本發(fā)明涉及一種應用解淀粉芽孢桿菌生產(chǎn)生物表面活性素的方法，屬于工業(yè)微生物技術領域。

背景技術：

生物表面活性素，即surfactin，是枯草芽孢桿菌經(jīng)非核糖體途徑(NRPS)合成的由長鏈脂肪酸(C₁₂-C₁₇)和含7個氨基酸的多肽經(jīng)內(nèi)酯鍵連接起來的一種環(huán)狀脂肽，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、溶血栓、降膽固醇的藥用功效以及優(yōu)越的表面活性功能。生物表面活性素的廣譜抗菌功效有望彌補現(xiàn)今普遍存在的抗生素耐藥性難題，生物表面活性素的抗病毒和抗腫瘤功能也為新型藥物設計提供了一些可選方案，而生物表面活性素優(yōu)越的表面活性功能(能夠將水分子的表面張力從72mN/M降低至27mN/M)使其在化妝品，醫(yī)藥，乳化劑，保濕劑和精細化工中有著廣泛的應用前景。據(jù)統(tǒng)計，2006年世界表面活性劑產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)值在200億美元以上，其中北美，西歐和中國占據(jù)了70％以上的市場份額。生物表面活性素作為一種優(yōu)越的生物表面活性劑，顯示出廣闊的應用價值和市場前景。因此，開發(fā)能夠高效合成surfactin的微生物菌株及生產(chǎn)工藝對于surfactin的工業(yè)化生產(chǎn)和普及有重要意義。

目前，生物表面活性素產(chǎn)生菌的選育主要采用誘變育種和隨機篩選相結合的方法，雖然誘變菌株的生物表面活性素產(chǎn)量有所提高，但仍由于產(chǎn)率過低、菌株穩(wěn)定性差而無法應用于工業(yè)生產(chǎn)，篩選野生型高產(chǎn)菌株仍然是實現(xiàn)生物表面活性素工業(yè)化生產(chǎn)的首要任務。

據(jù)文獻報道，芽孢桿菌(枯草芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌)在菌體生長過程中僅有部分細胞能合成生物表面活性素，繼而誘發(fā)形成生物菌膜(biofilm)。芽孢桿菌菌膜形成途徑被激活后，生物表面活性素的合成受到反饋抑制，繼而表面活性素的代謝合成也隨之結束。自然界中的芽孢桿菌通過形成生物菌膜以達到應對環(huán)境壓力，獲取競爭優(yōu)勢的目的，因而其生物表面活性素的合成能力都較弱，僅能合成誘導生物膜形成的劑量。此外，生物表面活性素surfactin具有抗生素活性，通過非特異性攻擊細胞膜的磷脂雙分子層，形成胞漿滲漏，從而達到殺滅微生物的目的。這也是大多數(shù)芽孢桿菌不能過量合成surfactin的另一原因。野生型芽孢桿菌的原始產(chǎn)量一般為100-200mg/L，雖然經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件后，生物表面活性素的產(chǎn)量能達到一定程度的提高，要想繼續(xù)提高生物表面活性素的產(chǎn)率則需要昂貴的特殊發(fā)酵設備，如應用發(fā)酵-膜提取偶聯(lián)反應器，枯草芽孢桿菌的生物表面活性素最高產(chǎn)量約為6.5g/L。昂貴的生產(chǎn)成本是生物表面活性素仍不能商業(yè)化生產(chǎn)的主要因素。因此，獲得高產(chǎn)生物表面活性素的天然高產(chǎn)菌株，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，仍然是生物表面活性素商業(yè)化應用的根本解決途徑。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明首先提供一株超高效合成生物表面活性素surfactin的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)MT45，該菌株已于2016年6月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.12593，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。

所述的解淀粉芽孢桿菌MT45菌株的菌落形態(tài)表現(xiàn)為：菌落圓形、半透明，菌落表面光滑無褶皺、不形成生物菌膜，菌落中央微微凸起，顯微鏡下細胞呈桿狀、形成芽孢，革蘭氏染色陽性。

