主要包括有機酸、吠喃衍生物和酚類物質(zhì)；幾類物質(zhì)的抑制作用機理各不相同；弱酸造成了胞內(nèi)環(huán)境的酸化，必須通過消耗ATP將多余的質(zhì)子泵出以維持胞內(nèi)的中性環(huán)境，影響了細胞正常的能量供給[Hyland P B,Mun S L S,Mahadevan R.Prediction of weak acid toxicity in Saccharomyces cerevisiae using genome-scale metabolic models[J].Industrial Biotechnology,2013,9(4):229-235]；糠醛等抑制物能抑制胞內(nèi)的NAD(P)H的合成，或者加快其降解[Liu Chenguang,Xue Chuang,Lin Yenhan,Bai Fengwu.Redo:potential control and applications in microaerobic and anaerobe fermentations[J].Biotechnology Advances,2013,31(2):257-265]；而NAD(P)H/NAD(P)⁺作為主要的輔因子，參與細胞多個物質(zhì)代謝和能量代謝過程；酚類化合物是蛋白質(zhì)變性劑，其對酵母的毒性最大，主要通過對細胞膜的損傷(影響細胞膜的完整性和選擇透過性等)來影響細胞代謝；目前，多采用以下幾種方法來降低各類抑制物對發(fā)酵過程的影響：1.改善預處理條件降低副產(chǎn)物的生成[Parawira W,Tekere M.Biotechnological strategies to overcome inhibitors in lignocellulose hydrolysates for ethanol production:review[J].Critical Reviews in Biotechnology,2011,31(1):20-31]；2.使用脫毒技術(shù)去除毒性副產(chǎn)物[楊秀山.復合菌種對木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物的原位脫毒乙醇發(fā)酵方法.專利200810222897.7；Cavka A,LJ.Detoxification of lignocellulosic hydrolysates using sodium borohydride.Bioresour Technol.2013,136:368-76]；3.通過長期馴化的方法或基因工程過表達某些基因得到具有抑制物抗性的微生物；[Wang Xin,Bai Xue,Chen Dong-Fang,Chen Fu-Zan,Li Bing-Zhi,Yuan Ying-Jin.Increasing proline and myo-inositol improves tolerance of Saccharomyces cerevisiae to the mixture of multiple lignocellulose-derived inhibitors[J].Biotechnol Biofuels(2015)8:142]；4.通過在培養(yǎng)基中添加還原性試劑的手段提高細胞的抗性[Alriksson B,Cavka A,Jonsson L J.Improving the fermentability of enzymatic hydrolysates of lignocellulose through chemical in-situ detoxification with reducing agents[J].Bioresource Technology,2011,102(2):1254-1263]；

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種利用微量通氣的方法提高菌株對多種抑制物甲酸、乙酸、糠醛和羥甲基糠醛抗性的方法；

本發(fā)明的一種利用微量通氣提高菌株對抑制物抗性的方法，包括以下步驟：

1)取馬克斯克魯維酵母1727(Kluyveromyces.marxianus 1727)菌株進行擴大培養(yǎng)；

2)將經(jīng)過步驟1)擴大培養(yǎng)后的菌種接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制初始菌體濃度OD₆₂₀1～3，溫度30～45℃，轉(zhuǎn)速120～180rpm/min，pH值4～6，以及0.1～1vvm的微量通氣，發(fā)酵72～168h得到發(fā)酵液；

3)對步驟2)的發(fā)酵液組分進行分析；

其中，所述馬克斯克魯維酵母1727(K.marxianus 1727)為中國工業(yè)微生物保藏中心保藏菌株，菌種編號為1277；

所述步驟1)中，所述擴大培養(yǎng)的步驟的培養(yǎng)條件具體為：控制擴大培養(yǎng)基的pH值4～6，溫度28～35℃，轉(zhuǎn)速100～200rpm/min；

所述步驟1)中，所述擴大培養(yǎng)步驟所選用的擴大培養(yǎng)基包括酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖或木糖20g/L；

所述步驟2)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)步驟所選用的發(fā)酵培養(yǎng)基為中包括重量百分含量為2～10％的葡萄糖以及重量百分含量為1～6％的木糖；

所述發(fā)酵培養(yǎng)基中還包括酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L，經(jīng)過無菌處理使用；

