本發(fā)明涉及一種利用葡萄糖合成D-乳酸的重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳酸是一種三碳化合物，其本身含有一個(gè)羥基、一個(gè)羧基，可以參與眾多化學(xué)反應(yīng)。在光學(xué)性質(zhì)上，乳酸可以分為L-乳酸和D-乳酸。L-乳酸的研究較多，D-乳酸相對較少。D-乳酸是一種重要的平臺(tái)化合物，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)。高光學(xué)純度的D-乳酸可以作為聚乳酸的優(yōu)良單體。
聚乳酸是一種性質(zhì)優(yōu)良的可降解塑料，主要是由L-乳酸通過聚合反應(yīng)獲得。將D-乳酸聚合單體以一定比例加入聚L-乳酸后，聚乳酸的性能可以得到明顯改善，例如，熔點(diǎn)能夠提高50℃左右。全球聚乳酸市場每年約以20％～30％的速率增長(甄光明.生物產(chǎn)業(yè)技術(shù),2015(1):42-52)；促進(jìn)了高光學(xué)純度D-乳酸的需求量的增加。
D-乳酸的生物合成研究相對較少。傳統(tǒng)的發(fā)酵菌株以乳酸菌為主，乳酸菌對乳酸的耐受性高、生產(chǎn)強(qiáng)度大、自身能夠合成高濃度的乳酸。但是，大多數(shù)乳酸菌同時(shí)合成L-乳酸和D-乳酸，光學(xué)純度比較差。研究熱點(diǎn)逐漸聚焦到利用工程菌株來生產(chǎn)D-乳酸。研究證明肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae能夠利用甘油合成高光學(xué)純度的D-乳酸。K.pneumoniae的甘油代謝途徑，其主要產(chǎn)物是1,3-丙二醇(1,3-PDO)；即使敲除了1,3-PDO合成的關(guān)鍵基因，仍然會(huì)有較高水平的產(chǎn)物積累。1,3-丙二醇的合成降低了D-乳酸的合成效率，對后期產(chǎn)品分離造成了不利影響。而且，工程菌在發(fā)酵過程中，為了維持相關(guān)蛋白的作用，需要加入昂貴的抗生素，增加了生產(chǎn)成本。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對以上問題，本發(fā)明以Klebsiella pneumoniae為宿主菌株，通過構(gòu)建基因缺失菌株，消除了醇類副產(chǎn)物的合成，實(shí)現(xiàn)了葡萄糖到D-乳酸的高效轉(zhuǎn)化，發(fā)酵過程不需要添加抗生素；在生產(chǎn)成本、轉(zhuǎn)化效率方面都具有一定發(fā)優(yōu)勢。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種利用葡萄糖合成D-乳酸的重組菌，所述重組菌是以肺炎克雷伯氏菌為出發(fā)菌株，將肺炎克雷伯氏菌基因組的乙酰乳酸合成酶基因budB進(jìn)行敲除得到的。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述乙酰乳酸合成酶基因budB是NCBI的GenBank上accesion No：CP016814.1的基因。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述乙酰乳酸合成酶基因budB的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述重組菌的構(gòu)建方法，具體步驟如下：
1)以肺炎克雷伯氏菌乙酰乳酸合成酶基因budB上下游500個(gè)堿基片段為模板設(shè)計(jì)引物，PCR乙酰乳酸合成酶基因budB上下游片段，再利用回收試劑盒回收目的基因片段；
2)以步驟1)回收的基因片段為模板進(jìn)行搭橋PCR，再利用回收試劑盒回收目的片段ΔbudB；
3)對步驟2)所獲得的基因片段ΔbudB和自殺質(zhì)粒pRE112進(jìn)行酶切，并回收目的片段和載體；
4)將步驟3)所得的載體和目的片段按照等摩爾比混合后利用連接酶連接，并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克?。?/p>
5)將步驟4)所獲得的的陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒(即為重組載體)，并轉(zhuǎn)化到E.colix7213得到大腸桿菌重組菌；
6)將步驟5)所獲得的大腸桿菌重組菌與野生型肺炎克雷伯氏菌共同培養(yǎng)，通過重組載體與野生型肺炎克雷伯氏菌進(jìn)行同源重組，獲得敲除budB基因的基因缺失型菌株K.penumoniaeΔbudB。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟4)所述連接酶為T4DNA連接酶，連接時(shí)間為6～12小時(shí)。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟4)中的感受態(tài)細(xì)胞為E.coli cc118感受態(tài)細(xì)胞或者E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞；所述篩選，是利用氯霉素平板過夜培養(yǎng)，PCR篩選。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述重組菌的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用，是用于生產(chǎn)D-乳酸。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用包括：活化重組菌制備種子液，然后接種至培養(yǎng)基中，于35～40℃，180～220rpm條件下培養(yǎng)24～48小時(shí)。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用具體是：
1)活化重組菌，獲得種子液；
2)將步驟1)所得的種子液，按照種子液：培養(yǎng)基＝1～10:100～150的比例接種后培養(yǎng)；
