本發(fā)明屬于動物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及豬肝羧酸酯酶基因(簡稱PLE1)的調(diào)控序列，對該調(diào)控序列進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析和功能驗(yàn)證。
背景技術(shù)：
：豬肝羧酸酯酶(piglivercarboxylesterase,PLE)又稱為豬肝酯酶(pigliveresterase)，是由多種同功酶組成的酶家族。PLE獨(dú)特的手性水解特性使得其在有機(jī)化學(xué)合成領(lǐng)域具有不可取代的地位(Roberti2000)，也使得對PLE近一個世紀(jì)的研究主要圍繞其在有機(jī)化學(xué)合成方面的應(yīng)用開展。研究發(fā)現(xiàn)，PLE能夠水解丁酰膽堿、芳香胺等內(nèi)外源性酯類、酰胺類化合物，因此有理由相信PLE在豬體內(nèi)酯類物質(zhì)代謝等生理過程中發(fā)揮重要作用，如藥物的代謝(Morris2008)、毒物的解毒、調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥水平等(Liu2015,Brüsehaber2009)。PLE是哺乳動物中最復(fù)雜的羧酸酯酶家族，成員多且理化特性相似，用物理化學(xué)方法很難分離純化獲得單一成分的同工酶。早在20世紀(jì)60年代，人們就嘗試從豬肝臟中提取天然的PLE，發(fā)現(xiàn)從豬肝臟中提取的PLE是多種同工酶的混合物，且同工酶的水解特性各不相同(Adler1961)，這些因素嚴(yán)重阻礙了對PLE的研究應(yīng)用。分子生物學(xué)研究技術(shù)的快速發(fā)展，使獲得單一成份的PLE成為可能。PLE1～PLE6及APLE七種同工酶相繼被克隆表達(dá)(Lange2001,Hermann2008)，并對它們的cDNA序列和氨基酸序列進(jìn)行分析比對，發(fā)現(xiàn)N-端18個氨基酸的信號肽序列和C-端His-Ala-Glu-Leu內(nèi)質(zhì)網(wǎng)潴留信號(Junge1979)，還參照人羧酸酯酶晶體結(jié)構(gòu)，通過同源建模對PLE的空間結(jié)構(gòu)也有了初步的了解(Hasenpuschetal2011)。基于前期對PLE基因的充分研究，我們對現(xiàn)有的PLE基因序列和cDNA序列分析比對發(fā)現(xiàn)，不同的PLE亞型，不僅外顯子高度相似且內(nèi)含子同源性也很高，若用第二代基因測序方法和常規(guī)的PCR技術(shù)得到的片段，無法獲得完整的PLE基因及其上游完整的調(diào)控序列。隨著三代基因測序的興起，近些年來，許多大片段復(fù)雜基因組的基因序列、結(jié)構(gòu)及功能的研究可以通過構(gòu)建BAC文庫并結(jié)合三代測序技術(shù)來完成(Ostermann2016)，利用已經(jīng)建立的BAC文庫篩選目的基因完整序列的方法是目前應(yīng)用比較廣泛的生物學(xué)技術(shù)(Brune2000)，在人類和動物基因組計劃的研究中，目前已成功構(gòu)建了豬(Suzuki1997)、人(Asakawa1997)、魚類(Jiang2016)、桑蠶(Chen2015)的BAC基因組文庫。雖然對PLE的研究已經(jīng)比較充分，但關(guān)于PLE基因序列的數(shù)據(jù)，尤其是調(diào)控機(jī)制的研究還存在很大的空白，權(quán)威數(shù)據(jù)庫中提供的PLE基因序列殘缺不全或順序混亂，不能為進(jìn)一步的研究提供充足的依據(jù)，嚴(yán)重制約了后續(xù)對PLE基因調(diào)控機(jī)制的研究和應(yīng)用。同時，在本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，不同亞型的PLE在同一個體組織器官內(nèi)的表達(dá)量存在很大差異，同一亞型PLE在同一個體的不同年齡段的表達(dá)量也存在很大差異，而調(diào)控序列對目的基因的調(diào)控作用對PLE在豬體內(nèi)各組織表達(dá)量的高低起著舉足輕重的作用。所以本發(fā)明利用成熟的PacBio三代測序技術(shù)，從已構(gòu)建好的榮昌豬BAC文庫中篩選獲得PLE1基因完整序列及其上游完整的調(diào)控序列并對該調(diào)控序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析和功能驗(yàn)證，以期對后期PLE1調(diào)控機(jī)制及相關(guān)方面的研究提供參考，同時可以應(yīng)用于藥物代謝、臨床用藥及基因工程和DNA疫苗等方面。