技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體及其篩選方法。

背景技術(shù)：

指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)是一種能獲取與靶物質(zhì)特異結(jié)合的寡核苷酸的篩選技術(shù)，篩選得到的單鏈DNA或RNA分子稱為核酸適配體。核苷酸不僅有儲存和傳遞遺傳信息的作用，還可以通過自身特有的空間結(jié)構(gòu)與其它分子相互作用。在適宜條件下，單鏈DNA或RNA分子會發(fā)生適應(yīng)性折疊，形成發(fā)夾、凸環(huán)、四分體等結(jié)構(gòu)，從而與靶物質(zhì)緊密結(jié)合。因此，近年來，具有高特異性、高親和力、高穩(wěn)定性、低免疫原性、低分子量、易于合成等特點的核酸適配體，得到了廣泛的應(yīng)用。核酸適配體篩選方法也多種多樣，如毛細管法、親和層析、磁珠分離、微孔板法等。毛細管法是利用毛細管電泳作為分離方法的一種技術(shù)，與靶物質(zhì)結(jié)合的核苷酸序列和未與靶物質(zhì)結(jié)合的序列在毛細管中的遷移率不同，從而使結(jié)合序列與未結(jié)合序列分離；該方法具有快速、微量等特點，但需要特殊的儀器(毛細管電泳儀)，且比較適于篩選分子量大的分子。親和層析分離是將靶分子通過共價鍵或非共價鍵偶聯(lián)至玻璃株或樹脂上，與文庫作用后，結(jié)合序列會留在樹脂上而不結(jié)合序列通過層析柱流走，從而達到分離的目的；該方法要求靶分子必須要有能與玻璃珠或樹脂偶聯(lián)的親和標記或功能基團。微孔板法是將靶分子通過物理吸附作用結(jié)合于微孔板上，加入適配體文庫孵育后棄去未結(jié)合的適配體，洗脫與靶分子結(jié)合的適配體即可；該方法適用靶分子廣，對靶分子性狀要求不嚴格，凡是能特吸附至微孔板的物質(zhì)均可進行篩選。然而，對于不同的靶物質(zhì)應(yīng)采用適當?shù)暮Y選方法，以便快速、準確地篩選到親和力高、特異性強的適配體。為了得到牛副流感病毒3型HN蛋白高結(jié)合力和特異性的核酸適配體，我們采用了較為傳統(tǒng)的微孔板法，進行了改進和優(yōu)化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體及其篩選方法，對牛副流感病毒3型核酸適配體篩選方法進行改進和優(yōu)化，該篩選方法具有適用靶分子廣，對靶分子要求不嚴格，操作簡便，節(jié)約成本等優(yōu)點。同時運用該方法篩選獲得的HN蛋白核酸適配體，為后續(xù)檢測 BPIV3抗原或抗體的酶聯(lián)適配體法的建立奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，包括如下步驟：

步驟一：設(shè)計和合成初始寡核苷酸文庫及用于PCR擴增的上游引物和下游引物；

步驟二，包被：吸取HN蛋白溶液包被于微孔板中；

步驟三，洗板：甩去包被液，洗滌微孔板，甩干；

步驟四，封閉：向微孔中加入含BSA的HEPES液，孵育；

步驟五，加核酸適配體文庫：甩去封閉液，用HEPEST洗滌，甩干，將溶解的初始寡核苷酸文庫(使用時溶于400μL HEPES緩沖液，95℃孵育10min，迅速冰浴10min后備用)加入到封閉好的微孔中，孵育；

步驟六，洗板：甩去寡核苷酸文庫，洗滌微孔板，拍干孔中殘留的洗滌液；

步驟七，洗脫：向微孔中加入核酸洗脫液，孵育；

步驟八，提?。何鱿疵撘海崛∠疵撘褐械暮怂徇m配體；

步驟九，PCR：對步驟八提取的核酸適配體分別進行一輪對稱PCR和一輪非對稱PCR；

步驟十，膠回收：回收PCR產(chǎn)物；

步驟十一，反篩：從第5輪起開始進行反篩，封閉后，將非對稱PCR回收的核酸適配體加入反篩孔，孵育后將上清吸出，加入包被有HN蛋白的微孔中孵育。

更進一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，其中步驟一種所述初始寡核苷酸文庫的序列如SEQ ID NO.1所示，上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示.