本發(fā)明還提供了一種應用上述解淀粉芽孢桿菌MT45生產(chǎn)生物表面活性素的方法，包括以下步驟：

(1)挑取解淀粉芽孢桿菌CGMCC NO.12593純種菌落，活化得到種子培養(yǎng)液；

(2)將步驟(1)得到的種子培養(yǎng)液按照1％-5％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在25-37℃條件下培養(yǎng)30-55h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖2％、酵母粉1％、氯化鈉0.5％，自然pH。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為碳源10-100g/L，氮源1-10g/L，蛋白胨0.1-1.5g/L，磷酸二氫鉀2-10g/L，磷酸氫二鈉2-10g/L，硫酸鎂0-0.2g/L；所述碳源包括蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、殼聚糖、甘油、可溶性淀粉、糊精中的一種或幾種；所述氮源包括硝酸銨，硫酸銨，氯化銨，碳酸銨，碳酸氫銨中的一種或幾種。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為蔗糖、葡萄糖、果糖、或甘油。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖或蔗糖。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源為硝酸銨、碳酸銨或硫酸銨。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為碳源10-30g/L，氮源2-6g/L，蛋白胨0.1-1.5g/L，磷酸二氫鉀2-10g/L，磷酸氫二鈉2-10g/L，硫酸鎂0-0.2g/L。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為蔗糖或葡萄糖10-30g/L，硝酸銨或碳酸安或硫酸銨2-6g/L，蛋白胨0.1-1.5g/L，磷酸二氫鉀2-10g/L，磷酸氫二鈉2-10g/L，硫酸鎂0.01-0.2g/L。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為蔗糖30g/L，硝酸銨6g/L，蛋白胨0.5g/L，磷酸二氫鉀2-10g/L，磷酸氫二鈉2-10g/L，硫酸鎂0.18g/L。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為蔗糖10g/L，硝酸銨6g/L，蛋白胨1.5g/L，磷酸二氫鉀2g/L，磷酸氫二鈉2g/L。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為蔗糖30g/L，硝酸銨6g/L，蛋白胨0.5g/L，磷酸二氫鉀2-10g/L，磷酸氫二鈉2-10g/L，硫酸鎂0.18g/L。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為蔗糖10g/L，氮源6g/L，蛋白胨1.5g/L，硫酸鋅0.14g/L，磷酸二氫鉀4g/L，磷酸氫二鈉2g/L，硫酸鎂0.18g/L。

在本發(fā)明的一種實施方式中，步驟(1)挑取解淀粉芽孢桿菌CGMCC NO.12593純種菌落，種于種子培養(yǎng)基，在溫度37℃，搖床轉速為200rpm條件下培養(yǎng)24h得到種子培養(yǎng)液。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供一種新型解淀粉芽孢桿菌MT45菌株，該菌株能夠利用無機鹽培養(yǎng)基超強合成生物表面活性素。所述菌株生物表面活性素的合成與菌體生長同步，具有產(chǎn)物(surfactin)合成與菌株生長同步且無延滯期，菌株不形成生物菌膜、避免產(chǎn)物反饋抑制，菌株對產(chǎn)物耐受性強的特點。本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法采用優(yōu)選的碳源和氮源及碳氮源優(yōu)選的配比，發(fā)酵55h能最高合成生產(chǎn)9.43g/L的生物表面活性素、，能夠滿足工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)要求，具有巨大的工業(yè)應用前景。

生物材料保藏

解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，已于2016年6月6日保藏在中國普通微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC No.12593，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。

附圖說明

圖1為解淀粉芽孢桿菌MT45在營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落形態(tài)(A)和顯微鏡圖片(B)。

圖2為基于16s rRNA序列比對的解淀粉芽孢桿菌MT45系統(tǒng)進化樹。

圖3為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)MT45(A)和模式微生物枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC6051(B)在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長曲線和生物表面活性素的合成曲線。