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得豬肝羧酸酯酶基因1(PLE1基因)調(diào)控序列，并對該調(diào)控序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析和功能驗(yàn)證。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：本發(fā)明利用前期申請人構(gòu)建的榮昌豬BAC基因組文庫(Liu2010)，根據(jù)PLE外顯子保守區(qū)域設(shè)計合適的引物從文庫中篩選BAC陽性克隆，然后用第三代PacBio單分子式測序技術(shù)(平均讀長10kb)，測定BAC陽性克隆(平均長110kb)中的PLE基因，進(jìn)行正確拼接，結(jié)果獲得PLE1完整的基因序列及其22,655bps的調(diào)控序列(即在PLE1基因的上游位于-22,655bp～-1bp)，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，對PLE1基因上游調(diào)控序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該調(diào)控序列上存在兩段720bps的反向互補(bǔ)序列，可以形成特殊的Loop環(huán)狀結(jié)構(gòu)。功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該特殊結(jié)構(gòu)可以上調(diào)下游PLE1基因的表達(dá)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：申請人提供了一種上調(diào)豬肝羧酸酯酶基因1(PLE1基因)表達(dá)的DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。上述的一種上調(diào)豬肝羧酸酯酶1(PLE1)基因表達(dá)的DNA片段，在所述的核苷酸序列中包含有兩段720bps的反向互補(bǔ)序列，這兩段反向互補(bǔ)序列構(gòu)成一個如圖7所示的Loop環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且位于PLE1基因調(diào)控序列的-5132/-4413bp和-802/-82bp，中間間隔3611bps。本發(fā)明的一種上調(diào)豬肝羧酸酯酶1(PLE1)基因表達(dá)的DNA片段在上調(diào)PLE1基因的表達(dá)中的應(yīng)用。進(jìn)一步，本發(fā)明的豬肝羧酸酯酶基因表達(dá)的DNA片段，可在上調(diào)豬肝羧酸酯酶基因表達(dá)以及臨床用藥中應(yīng)用。本發(fā)明的步驟如下1.引物的設(shè)計及驗(yàn)證分析已知的γ-PLE的cDNA序列(GenBank:X63323)和NCBI上不完整的PLE基因序列，根據(jù)AG-GT規(guī)則，發(fā)現(xiàn)PLE編碼區(qū)由14個外顯子組成，對部分已知PLE基因的外顯子和內(nèi)含子序列進(jìn)行Blast比對分析，發(fā)現(xiàn)PLE基因的一些外顯子區(qū)域高度保守，而且不同PLE亞型的內(nèi)含子大小也存在明顯差異，據(jù)此，跨Exon4尾和Exon5頭部設(shè)計引物(引物序列見表1-ID1)。設(shè)計引物后送武漢擎科生物技術(shù)公司合成，然后用豬基因組作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增和0.8％瓊脂糖凝膠電泳，鑒定表1所述的引物是否能擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的條帶。表1從榮昌豬BAC文庫篩選PLE基因的引物序列2.PCR三步法篩選BAC陽性克隆選用榮昌豬BAC基因組文庫，以一頭雄性榮昌豬(一種常見的四川地方豬品種)靜脈血基因組構(gòu)建，裝配500塊384板池，共包含192,000個克隆，感受態(tài)細(xì)胞為TransforMaxEPI300E.coli,克隆的質(zhì)粒載體是pCC1BACTM全長8128bp，插入的基因片段平均為116kb，大部分片段分布在90-140kb，篩選文庫的空載率為1.4％，覆蓋豬基因組7倍，通過對隨機(jī)克隆的HindIII酶切圖譜進(jìn)行分析檢測，證明該文庫中BAC克隆的穩(wěn)定性好、冗余度低，可用于豬體內(nèi)基因的篩選。因此采用此BAC基因組文庫，有望篩選到PLE基因陽性克隆。3.陽性BAC克隆的質(zhì)粒提取及鑒定將篩選得到的陽性BAC克隆轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基(含12.5μg/mL的氯霉素)中，置于37℃、200rpm搖床，搖菌過夜(16h)擴(kuò)大培養(yǎng)，用BAC/PACDNAIsolationKit(購自美國OMEGA公司)按照說明書提取陽性質(zhì)粒。