更進一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，其中步驟二中包被具體為：吸取100μL HN蛋白溶液包被于96孔ELISA微孔板中，4℃過夜；步驟三中的洗板具體為：甩去包被液，用300μL HEPEST洗滌微孔板三次，甩干，其中所述HEPEST為含0.05％Tween 20的HEPES。

更進一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，其中步驟四中所述封閉具體為：向微孔中加入200μL含3％BSA的HEPES液，37℃孵育2h。

更進一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，其中 步驟五中所述加核酸適配體文庫具體為：甩去封閉液，用HEPEST洗滌三次，甩干，將100uL溶解的初始寡核苷酸文庫加入到封閉好的微孔中，37℃孵育1h。

更進一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，其中步驟六中所述洗板具體為：甩去寡核苷酸文庫，用300μL HEPEST洗滌微孔板四次，拍干孔中殘留的洗滌液；步驟七中所述洗脫具體為：向微孔中加入100μL核酸洗脫液，80℃孵育10min。

更進一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，其中步驟八中所述提取具體為：吸出洗脫液，采取酚抽提法，用25:24:1的酚：氯仿：異戊醇提取洗脫液中的核酸適配體。

更進一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，其中步驟九中所述對稱PCR具體為：2×Mix 25μL，WZ-03 1μL，WZ-04 1μL，適配體3μL，去離子水20μL，反應(yīng)條件為95℃、10min，95℃、20s，65℃、20s，72℃、30s，15個循環(huán)，72℃、5min；所述非對稱PCR具體為2×Mix 25μL，WZ-03 1μL，WZ-04 0.02μL，適配體5μL，去離子水19μL，反應(yīng)條件為95℃、10min，95℃、20s，65℃、20s，72℃、30s，28個循環(huán)，72℃、5min。

更進一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，其中步驟十中所述膠回收具體為：用Bioteke短片段DNA膠回收試劑盒按照說明書要求回收PCR產(chǎn)物。

更進一步地，所述的牛副流感病毒3型HN蛋白核酸適配體篩選方法，其中步驟十一中所述反篩具體為：從第5輪起開始進行反篩，即微孔板包被HN蛋白的同時包被無HN蛋白的包被液反篩孔，同樣條件封閉后，將非對稱PCR回收的核酸適配體加入反篩孔，37℃孵育30min后將上清吸出，加入包被有HN蛋白的微孔中孵育1h

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明對傳統(tǒng)的微孔板法進行了改進和優(yōu)化，得到了與牛副流感病毒3型HN蛋白具有高結(jié)合力和特異性的核酸適配體。其中微孔板分離利用了ELISA酶標板能吸附靶分子的功能從而達到分離的目的。將靶分子通過物理吸附作用結(jié)合于微孔板上，與適配體文庫孵育后棄去未結(jié)合的適配體，加入變性溶液從微孔板內(nèi)洗脫下與靶分子結(jié)合的核酸適配體。該方法適用靶分子廣，對靶分子性狀要求不嚴格，凡是能特吸附到微孔板的物質(zhì)均可進行篩選。此外，該方法不需要使用特殊儀器設(shè)備和材料，操作簡便，節(jié)約成本。

附圖說明

圖1為第1輪篩選的對稱PCR與非對稱PCR瓊脂糖電泳結(jié)果，其中，1：對稱PCR樣品；2：非對稱PCR樣品；M：低分子量marker(50-400bp)N：陰性對照；

圖2為第2輪篩選的對稱PCR與非對稱PCR瓊脂糖電泳結(jié)果，其中，1：對稱PCR樣品；2：非對稱PCR樣品；M：低分子量marker(50-400bp)N：陰性對照；

圖3為第9輪篩選的對稱PCR與非對稱PCR瓊脂糖電泳結(jié)果，其中1：對稱PCR樣品；2：非對稱PCR樣品；M：低分子量marker(50-400bp)N：陰性對照；

圖4為第10輪篩選的對稱PCR與非對稱PCR瓊脂糖電泳結(jié)果，其中，1：對稱PCR樣品；2：非對稱PCR樣品；M：低分子量marker(50-400bp)N：陰性對照；