3)將步驟2)所得培養(yǎng)基，在35～40℃，180～220rpm條件下繼續(xù)培養(yǎng)24～48小時(shí)。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸過程中，重組菌所用的培養(yǎng)基包括各種適于所選用的肺炎克雷伯氏菌生長的培養(yǎng)基，碳源優(yōu)選葡萄糖；不使用其他碳源，其他成分為簡單的無機(jī)鹽成分，不做特別的限定，例如氮源可選擇無機(jī)氮源(氯化銨、硫酸銨等)，優(yōu)選低成本的無機(jī)氮源。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，培養(yǎng)基碳源為葡萄糖。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基為M9改良培養(yǎng)基：0.42g/L一水合檸檬酸，1.6g/L NH4Cl，1g/L酵母粉，0.2g/L MgSO4·7H2O，100mmol/L pH＝7.0磷酸鉀緩沖液，20g/L葡萄糖。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明通過敲除乙酰乳酸合成酶基因budB，有效提高了肺炎克雷伯氏菌利用葡萄糖生產(chǎn)D-乳糖的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明的重組菌，具有利用葡萄糖合成D-乳酸的特點(diǎn)，發(fā)酵24h，在搖瓶水平，可以得到11.4g/L的D-乳酸，轉(zhuǎn)化率為67.2％。本發(fā)明所使用重組菌，在發(fā)酵過程中不需要添加抗生素，降低了生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施方案
下面通過實(shí)例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明。但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法若無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等若無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
所用酶試劑購自MBI Fermentas公司，提取質(zhì)粒所用的試劑盒和回收DNA片段所用的試劑盒購自美國OMEGA公司，相應(yīng)的操作步驟按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行；所有培養(yǎng)基如無特別說明均用去離子水配制。
培養(yǎng)基配方：
M9改良培養(yǎng)基：0.42g/L一水合檸檬酸，1.6g/L NH4Cl，1g/L酵母粉，0.2g/L MgSO4·7H2O，100mmol/L pH＝7.0磷酸鉀緩沖液，20g/L葡萄糖。
實(shí)施例1：基因的敲除
本實(shí)施例中，以肺炎克雷伯氏菌(K.penumoniae)野生菌株的乙酰乳酸合成酶基因budB(GenBank上accesion No：CP016814.1)上下游約500個(gè)堿基片段為模板設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增乙酰乳酸合成酶基因budB上下游片段，再利用回收試劑盒回收目的基因片段。
上游片段擴(kuò)增引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示：
Kp-budB-Up-5'：5'-GCTCTAGAGTCAGTCAGCTGG AAGCTC-3'
Kp-budB-Up-3'：5'-ATAAGCTTCGCCACCTGGTC-3'；
下游片段擴(kuò)增引物序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示：
Kp-budB-Down-5'：5'-GACCAGGTGGCGAAGCTTATCTGCGCATCGT TCGCGCCAT-3'
Kp-budB-Down-3'：5'-CGAGCTCTTATCGCGATAATCTACC G-3'。
將上述擴(kuò)增片段回收后，以回收片段為模板進(jìn)行搭橋PCR，再利用回收試劑盒回收目的片段ΔbudB。以自殺質(zhì)粒pRE112為媒介(Robert A.Edwards,Linda H.Keller,Dieter M.Schi erli.Improved allelic exchange vectors and their use to analyze 987P fimbria gene expression.Gene 1998；207:149-157.)與K.penumoniae野生菌株進(jìn)行同源重組敲除budB基因，通過PCR驗(yàn)證獲得已經(jīng)敲除budB的K.penumoniae工程菌即K.penumoniaeΔbudB。
驗(yàn)證引物序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示：
ID-Kp-budB-up：5'-ATGGACAAACAGTATCCG-3'
ID-Kp-budB-down：5'-ACAGAATCTGACTCAGATG-3'。
實(shí)施例2：野生肺炎克雷伯氏菌利用葡萄糖合成D-乳酸
本實(shí)施例中，將野生型肺炎克雷伯氏菌K.peneumoniae在LB液體培養(yǎng)基中活化，活化后的菌株按1:100的比例接種到含有100mL的M9改良液體培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37℃、180rpm條件下振蕩培養(yǎng)。每隔6h用氨水調(diào)節(jié)pH，維持在7左右。定時(shí)取樣離心，上清液通過生物傳感器檢測葡萄糖含量，根據(jù)殘?zhí)菨舛冗m量補(bǔ)加50％的葡萄糖溶液，保證充足的碳源。培養(yǎng)24h終止發(fā)酵，取1mL發(fā)酵液，4℃、15000rpm離心10min，取上清，用高效液相色譜檢測產(chǎn)物濃度。
經(jīng)檢測，D-乳酸產(chǎn)量為0.2g/L，2,3-丁二醇含量為8.05g/L，葡萄糖到乳酸的轉(zhuǎn)化率(通過加糖總量減去發(fā)酵結(jié)束時(shí)的殘?zhí)呛?，可以得到葡萄糖消耗量，進(jìn)而計(jì)算得到轉(zhuǎn)化率)為0.57％。
實(shí)施例3：重組肺炎克雷伯氏菌利用葡萄糖合成D-乳酸
本實(shí)施例中，將實(shí)施例1中獲得重組肺炎克雷伯氏菌K.peneumoniaeΔbudB在LB液體培養(yǎng)基中活化，活化后的菌株按1:100的比例接種到含有100mL的M9改良液體培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37℃、180rpm條件下振蕩培養(yǎng)。每隔6h用氨水調(diào)節(jié)pH，維持在7左右。定時(shí)取樣離心，上清液通過生物傳感器檢測葡萄糖含量，根據(jù)殘?zhí)菨舛冗m量補(bǔ)加50％的葡萄糖溶液，保證充足的碳源。培養(yǎng)24h終止發(fā)酵，取1mL發(fā)酵液，4℃、15000rpm離心10min，取上清，用高效液相色譜檢測產(chǎn)物濃度。
經(jīng)檢測，D-乳酸產(chǎn)量為11.4g/L、葡萄糖到乳酸的轉(zhuǎn)化率為67.2％，分別比實(shí)施例2的敲除budB前的肺炎克雷伯氏菌菌株提高了56倍和116.9倍；2,3-丁二醇含量為0.01g/L，實(shí)現(xiàn)了醇類副產(chǎn)物的阻斷。
表1不同菌株搖瓶發(fā)酵合成D-乳酸情況
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。