用NANODROP2000C超微量分光光度計(ThermoScientific)檢測質(zhì)粒濃度和純度，取出少量樣品進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。4.PacBio三代測序及生物信息學(xué)分析將鑒定過的BAC陽性質(zhì)粒送北京百邁克生物科技有限公司，由該公司對該質(zhì)粒進(jìn)一步純化和濃縮，達(dá)到三代測序?qū)悠返囊蠛?，用PacBio三代測序法(Eid2009，VanBuren2015)對質(zhì)粒進(jìn)行測序。測序完成后用生物信息學(xué)方法對基因序列進(jìn)行分析，拼接成完整序列。PacBio三代測序法平均讀長可達(dá)10～15kb，單個測序單元測序量可達(dá)1G。2015年，DonaldDanforth植物科學(xué)中心的研究人員利用PacBioRSII測序系統(tǒng)，以72倍的覆蓋度分析了Oropetiumthomaeum245Mb的基因組，并繪制基因組草圖，包含端粒和著絲粒序列、長末端重復(fù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、串聯(lián)重復(fù)基因，以及其他難以測序的基因組元件，準(zhǔn)確性超過99.999％。說明利用該方法測序可得到高質(zhì)量的、完整可信的基因組數(shù)據(jù)。然后對測序拼接完整的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。5.PLE1基因及調(diào)控序列的研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在PLE1基因調(diào)控序列存在兩段720bps的反向互補(bǔ)序列，為了探究其功能，本發(fā)明設(shè)計合適的兩對引物，所述的引物序列如表2所示(ID2F、ID2R、ID3F、ID3R)。以豬的基因組為模板克隆兩個不同長度的PLE1基因調(diào)控序列片段，一個片段長為5223bps，另一個片段長為4478bps，其中長度為5223bps的片段包含有兩段完整的720bps反向互補(bǔ)序列，即可以形成Loop環(huán)狀結(jié)構(gòu)；而長度為4478bps的片段缺失了上游一段720bps的反向互補(bǔ)序列(序列位于-5132/-4413bp)，無法形成Loop環(huán)結(jié)構(gòu)。通過插入pGL3-Basic質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建不同長度的熒光素酶報告質(zhì)粒，然后提取去內(nèi)毒素質(zhì)粒與pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染Hepli永生化豬肝細(xì)胞系(由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院王喜亮副教授提供)，用雙熒光素酶活性檢測試驗(yàn)來初步探究該特殊結(jié)構(gòu)的功能。表2擴(kuò)增5223bps和4478bps調(diào)控序列的引物表1說明：引物序列后面括號里表示添加的酶切位點(diǎn)，引物序列中下劃線的堿基為酶切位點(diǎn)。本發(fā)明的積極效果：本發(fā)明運(yùn)用PacBio三代測序法測序并組裝得到PLE1的完整基因序列，同時獲得PLE1基因上游22,655bps的調(diào)控序列，分析發(fā)現(xiàn)在PLE1基因調(diào)控序列存在兩段長720bps的反向互補(bǔ)序列，該反向互補(bǔ)序列的上游一段位于-5132/-4413bp，下游一段位于-802/-82bp，兩者間隔3611bps，兩段反向互補(bǔ)序列可形成一個Loop環(huán)狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)過雙熒光素酶活性檢測試驗(yàn)，表明該段調(diào)控序列形成的特殊結(jié)構(gòu)可以上調(diào)PLE1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，為后續(xù)研究PLE基因調(diào)控機(jī)制提供了技術(shù)基礎(chǔ)，例如可以應(yīng)用于PLE1轉(zhuǎn)錄表達(dá)、獸藥水解和臨床用藥方面。更詳細(xì)的技術(shù)方案見《具體實(shí)施方案》的內(nèi)容。附圖說明序列表SEQIDNO：1是豬肝羧酸酯酶PLE1基因上游22,655bps的調(diào)控序列(-22655bp—-1bp)：在該序列中存在兩段720bps的反向互補(bǔ)序列(上游一段位于-5132/-4413bp，下游一段位于-802/-82bp，兩者間隔3611bps)，兩者之間形成Loop環(huán)狀的特殊結(jié)構(gòu)。