圖5為第11輪篩選的對稱PCR瓊脂糖電泳結(jié)果，其中，1：對稱PCR樣品；M：低分子量marker(50-400bp)N：陰性對照；

圖6為不同輪次適配體庫的結(jié)合率測定結(jié)果；

圖7為轉(zhuǎn)化子菌液PCR鑒定結(jié)果，其中，M：低分子量marker；N：陰性對照；其余孔為樣品；

圖8為Sigma Plot10.0繪制不同濃度適配體的擬合曲線；

圖9為適配體W-32二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果；

圖10為適配體W-33二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果；

圖11為適配體W-34二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果；

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。

實施例1 篩選

HN蛋白溶液，由本實驗室原核表達和保存；

初始寡核苷酸文庫序列：5’-TAG GGA ATT CGT CGA CGG ATC C-(N)₄₀-C TGC AGG TCG ACG CAT GCG CCG，由上海生工生物工程股份公司合成。合成方式：單管合成20OD，摩爾量為24nmol。使用時溶于400μL HEPES緩沖液，95℃ 孵育10min。迅速冰浴10min后備用。

PCR引物序列：上游引物WZ03:5’-BIO-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC；下游引物WZ04：CGGCGCATGCGTCGACCTGCAG。

具體篩選方法如下：

步驟一，包被：吸取100μL HN蛋白溶液包被于96孔ELISA微孔板中，4℃過夜。

步驟二，洗板：甩去包被液，用300μL HEPEST(含0.05％Tween 20的HEPES)洗滌微孔板三次，甩干。

步驟三，封閉：向微孔中加入200μL含3％BSA的HEPES液，37℃孵育2h。

步驟四，加核酸適配體文庫：甩去封閉液，用HEPEST洗滌三次，甩干。將100uL溶解的初始寡核苷酸文庫加入到封閉好的微孔中，37℃孵育1h。

步驟五，洗板：甩去寡核苷酸文庫，用300μL HEPEST洗滌微孔板四次，拍干孔中殘留的洗滌液。

步驟六，洗脫：向微孔中加入100μL核酸洗脫液，80℃孵育10min。

步驟七，提?。何鱿疵撘?，采取酚抽提法，用25:24:1的酚：氯仿：異戊醇提取洗脫液中的核酸適配體。

步驟八，PCR：對上述步驟提取的核酸適配體分別進行一輪對稱PCR和一輪非對稱PCR；

對稱PCR具體為：2×Mix 25μL，WZ-03 1μL，WZ-04 1μL，適配體3μL，去離子水20μL，反應(yīng)條件為95℃、10min，95℃、20s，65℃、20s，72℃、30s，15個循環(huán)，72℃、5min；

非對稱PCR具體為2×Mix 25μL，WZ-03 1μL，WZ-04 0.02μL，適配體5μL，去離子水19μL，反應(yīng)條件為95℃、10min，95℃、20s，65℃、20s，72℃、30s，28個循環(huán)，72℃、5min。

步驟九，膠回收：用Bioteke短片段DNA膠回收試劑盒按照說明書要求回收PCR產(chǎn)物。

步驟十，反篩：從第5輪起開始進行反篩，即微孔板包被HN蛋白的同時包被無HN蛋白的包被液反篩孔，同樣條件封閉后，將非對稱PCR回收的核酸適配體加入反篩孔，37℃孵育30min后將上清吸出，加入包被有HN蛋白的微孔中孵育1h。反篩目的是避免篩選到與微孔板和BSA非特異結(jié)合的核酸適配體。

在每輪篩選循環(huán)中，自微孔板洗脫液中獲得的適配體溶液，用體積比為25：24：1的酚：氯仿：異戊醇抽提，用Bioteke短片段DNA回收試劑盒回收適配體候選物，然后以回收產(chǎn)物為模板進行常規(guī)PCR擴增，之后再進行一輪非對稱PCR擴增，獲得目的條帶大小約為84bp的單鏈核苷酸分子，用于下一輪篩選。篩選進行到第11輪，將對稱PCR產(chǎn)物連接到T載體進行轉(zhuǎn)化、克隆和測序。第1輪篩選電泳結(jié)果如圖1所示，第2輪篩選電泳結(jié)果如圖2所示，第9輪篩選電泳結(jié)果如圖3所示，第10輪篩選電泳結(jié)果如圖4所示，第11輪篩選電泳結(jié)果如圖5所示。