圖4解淀粉芽孢桿菌MT45產(chǎn)生物表面活性素的純化。

具體實施方式

活化培養(yǎng)液的組成為：以質量百分配比計，葡萄糖1％-5％、酵母粉1％-5％、氯化鈉0.3％-1.0％，水余量；pH6.5-7.0。

固體培養(yǎng)基組成為：1-10mM磷酸鉀，50-100mM Mops，2-6mM氯化鎂，0.1-1mM氯化鈣，10-80μM氯化錳，10-80μM氯化鐵，2-6μM氯化鋅，2-6μM硫胺素，0.1-1％甘油，0.1-1％谷氨酸，1％-2％瓊脂。

營養(yǎng)培養(yǎng)基：蛋白胨2％，酵母粉1％，葡萄糖0.5％，pH 7.5。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2％、酵母粉1％、氯化鈉0.5％，自然pH。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源10-100g/L，氮源1-10g/L，蛋白胨0.1-1.5g/L，磷酸二氫鉀2-10g/L，磷酸氫二鈉2-10g/L，硫酸鎂0.01-0.1g/L。

實施例1菌株篩選

從中國白酒釀造高溫大曲中采集樣品，取5g樣品溶解于10ml的質量百分比1％的氯化鈉溶液中，漩渦震蕩混勻后吸取1mL接種于活化培養(yǎng)液中，在溫度50-60℃，200rpm轉速條件下活化24-36h，制成成熟活化菌液。

取成熟活化菌液，加入質量百分比為1％的氯化鈉溶液進行稀釋。選擇稀釋梯度為10^-2-10^-6的稀釋液，依次涂布于固體培養(yǎng)基平板上。在溫度為30℃，濕度為40％-60％條件下培養(yǎng)48-72h；獲得大量單菌落。將獲得的單菌落接種至營養(yǎng)培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后，檢測發(fā)酵液中的生物表面活性素含量，最終得到一株高產(chǎn)生物表面活性素的純培養(yǎng)物，編號為MT45。

實施例2生物表面活性素的測定方法

生物表面活性素的提?。簩l(fā)酵液8000rpm，4℃，離心10min。發(fā)酵上清液用6mol/L的鹽酸調pH 2.0，放在4℃冰箱靜置2小時。然后，12000rpm，4℃，離心30min，獲得沉淀。將沉淀用甲醇萃取后獲得到生物表面活性素粗產(chǎn)品。

發(fā)酵液中生物表面活性素的測定方法：采用超高效液相色譜法對生物表面活性素進行準確定量。采用waters BEH C18色譜柱，流動相分別為(A)0.1％甲酸水溶液和(B)HPLC級甲醇，洗脫條件為30％-70％甲醇5min，70％-100％甲醇1min。采用二極管陣列檢測器，在210nm檢測樣品。將得到的色譜峰積分后，采用插入法同標準曲線比對，得到表面活性素的準確含量。

實施例3將實施例1篩選得到的菌株進行菌種鑒定。

將實施例1獲得的編號為MT45的菌株進行菌種鑒定。

解淀粉芽孢桿菌MT45菌株在固體平板培養(yǎng)基上形成圓形、半透明菌落；菌落表面光滑無褶皺，不形成以褶皺菌落為代表的生物菌膜；菌落中央微微凸起。顯微鏡下細胞呈桿狀、形成芽孢，革蘭氏染色陽性(圖1)。

對菌株16r rRNA基因序列進行測序(SEQ ID NO.1)，并和數(shù)據(jù)庫比對，進化樹分析，確定MT45為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)(圖2)。