圖1：pCC1BAC質(zhì)粒載體圖譜。圖2：pGL3-Basic質(zhì)粒載體圖譜。圖3：pRL-TK質(zhì)粒圖譜。圖4：PLE基因引物在豬基因組驗(yàn)證結(jié)果。附圖標(biāo)記說明，泳道M1：Marker2000；泳道M2：Marker15000；泳道1：對引物進(jìn)行驗(yàn)證。圖5：利用設(shè)計的引物在BAC文庫中篩選PLE基因的跑膠圖。附圖標(biāo)記說明：圖5A為篩選BAC文庫確定第62塊板池為陽性克??；圖5B為進(jìn)一步篩選確定該板池第10列為陽性克?。粓D5C為最終篩選確定第70個克隆孔為陽性克隆。在跑膠圖中，P代表陽性對照(以豬基因組為模板)；N代表陰性對照(滅菌蒸餾水)。圖6：BAC陽性克隆質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳鑒定膠圖。附圖標(biāo)記說明：泳道M：Marker15000；泳道1、2：BAC-70質(zhì)粒；圖7：PLE1基因結(jié)構(gòu)模式圖。附圖標(biāo)記說明：黑色方框表示PLE基因外顯子，直線表示內(nèi)含子，☆表示PLE基因相對保守的外顯子，箭頭表示PLE基因方向，黃色表示PLE基因上游720bps的反向互補(bǔ)序列，與下游一段720bps的調(diào)控序列之間形成Loop環(huán)。圖8：本發(fā)明構(gòu)建的pGL3-Basic-5223bp重組質(zhì)粒圖譜。附圖標(biāo)記說明，紫紅色序列表示插入的完整調(diào)控序列，包含有兩段720bps的反向互補(bǔ)序列，可以形成Loop環(huán)狀特殊結(jié)構(gòu)。圖9：本發(fā)明構(gòu)建的pGL3-Basic-4478bp重組質(zhì)粒圖譜。附圖標(biāo)記說明，綠色序列表示插入的不完整調(diào)控序列，缺失一段上游720bps的反向互補(bǔ)序列，不能形成Loop環(huán)狀特殊結(jié)構(gòu)。圖10：本發(fā)明pGL3-Basic-4478bp雙熒光素酶報告質(zhì)粒菌落PCR鑒定圖。附圖標(biāo)記說明：泳道M：Marker15000；泳道1、2：篩選到的陽性克隆重組質(zhì)粒。圖11：本發(fā)明pGL3-Basic-4478bp雙熒光素酶報告質(zhì)粒單酶切和雙酶切鑒定圖。附圖標(biāo)記說明：泳道M1：Marker15000；泳道M2：Marker2000；泳道1：單酶切；泳道2：雙酶切。圖12：本發(fā)明pGL3-Basic-5223bp雙熒光素酶報告質(zhì)粒菌落PCR鑒定圖。附圖標(biāo)記說明：泳道M：Marker15000；泳道1：篩選到的陽性克隆重組質(zhì)粒。泳道2：陰性克隆跑膠。圖13：本發(fā)明pGL3-Basic-5223bp雙熒光素酶報告質(zhì)粒單酶切和雙酶切鑒定圖。附圖標(biāo)記說明：泳道M1：Marker15000；泳道1：單酶切；泳道2：雙酶切。圖14：本發(fā)明PLE1基因上游調(diào)控序列雙熒光素酶檢測結(jié)果圖。附圖標(biāo)記說明：1：pGL3-Basic-5223bp重組質(zhì)粒熒光活性；2：pGL3-Basic-4478bp重組質(zhì)粒熒光活性；3：pGL3-Basic熒光活性。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：引物驗(yàn)證以通城豬(一種常見的湖北地方豬品種)基因組為模板(通城豬基因組DNA樣品由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院劉榜教授饋贈)，用上述表1中引物對(ID1F,ID1R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)產(chǎn)物的有無和大小，篩選合適的引物，PCR反應(yīng)體系如表3所示。擴(kuò)增條件:預(yù)變性：94℃5min，變性：94℃30s，退火：62℃1min,延伸：72℃4min，循環(huán)數(shù)：30cycles,延伸：72℃10min。PCR擴(kuò)增完成后，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。從瓊脂糖凝膠電泳圖上可以看出擴(kuò)增的條帶大小和預(yù)期目標(biāo)產(chǎn)物大小相近且條帶較亮，說明該對引物合適，可以用來從BAC文庫中篩選得到PLE目的基因。