實施例2 核酸適配體庫結(jié)合率監(jiān)測

篩選進行11輪后，使用生物素標記的WZ03引物對第5輪、第9輪、第10輪、第11輪核酸適配體庫進行非對稱PCR擴增，膠回收非對稱PCR產(chǎn)物得到生物素標記的核酸適配體(Bio-aptamer)，分別用HEPEST溶液調(diào)整各輪次Bio-aptamer濃度至200nM。采用間接酶聯(lián)適配體法(i-ELAA)測定其與HN蛋白的結(jié)合率。

間接酶聯(lián)適配體法具體步驟如下：

步驟一，包被：吸取100μL HN蛋白溶液包被于96孔ELISA微孔板中，4℃過夜。

步驟二，洗板：甩去包被液，用300μL HEPEST(含0.05％Tween 20的HEPES)洗滌微孔板三次，甩干。

步驟三，封閉：向微孔中加入200μL含3％BSA的HEPES液，37℃孵育2h。

步驟四，加核酸適配體：甩去封閉液，用HEPEST洗滌三次，甩干。將100uL各輪次Bio-aptamer加入到封閉好的微孔中，37℃孵育1h。

步驟五，加二抗：甩去Bio-aptamer，用300μL HEPEST洗滌微孔板四次，拍干孔中殘留的洗滌液，向孔中加入100μL 1:8000稀釋的HRP-SA，37℃孵育1h。

步驟六，顯色：甩去二抗，用300μL HEPEST洗滌微孔板四次，拍干孔中殘留的洗滌液，將顯色液A、顯色液B等體積混合，吸取100μL顯色液加入到微孔中，37℃顯色10min。

步驟七，終止：每孔加入終止液2M H₂SO₄ 50μL終止顯色。

步驟八，讀數(shù)：使用自動酶標檢測儀讀取每孔在450nm波長處生物吸光度 值(OD)。

經(jīng)11輪篩選后，對適配體初始文庫、第5輪、第9輪、第10輪、第11輪獲得的適配體與HN蛋白的結(jié)合力進行了評價。采用間接ELAA方法，即使用相同濃度的生物素標記適配體庫與相同濃度的蛋白孵育后測定吸光度值。OD₄₅₀值越高，說明適配體與HN蛋白的結(jié)合率越高，結(jié)合力越強，結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，隨著篩選次數(shù)的增加，適配體與HN蛋白結(jié)合量增多，OD₄₅₀值越來越高。從第11輪開始，OD₄₅₀值不再增加，表明與HN蛋白特異性結(jié)合的適配體單一性達到穩(wěn)定狀態(tài)。

實施例3 測序

將最后一輪擴增出的PCR產(chǎn)物連接T載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行PCR鑒定，陽性樣品送往北京擎科新業(yè)生物有限公司進行序列測定。

1、連接轉(zhuǎn)化

將第11輪回收的核酸適配體進行一輪對稱PCR，得到dsDNA，連接pEASY-T1載體。嚴格按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit說明書進行轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃溫箱過夜培養(yǎng)。可見白色和藍色菌落，白色菌落即為轉(zhuǎn)化成功的感受態(tài)細胞。

2、轉(zhuǎn)化子的增菌培養(yǎng)、鑒定及測序

增殖：無菌挑取白色菌落于1mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)18h。

PCR鑒定及質(zhì)粒提?。河胮EASY-T1載體通用引物對增殖的菌落進行PCR鑒定。用艾德萊的質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。

測序：將提取的陽性質(zhì)粒送北京擎科新業(yè)生物有限公司測序。

將第11輪篩選的微孔板洗脫液為模板的PCR擴增產(chǎn)物與T載體連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，涂板挑選轉(zhuǎn)化子，共挑取轉(zhuǎn)化子106個，增殖后經(jīng)PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子104個，部分PCR結(jié)果如圖7所示。將目的條帶回收后送樣測序，共測序成功104條適配體，其中W-32、W-33和W-34分別重復(fù)出現(xiàn)7、11和9次(如表1)，提示W(wǎng)-32、W-33和W-34被最大程度地富集，因此其特異性結(jié)合HN蛋白的可能性最大。