所述步驟2)中，將經(jīng)過步驟1)擴大培養(yǎng)后的菌種經(jīng)離心濃縮，無菌水重懸，控制OD₆₂₀ 1～3并接種至步驟2)中的發(fā)酵培養(yǎng)基中；

所述離心操作速度為5000～10000rpm/min、時間5～8min；

所述步驟1)中，還包括在所述擴大培養(yǎng)步驟前將所述菌種進行種子液培養(yǎng)的步驟，所用種子液培養(yǎng)步驟條件為：控制pH值4～6，培養(yǎng)溫度25～35℃，轉(zhuǎn)速100～200rpm/min；

所述種子液培養(yǎng)步驟的種子液培養(yǎng)基包括酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，經(jīng)過無菌處理使用；

進一步的，所述種子液培養(yǎng)為：將所述馬克斯克魯維酵母1727采用所述種子液培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD₆₂₀至1.5～2.5；

所述步驟2)中，所述生物量測定，使用酶標儀(Thermo labsystems Multiskan Ascent 354)測OD₆₂₀值；

所述步驟3)中，所述組分分析方法，發(fā)酵液經(jīng)0.45μm親水性微孔濾膜過濾后，使用高效液相色譜(Waters 410，Waters，MA，USA)分析各組分的量；色譜柱為有機酸分析柱(300mm×7.8mm，Bio-Rad，Hercules，Aminex HPX-87H)，進樣量20μ1，流動相為0.01mmol·L^-1硫酸溶液，流速為0.5ml·min^-1，示差檢測器溫度50℃，柱溫50℃；

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1.本發(fā)明的利用微量通氣提高菌株對纖維素水解液抑制物抗性的方法，在所述發(fā)酵步驟中，通過調(diào)節(jié)通氣量，使得所述微生物在含有多種抑制物混合物的葡萄糖發(fā)酵中，發(fā)酵時間縮短明顯縮短，且發(fā)酵活力增強乙醇得率維持不變，具有簡單、成本低的特點。

2.本發(fā)明的利用微量通氣提高菌株對纖維素水解液抑制物抗性的方法，通過本方法進行的木糖的發(fā)酵與未通氣對照組相比，具有多種纖維素水解液抑制物耐受性，且在四種較高濃度混合抑制物條件下，發(fā)酵時間縮短，剩余木糖大幅度減少，且木糖醇產(chǎn)率提高。

3.本發(fā)明的利用微量通氣提高菌株對纖維素水解液抑制物抗性的方法，通過本方法進行葡萄糖和木糖混合碳源的發(fā)酵與未通氣對照組相比，在四種較高濃度混合抑制物條件下，具有促進葡萄糖和木糖同時發(fā)酵的作用，且乙醇產(chǎn)率保持不變，木糖醇的產(chǎn)率提高。

附圖說明

圖1示不同通氣量下100g/L葡萄糖培養(yǎng)基中K.marxianus 1727發(fā)酵性能考察。

圖2示不同通氣量下35g/L木糖培養(yǎng)基中K.marxianus 1727發(fā)酵性能考察；其中圖2A示木糖變化曲線；圖2B示木糖醇變化曲線。

圖3示不同通氣量下40g/L葡萄糖和20g/L木糖培養(yǎng)基中K.marxianus 1727發(fā)酵性能考察；其中圖3A示葡萄糖、乙醇變化曲線；圖3B示木糖、木糖醇變化曲線。

圖4示不同通氣量下100g/L葡萄糖和35g/L木糖培養(yǎng)基中K.marxianus 1727發(fā)酵性能考察；其中圖4A示葡萄糖、乙醇變化曲線；圖4B示木糖、木糖醇變化曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的一種提高馬克斯克魯維酵母對纖維素水解液抑制物耐受性的方法做更加具體的描述；

實施例1

本實施例的微量通氣提高菌株對纖維素水解液抑制物抗性的方法，包括以下步驟：

1)取所述馬克斯克魯維酵母1727(K.marxianus 1727)菌株進行種子培養(yǎng)、擴大培養(yǎng)；其培育過程具體為：

種子培養(yǎng)：將酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L經(jīng)121℃、15min滅菌制備得到種子液培養(yǎng)基，將所述馬克斯克魯維酵母1727(K.marxianus 1727)菌株接種至所述培養(yǎng)基，培養(yǎng)18h至菌種濃度達到OD₆₂₀至2～2.4；