表3PCR反應(yīng)體系反應(yīng)成分用量(μL)豬基因組DNA模板(10ng/μL)0.5基因上游引物(10μM)(表1-ID1F)1基因下游引物(10μM)(表1-ID1R)1LATaq酶1dNTP-MIX(10mM)810*Buffer(Mg2+)5ddH2O33.5總體積50實(shí)施例2：克隆、篩選PLE1基因目前用于在BAC文庫篩選目的基因的方法共有兩種：雜交法和PCR篩選法，PCR篩選法是實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的使用方法且操作程序比較靈活，本實(shí)施例采用三步PCR篩選方法，用篩選出的合適引物在已經(jīng)建立的榮昌豬BAC文庫(Liu，2010)中篩選PLE基因。具體操作步驟如下：(1)將保存在-80℃冰箱的BAC文庫提前取出放在4℃冰箱解凍，用384復(fù)制針將一塊384孔培養(yǎng)板上的所有BAC克隆接種到一個LB固體瓊脂培養(yǎng)板(附加12.5μg/mL氯霉素)，37℃溫箱過夜培養(yǎng)，觀察有菌落長出。然后在該LB瓊脂培養(yǎng)板上加入5mL的LB液體培養(yǎng)基(因?yàn)榕囵B(yǎng)板上的LB是固體培養(yǎng)基，再次加入液體培養(yǎng)基是為了將培養(yǎng)板上的所有克隆子菌落全部涂抹制成菌懸液，取出后擴(kuò)大培養(yǎng)提取DNA進(jìn)行PCR篩選)(含12.5μg/mL氯霉素)，用三角涂棒將克隆與LB培養(yǎng)基涂抹混勻，將菌液混合物趕至培養(yǎng)板一邊，用槍頭吸出加入EP管中備用。(2)將上一步得到的菌液混合物轉(zhuǎn)接LB液體培養(yǎng)基(附加12.5μg/mL氯霉素)后擴(kuò)大培養(yǎng)，提取BAC克隆的DNA混合物。(3)用每個384孔培養(yǎng)板克隆培養(yǎng)得到的BACDNA混合物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件和引物驗(yàn)證時的條件體系相同，反應(yīng)結(jié)束后用0.8％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)凝膠電泳結(jié)果初步確定含有陽性克隆的板池。(4)取出確定具有陽性克隆384孔的培養(yǎng)板，用384復(fù)制針再次將所有BAC克隆接種到LB瓊脂固體培養(yǎng)基上(附加12.5μg/mL氯霉素)，37℃培養(yǎng)過夜。觀察到有菌落長出但注意不要讓菌落長得太大以至于相互粘連在一起，造成克隆之間的相互污染。(5)取24個1.5mL離心管，每管分裝400μL的滅菌水，用牙簽分別將每一列的克隆(16個)收集到離心管中，煮沸5min。以該混合菌體為模板，直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。操作時一個克隆一只牙簽，注意不要讓殘留在LB瓊脂培養(yǎng)基上的克隆之間相互污染，殘留克隆的LB培養(yǎng)板封存放在4℃保存?zhèn)溆谩CR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件與引物驗(yàn)證時的條件體系相同，反應(yīng)結(jié)束后用0.8％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)凝膠電泳結(jié)果進(jìn)一步確定陽性克隆列。(6)確定具有陽性克隆的列后，利用步驟(5)操作時殘留保存在LB瓊脂培養(yǎng)基上的克隆，對陽性列的16個克隆直接做菌落PCR，PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件與引物驗(yàn)證時的條件體系相同。反應(yīng)結(jié)束后用0.8％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)凝膠電泳結(jié)果確定單個陽性克隆孔。(7)挑出陽性克隆孔置于LB液體培養(yǎng)基(附加12.5μg/mL氯霉素)中，37℃、200rpm搖菌過夜(16h)擴(kuò)大培養(yǎng)，即得到含有PLE基因的BAC陽性克隆。實(shí)施例3：陽性克隆的質(zhì)粒提取和鑒定將篩選得到的陽性克隆命名為BAC-70，轉(zhuǎn)接BAC-70陽性克隆菌液在LB液體培養(yǎng)基(附加12.5μg/mL氯霉素)中，置于37℃、200rpm搖床，搖菌過夜(16h)擴(kuò)大培養(yǎng)，用BAC/PACDNAIsolationKit(購自美國OMEGA公司)按照說明書提取質(zhì)粒。用NANODROP2000C超微量分光光度計(ThermoScientific)進(jìn)行檢測，A260/A280為1.96，A260/A230為2.1。取出5μL質(zhì)粒樣品，進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，設(shè)定電壓50V，4℃電泳3h，樣品條帶完整，沒有雜質(zhì)污染和明顯降解現(xiàn)象，符合PacBio三代測序?qū)悠返囊?。