解淀粉芽孢桿菌MT45于2016年6月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.12593。

實施例4解淀粉芽孢桿菌MT45的發(fā)酵過程

將實施例3鑒定得到的解淀粉芽孢桿菌MT45菌株在種子培養(yǎng)基中活化后，以5％的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖10g/L，蛋白胨1.5g/L，磷酸二氫鉀2g/L，磷酸氫二鈉2g/L，硫酸鎂0.18g/L。采用500ml三角瓶裝液量100mL，在37℃，200rpm條件下進行發(fā)酵。定時取樣測定細胞生長量和發(fā)酵過程中的生物表面活性素產(chǎn)量。結果如圖3，解淀粉芽孢桿菌MT45發(fā)酵至55h能最高合成3.0g/L的生物表面活性素。

解淀粉芽孢桿菌MT45能超高效合成生物表面活性素，最高產(chǎn)量可達生物量的50％；培養(yǎng)過程中合成的高濃度生物表面活性素也體現(xiàn)了菌株MT45對產(chǎn)物的高耐受性。且與模式菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC6051相比，生物表面活性素合成與菌體生長同步進行，產(chǎn)物合成無延滯期。這些特性有利于縮短解淀粉芽孢桿菌MT45發(fā)酵周期，產(chǎn)生更多的目標產(chǎn)物，有利于MT45菌株的工業(yè)化應用。

實施例5解淀粉芽孢桿菌MT45對碳源的利用。

解淀粉芽孢桿菌MT45可以利用各種糖作為碳源來生產(chǎn)生物表面活性劑，主要有蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、殼聚糖、甘油、可溶性淀粉、糊精。發(fā)酵培養(yǎng)基的其它組成為：蛋白胨0.5g/L，磷酸二氫鉀2.7g/L，磷酸氫二鈉5g/L，硫酸鎂0.5g/L。碳源的濃度為10g/L。250mL的錐形瓶的裝樣量為50mL，接種量為2％，培養(yǎng)條件為37℃，200rpm。結果見表1。

表1解淀粉芽孢桿菌MT45對碳源的利用

實施例6解淀粉芽孢桿菌MT45對銨鹽的利用。

解淀粉芽孢桿菌MT45可以利用各種無機銨鹽來生產(chǎn)生物表面活性劑，主要有硝酸銨，硫酸銨，氯化銨，碳酸銨，碳酸氫銨。發(fā)酵培養(yǎng)基的其它組成為：蔗糖20g/L，蛋白胨0.5g/L，磷酸二氫鉀2.7g/L，磷酸氫二鈉5g/L，硫酸鎂0.5g/L。氮源的濃度為8g/L。250mL的錐形瓶的裝樣量為50mL，接種量為2％，培養(yǎng)條件為37℃，200rpm。結果見表2。

表2解淀粉芽孢桿菌MT45對銨鹽的利用

實施例7解淀粉芽孢桿菌MT45利用不同發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)生物表面活性素

將解淀粉芽孢桿菌MT45接種于LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm下培養(yǎng)過夜。將種子液按照2％的接種量轉接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，200rpm下培養(yǎng)48h。不同組分的發(fā)酵培養(yǎng)基的生物表面活性劑的產(chǎn)量如表3

表3解淀粉芽孢桿菌MT45利用不同培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)生物表面活性素

其中，LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L。

生物表面活性素的提?。簩l(fā)酵液8000rpm，4℃，離心10min。發(fā)酵上清液用6mol/L的鹽酸調pH 2.0，放在4℃冰箱靜置2小時。然后，12000rpm，4℃，離心30min，獲得沉淀。將沉淀用甲醇萃取后獲得到生物表面活性素粗產(chǎn)品。

實施例8解淀粉芽孢桿菌MT45產(chǎn)生物表面活性素的純品制備

將實施例7中得到的生物表面活性素粗產(chǎn)品采用制備液相的方法進行純化。采用C18色譜柱柱，流動相為0.1％甲酸水溶液和甲醇，洗脫條件為線性洗脫(30％-70％甲醇60min)。設置紫外檢測器檢測波長為210nm。收集40.5-53.5分鐘之間的洗脫組分，洗脫組分經(jīng)旋轉蒸發(fā)儀旋蒸去除溶劑，得到生物表面活性素純品(附圖4)。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。