擴大培養(yǎng)：取所述種子培養(yǎng)中得到的菌體，按接種量6％接種到含有擴培培養(yǎng)基的搖瓶中，擴培溫度30℃，轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)時間14h至菌種濃度達到OD₆₂₀至2～2.4；

所述擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基；含有葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L；

2)取所述擴大培養(yǎng)中得到的菌株，離心濃縮(5000rpm/min 8min)，無菌水重懸調(diào)節(jié)初始接種OD₆₂₀至2，并接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度保持在30℃，轉(zhuǎn)速150rpm/min，調(diào)節(jié)pH值至5，保持0.5vvm的通氣量；

所述發(fā)酵的培養(yǎng)基為添加了多種抑制物的10％葡萄糖培養(yǎng)基；含100g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉，經(jīng)121℃、15min滅菌處理冷卻后加入復合抑制物，包括0.8g/L甲酸、1.5g/L乙酸、0.8g/L糠醛和0.6g/L五羥甲基糠醛；

3)取步驟2)中的發(fā)酵液10000rpm離心5min后，上清液用于測定發(fā)酵產(chǎn)物和殘?zhí)呛浚?/p>

實施例2

本實施例微量通氣提高菌株對纖維素水解液抑制物抗性的方法，取所述馬克斯克魯維酵母1727(K.marxianus 1727)菌株，采用與實施例1相同的方法進行種子培養(yǎng)與擴大培養(yǎng)，并采用相同的發(fā)酵液、發(fā)酵條件進行發(fā)酵，區(qū)別特征僅在于：發(fā)酵過程保持0.2vvm的通氣量；

實施例3

本實施例微量通氣提高菌株對纖維素水解液抑制物抗性的方法，取所述馬克斯克魯維酵母1727(K.marxianus 1727)菌株，采用與實施例1相同的方法進行種子培養(yǎng)與擴大培養(yǎng)，并采用相同的發(fā)酵液、發(fā)酵條件進行發(fā)酵，區(qū)別特征僅在于：發(fā)酵過程保持1vvm的通氣量；

結(jié)果：由圖1可知，在復合抑制物存在條件下，以100g/L葡萄糖為碳源時，通氣與未通氣的發(fā)酵性能區(qū)別明顯；微量通氣條件下，葡萄糖消耗速率和乙醇生產(chǎn)速率顯著加快；未通氣條件下14h發(fā)酵才結(jié)束、而0.2、0.5、1vvm條件下分別8h、9h、9h發(fā)酵就結(jié)束，時間分別縮短了43％、36％、36％；且不同通氣量與未通氣條件下終乙醇產(chǎn)量未出現(xiàn)明顯差異，分別為41.5、41.5、40.8、42.6g/L；其乙醇的率分別為0.41、0.41、0.4、0.43g/g；

實施例4

本實施例的微量通氣提高菌株對纖維素水解液抑制物抗性的方法，包括以下步驟：

1)取所述馬克斯克魯維酵母1727(K.marxianus 1727)菌株進行種子培養(yǎng)、擴大培養(yǎng)；其培育過程具體為：

種子培養(yǎng)：將酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L經(jīng)121℃、15min滅菌制備得到種子液培養(yǎng)基，將所述馬克斯克魯維酵母1727(K.marxianus 1727)菌株接種至所述培養(yǎng)基，培養(yǎng)18h至菌種濃度達到OD₆₂₀至2～2.4；

擴大培養(yǎng)：取所述種子培養(yǎng)中得到的菌體，按接種量6％接種到含有擴培培養(yǎng)基的搖瓶中，擴培溫度30℃，轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)時間48h至菌種濃度達到OD₆₂₀至4～5；

所述擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基為2％木糖培養(yǎng)基；含有木糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L；

2)取所述擴大培養(yǎng)中得到的菌株，離心濃縮(5000rpm/min 8min)，無菌水重懸調(diào)節(jié)初始接種OD₆₂₀至2，并接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度保持在30℃，轉(zhuǎn)速150rpm/min，調(diào)節(jié)pH值至5，保持0.5vvm通氣量，發(fā)酵108h；