然后送北京百邁克生物科技有限公司，該公司對質(zhì)粒進(jìn)一步純化和濃縮(純化濃縮后質(zhì)粒濃度達(dá)到69ng/μL，樣品量共計34.5μg)，用前述的PacBio三代測序法測序，且保證測序數(shù)據(jù)拼接的準(zhǔn)確性。實(shí)施例4：BAC質(zhì)粒測序及生物信息學(xué)分析將實(shí)施例3所得的質(zhì)粒測序委托北京百邁克生物科技有限公司將樣品質(zhì)粒構(gòu)建20kb的文庫，通過PacBio單分子測序技術(shù)測序后過濾原始下機(jī)數(shù)據(jù)，獲得高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)1,013,780,514bps。SMRTbraryTMLibrary的平均讀長達(dá)到10kb左右，測序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性為99.999％，說明測序結(jié)果可靠。用生物信息學(xué)方法分析組裝質(zhì)粒測序結(jié)果，獲得的BAC-70質(zhì)粒序列長度為136,257bps。將組裝的BAC-70質(zhì)粒序列與γ-PLE的cDNA序列(GenBank:X63323)進(jìn)行Blast比對分析，發(fā)現(xiàn)BAC-70包含一個完整的PLE1基因及其上游22,655bps的調(diào)控序列，PLE1基因的序列長度為33,761bps。PLE1基因的上游調(diào)控序列存在2段長達(dá)720bps的反向互補(bǔ)序列，即：上游的一段位于-5132/-4413bp，下游一段位于-802/-82bp，兩者間隔3611bps，兩段反向互補(bǔ)序列能形成Loop環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這種特殊結(jié)構(gòu)很可能對PLE1基因的表達(dá)調(diào)控具有重要意義。實(shí)施例5：雙熒光素酶重組報告質(zhì)粒構(gòu)建以豬基因組為模板，用表2中設(shè)計好的兩對引物(ID2F、ID2R、ID3F、ID3R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件和擴(kuò)增體系和實(shí)施案例1相同，然后用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，擴(kuò)增出條帶大小和預(yù)期相符，分別為5223bps和4778bps。擴(kuò)增產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收試劑盒進(jìn)行回收，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒載體同時進(jìn)行雙酶切，37℃水浴鍋酶切4h，酶切體系如表4所示。表4擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒載體雙酶切體系然后用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳跑膠檢測酶切片段大小正確，用膠回收試劑盒將跑膠產(chǎn)物進(jìn)行回收，再用T4DNA連接酶(購自寶生物工程大連有限公司)將目的片段和質(zhì)粒載體在16℃水浴鍋條件下過夜進(jìn)行連接，連接體系如表5所示。表5T4DNA連接酶連接體系反應(yīng)成分用量(μL)T4DNAligase110×T4ligasebuffer1雙酶切回收載體pGL3-Basic2雙酶切回收目的片段6ddH2OUpto10將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在37℃溫箱培養(yǎng)過夜后挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，分別擴(kuò)增出長約600bps和4478bps的產(chǎn)物，第一個擴(kuò)增條帶大小之所以與原始片段長度(5223bps)不同，證明了Loop環(huán)特殊結(jié)構(gòu)的存在，使擴(kuò)增過程中跨過該特殊結(jié)構(gòu)只進(jìn)行片段兩端的擴(kuò)增，同時也證明了該兩個質(zhì)粒構(gòu)建成功，分別命名為pGL3-Basic-5223bp，pGL3-Basic-4478bp質(zhì)粒。將陽性克隆轉(zhuǎn)接LB液體培養(yǎng)基(含有50μg/mLAmp)擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒做單酶切和雙酶切鑒定，pGL3-Basic-5223bp質(zhì)粒單酶切片段長度為9995bps，雙酶切得到兩個片段分別為2825bps和7170bps，pGL3-Basic-4478bp質(zhì)粒單酶切片段長9281bps，雙酶切得到兩個片段長為6246bps和3035bps，鑒定正確說明雙熒光素酶重組報告質(zhì)粒構(gòu)建成功，雙酶切體系如表6和表7所示。表6pGL3-Basic-5223bp質(zhì)粒單酶切和雙酶切鑒定體系表7pGL3-Basic-4478bp質(zhì)粒單酶切和雙酶切鑒定體系實(shí)施案例6：雙熒光素酶活性檢測重組報告質(zhì)粒構(gòu)建成功后，將含有重組質(zhì)粒的菌液轉(zhuǎn)接LB液體培養(yǎng)基(附加50μg/mLAmp)擴(kuò)大培養(yǎng)，按照去內(nèi)毒素試劑盒(購自美國OMEGA公司)的說明書介紹的操作方法提取去內(nèi)毒素質(zhì)粒，然后用NANODROP2000C超微量分光光度計(ThermoScientific)檢測質(zhì)粒濃度為238ng/μL,246.8ng/μL，按照下面的步驟進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染：(1)取一瓶細(xì)胞形態(tài)較好、生長密度在85％左右的Hepli豬肝細(xì)胞用0.25％的胰蛋白酶消化，加入不含雙抗(青霉素10,000IU和鏈霉素10,000μg/mL)的完全培養(yǎng)基(配方：10％FBS胎牛血清+90％DMEM/HighGlucose細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(購自Hyclone公司))，吹打成細(xì)胞懸液。(2)接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板使細(xì)胞密度為l×105/孔，放37℃、5％CO2培養(yǎng)箱，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70％-80％時進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。(3)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70％-80％時，棄去原培養(yǎng)液，用OPTI培養(yǎng)基(購自Gibco公司)洗滌細(xì)胞兩次，每孔加500μLOPTI培養(yǎng)基。(4)取0.8μg質(zhì)粒(即報告質(zhì)粒：內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK的總量比＝39:1)加入50μLOPTI培養(yǎng)基，吹打混勻。(5)取Lipofectamine2000Reagent(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑)(購自invitrogen公司)2μL加入50μLOPTI培養(yǎng)基中，輕輕吹打混勻，室溫孵育5min。(4)再將以上步驟(4)和(5)中孵育好的混合液加在一起，輕輕吹打混勻，室溫孵育20min。(5)將上述孵育好的100μL混合液加入到一個細(xì)胞孔，輕搖混勻，置放37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，8h后更換成細(xì)胞完全培養(yǎng)基(配方：1％雙抗+10％FBS胎牛血清+89％DMEM/HighGlucose細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基)。(6)在轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后，用l×PBS磷酸鹽緩沖液(Hyclone公司)洗滌兩次，按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書的實(shí)驗(yàn)操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞雙熒光的檢測(雙熒光素酶試劑盒購自美國OMEGA公司)。(7)進(jìn)行3輪獨(dú)立的試驗(yàn)，每個處理重復(fù)3次，將所得數(shù)據(jù)利用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS進(jìn)行分析，重復(fù)之誤差用SD表示，顯著性分析采用單因素方差分析。分析雙熒光素酶活性檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果，相比缺失上游一段720bps反向互補(bǔ)序列的重組質(zhì)粒pGL3-Basic-4478bp的活性，含有兩個720bps反向互補(bǔ)序列從而形成Loop環(huán)結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒pGL3-Basic-5223bp上調(diào)下游PLE1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，活性約提高3倍(0.001＜P＜0.01)。