所述發(fā)酵的培養(yǎng)基為添加了復合抑制物3.5％木糖培養(yǎng)基；含35g/L木糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉，經(jīng)121℃、15min滅菌處理冷卻后加入復合抑制物，包括0.6g/L甲酸、1.2g/L乙酸、0.6g/L糠醛和0.5g/L五羥甲基糠醛；

3)取步驟2)中的發(fā)酵液10000rpm離心5min后，上清液用于測定發(fā)酵產(chǎn)物和殘?zhí)呛浚?/p>

實施例5

本實施例微量通氣提高菌株對纖維素水解液抑制物抗性的方法，取所述馬克斯克魯維酵母1727(K.marxianus 1727)菌株，采用與實施例4相同的方法進行種子培養(yǎng)與擴大培養(yǎng)，并采用相同的發(fā)酵液、發(fā)酵條件進行發(fā)酵，區(qū)別特征僅在于：發(fā)酵過程保持0.2vvm的通氣量；

實施例6

本實施例微量通氣提高菌株對纖維素水解液抑制物抗性的方法，取所述馬克斯克魯維酵母1727(K.marxianus 1727)菌株，采用與實施例4相同的方法進行種子培養(yǎng)與擴大培養(yǎng)，并采用相同的發(fā)酵液、發(fā)酵條件進行發(fā)酵，區(qū)別特征僅在于：發(fā)酵過程保持1vvm的通氣量；

結(jié)果：由圖2A、2B可知，在復合抑制劑存在條件下，以35g/L木糖為碳源發(fā)酵時，隨著通氣量增加，耗糖速率增加，相應(yīng)的木糖醇生產(chǎn)速率加快；0.2、0.5、1vvm通氣量條件下，發(fā)酵至108h殘?zhí)欠謩e為4.92g/L、0.63g/L、0g/L；而未通氣殘?zhí)歉哌_24.1g/L；且通氣的增加使糖醇產(chǎn)量的明顯增多，分別為22.6、24.4、23.1g/L，而未通氣木糖醇產(chǎn)量僅為9.9g/L；0.2、0.5、1vvm通氣量條件下木糖醇得率分別0.73、0.7、0.66g/g；

實施例7

本實施例的微量通氣提高菌株對纖維素水解液抑制物抗性的方法，包括以下步驟：

1)取所述馬克斯克魯維酵母1727(K.marxianus 1727)菌株進行種子培養(yǎng)、擴大培養(yǎng)；其培育過程具體為：

種子培養(yǎng)：將酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L經(jīng)121℃、15min滅菌制備得到種子液培養(yǎng)基，將所述馬克斯克魯維酵母1727(K.marxianus 1727)菌株接種至所述培養(yǎng)基，培養(yǎng)18h至菌種濃度達到OD₆₂₀至2～2.4；

擴大培養(yǎng)：取所述種子培養(yǎng)中得到的菌體，按接種量6％接種到含有擴培培養(yǎng)基的搖瓶中，擴培溫度30℃，轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)時間48h至菌種濃度達到OD₆₂₀至4～5；

所述擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基為2％木糖培養(yǎng)基；含有木糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L；

2)取所述擴大培養(yǎng)中得到的菌株，離心濃縮(5000rpm/min 8min)，無菌水重懸調(diào)節(jié)初始接種OD₆₂₀至2，并接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度保持在30℃，轉(zhuǎn)速150rpm/min，調(diào)節(jié)pH值至5，保持0.5vvm通氣量，發(fā)酵144h；

所述發(fā)酵的培養(yǎng)基為添加了復合抑制物的4％葡萄糖、2％木糖培養(yǎng)基；含40g/L葡萄糖、20g/L木糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉，經(jīng)121℃、15min滅菌處理冷卻后加入復合抑制物，包括0.6g/L甲酸、1.2g/L乙酸、0.6g/L糠醛和0.5g/L五羥甲基糠醛；

3)取步驟2)中的發(fā)酵液10000rpm離心5min后，上清液用于測定發(fā)酵產(chǎn)物和殘?zhí)呛浚?/p>

實施例8

本實施例的微量通氣提高菌株對纖維素水解液抑制物抗性的方法，包括以下步驟：

1)取所述馬克斯克魯維酵母1727(K.marxianus 1727)菌株進行種子培養(yǎng)、擴大培養(yǎng)；其培育過程具體為：

種子培養(yǎng)：將酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L經(jīng)121℃、15min滅菌制備得到種子液培養(yǎng)基，將所述馬克斯克魯維酵母1727(K.marxianus 1727)菌株接種至所述培養(yǎng)基，培養(yǎng)18h至菌種濃度達到OD₆₂₀至2～2.4；