說明該調(diào)控序列上存在的Loop環(huán)特殊結(jié)構(gòu)對下游PLE1基因的表達(dá)具有重要調(diào)控作用，為后續(xù)對PLE1基因調(diào)控機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明獲得的一個PLE1基因上游完整的調(diào)控序列，該系列總長22,655bps，其中位于PLE1基因調(diào)控序列-5132/-1bp(起始密碼子ATG中的A上游的第一個堿基為-1)的位置，存在兩段720bps的反向互補(bǔ)序列(上游的一段位于-5132/-4413bp，下游一段位于-802/-82bp，兩者間隔3611bps)，可以形成Loop環(huán)狀的結(jié)構(gòu)，通過報告質(zhì)粒證實(shí)該結(jié)構(gòu)對PLE1基因的表達(dá)具有上調(diào)作用。具有這種特殊結(jié)構(gòu)的啟動子從未見報道，因此，本發(fā)明不僅對理解PLE基因家族的表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有重要意義，而且對理解啟動子調(diào)控基因表達(dá)的理論具有重要補(bǔ)充作用。同時本發(fā)明還證明PLE可以水解一些藥物，該調(diào)控序列對PLE表達(dá)的調(diào)控作用可以應(yīng)用于臨床用藥方面。本發(fā)明的這一結(jié)構(gòu)可適用于靶基因的適度上調(diào)表達(dá)，在基因工程和DNA疫苗的構(gòu)建上具有實(shí)用價值。主要參考文獻(xiàn)[1]OstermannE,SpohnM,IndenbirkenD,etal.CompleteGenomeSequenceofaHumanCytomegalovirusStrainAD169BacterialArtificialChromosomeClone[J].GenomeAnnounc.2016,4(2):e00091-16.[2]BruneW,MesserleM,KoszinowskiUH.ForwardwithBACsnewtoolsforherpesvirusgenomics[J].TrendsGenet.2000,16(6),254-259.[3]AsakawaS,AbeI,KudohY,etal.HumanBAClibrary:constructionandrapidscreening[J].Gene,1997,191:69-79.[4]Suzuki,K.ConstructionofaporcineBAClibraryandits4-Dimentional(4D)PCRscreeningsystem[R].ReportofInternationalWorkshoponAnimalGenomeAnalysis,1997,51-57.[5]ChenZW,NohataJ,GuoHZ,etal.Construction,completesequenceandannotationofaBACcontigcoveringthesilkwormchorionlocus[J].Nature(scientificdata).2015,1-6.[6]LiuL,YinJ,LiW,etal.ConstructionofabacterialartificialchromosomelibraryfortheRongchangpigbreedanditsusefortheidentificationofgenesinvolvedinintramuscularfatdeposition[J].Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,2010,391(2):1280-1284.[7]JiangLK,YouWW,ZhangXJ,etal.ConstructionoftheBACLibraryofSmallAbalone(Haliotisdiversicolor)forGeneScreeningandGenomeCharacterization[J].MarBiotechnol2016,18:49–56.[8]MorrisAP,BrainKR,HeardCM.Synthesisofhaloperidolprodrugsandtheirhydrolysisbyporcineliveresterase[J].DrugMetabLett.2008,2(4):275-279.[9]RobertiM,Rond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