擴大培養(yǎng)：取所述種子培養(yǎng)中得到的菌體，按接種量6％接種到含有擴培培養(yǎng)基的搖瓶中，擴培溫度30℃，轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)時間48h至菌種濃度達到OD₆₂₀至4～5；

所述擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基為2％木糖培養(yǎng)基；含有木糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L；

2)取所述擴大培養(yǎng)中得到的菌株，離心濃縮(5000rpm/min 8min)，無菌水重懸調(diào)節(jié)初始接種OD₆₂₀至2，并接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度保持在30℃，轉(zhuǎn)速150rpm/min，調(diào)節(jié)pH值至5，保持0.5vvm通氣量，發(fā)酵144h；

所述發(fā)酵的培養(yǎng)基為添加了復合抑制物的10％葡萄糖、3.5％木糖培養(yǎng)基；含100g/L葡萄糖、35g/L木糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉，經(jīng)121℃、15min滅菌處理冷卻后加入復合抑制物，包括0.6g/L甲酸、1.2g/L乙酸、0.6g/L糠醛和0.5g/L五羥甲基糠醛；

3)取步驟2)中的發(fā)酵液10000rpm離心5min后，上清液用于測定發(fā)酵產(chǎn)物和殘?zhí)呛浚?/p>

結(jié)果：由圖3A、3B、4A、4B可知，在復合抑制存在條件下，無論是較高濃度，還是低濃度葡萄糖、木糖組成的混合糖發(fā)酵通氣與未通氣狀況的發(fā)酵性能差異明顯；微量通氣與未通氣相比，耗糖速率及木糖醇得率都更高；在低濃度混合糖發(fā)酵狀況下，微量通氣，40g/L葡萄糖耗完時間由不通氣的6h提前至4h，發(fā)酵時間縮短了30～40％，而100g/L葡萄糖發(fā)酵時間由由不通氣的18h提前至12h，發(fā)酵時間也縮短了30～40％，且兩種情況與未通氣條件下乙醇得率差別不大，都為0.42g/g；對于木糖的發(fā)酵，未通氣條件下，20g/L和40g/L發(fā)酵至108h殘?zhí)呛糠謩e為16.9g/L、25.1g/L，木糖醇產(chǎn)量分別為1.6g/L、3g/L，其木糖醇得率分別為0.35g/g、0.23g/g；微量通氣條件下，20g/L和40g/L兩種狀況發(fā)酵結(jié)束時殘?zhí)呛糠謩e為4.6g/L、11g/L，木糖醇產(chǎn)量分別為6.2g/L、9.9g/L，其木糖醇得率分別為0.42g/g、0.37g/g；

對比例1

本對比例的方法，取所述馬克斯克魯維酵母1727(K.marxianus 1727)菌株，采用與實施例1相同的方法進行種子培養(yǎng)與擴大培養(yǎng)，并采用相同的發(fā)酵液、發(fā)酵條件進行發(fā)酵，區(qū)別特征僅在于：發(fā)酵過程不通氣；

對比例2

本對比例的方法，取所述馬克斯克魯維酵母1727(K.marxianus 1727)菌株，采用與實施例4相同的方法進行種子培養(yǎng)與擴大培養(yǎng)，并采用相同的發(fā)酵液、發(fā)酵條件進行發(fā)酵，區(qū)別特征僅在于：發(fā)酵過程不通氣；

對比例3

本對比例的方法，取所述馬克斯克魯維酵母1727(K.marxianus 1727)菌株，采用與實施例7相同的方法進行種子培養(yǎng)與擴大培養(yǎng)，并采用相同的發(fā)酵液、發(fā)酵條件進行發(fā)酵，區(qū)別特征僅在于：發(fā)酵過程不通氣；

對比例4

本對比例的方法，取所述馬克斯克魯維酵母1727(K.marxianus 1727)菌株，采用與實施例8相同的方法進行種子培養(yǎng)與擴大培養(yǎng)，并采用相同的發(fā)酵液、發(fā)酵條件進行發(fā)酵，區(qū)別特征僅在于：發(fā)酵過程不通氣。