表1 核酸適配體測序結(jié)果

實施例4 間接酶聯(lián)適配體法測定核酸適配體的KD值

選擇篩選重復(fù)次數(shù)較多的三條適配體W-32、W-33和W-34，化學(xué)合成5’端生物素標記的單一適配體，采用間接酶聯(lián)適配體法測定各適配體的KD值。測定程序如下：

步驟一，包被：吸取100μL HN蛋白溶液包被于96孔ELISA微孔板中，4℃過夜。

步驟二，洗板：甩去包被液，用300μL HEPEST(含0.05％Tween 20的HEPES)洗滌微孔板三次，甩干。

步驟三，封閉：向微孔中加入200μL含3％BSA的HEPES液，37℃孵育2h。

步驟四，加適配體：甩去封閉液，用HEPEST洗滌三次，甩干。分別吸取100uL適配體W-32、W-33和W-34加入到封閉好的微孔中，37℃孵育1h。

步驟五，加二抗：甩去適配體，用300μL HEPEST洗滌微孔板四次，拍干孔中殘留的洗滌液，分別向孔中加入100μL 1:8000稀釋的HRP-SA，37℃孵育1h。

步驟六，顯色：甩去二抗，用300μL HEPEST洗滌微孔板四次，拍干孔中殘留的洗滌液，將顯色液A、顯色液B等體積混合，吸取100μL顯色液加入到微孔中，37℃顯色10min。

步驟七，終止：每孔加入50μL終止液(2M H₂SO₄)終止顯色。

步驟八，讀數(shù)：用自動酶標檢測儀讀取每孔在450nm波長處的吸光度值(OD)。

步驟九，計算：根據(jù)公式Y(jié)＝B_maxX/(K_d+X)來計算每條適配體的KD值。其中，Y代表OD₄₅₀平均值，Bmax代表最大OD₄₅₀值，X代表適配體濃度。

選擇上述測序結(jié)果中重復(fù)出現(xiàn)頻次較高的核酸適配體W-32、W-33和W-34，根據(jù)其序列分別合成生物素標記的單鏈核苷酸，用I-ELAA法測定3條適配體與HN蛋白的結(jié)合力。測定結(jié)果分別見表2、表3和表4，結(jié)果顯示3條適配體均能與HN蛋白進行特異性結(jié)合。

表2 I-ELAA法測適配體W-32結(jié)合力OD₄₅₀值

表3 I-ELAA法測適配體W-33結(jié)合力OD₄₅₀值

表4 I-ELAA法測適配體W-34結(jié)合力OD₄₅₀值

使用軟件Sigma Plot 10.0分析上述數(shù)據(jù)如圖8所示，根據(jù)公式Y(jié)＝Bmax X/(Kd+X)計算適配體W-32、W-33和W-34的KD值分別為56.57±2.7nM、24.64±2.84nM和31.3±3.32nM，結(jié)果表明3條適配體的KD值均達到納摩爾級別，其中適配體W-33結(jié)合力略高于另外兩條適配體。

實施例5 適配體二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用在線核酸結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件MFOLD分析篩選出的三條核酸適配體的二級結(jié)構(gòu)，軟件網(wǎng)址為：http://mfold.rit.albany.edu。

通過在線網(wǎng)站，預(yù)測適配體W-32、W-33和W-34的二級結(jié)構(gòu)結(jié)果分別見圖9、圖10、圖11。從圖9至圖11可見，3條核酸適配體均具有穩(wěn)定的頸環(huán)狀或發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)，在一定條件下能與靶標分子HN蛋白形成穩(wěn)定的結(jié)合。

因此，本發(fā)明通過微孔板法不同輪次篩選獲得多條HN蛋白的核酸適配體候選物。選擇測序結(jié)果出現(xiàn)頻次較高的適配體，用I-ELAA法測定了其與HN蛋白的 結(jié)合力，三條適配體W-32、W-33和W-34的KD值分別為56.57±2.7nM、24.64±2.84nM和31.3±3.32nM，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示核酸適配體均具有穩(wěn)定的頸環(huán)狀或發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)，說明本次篩選的三條適配體均能與HN蛋白特異、穩(wěn)定的結(jié)合，可用于后續(xù)檢測BPIV3抗原或抗體的酶聯(lián)適配體法的建立。

本發(fā)明中涉及到的序列如下表5所示：

表5 序列表

本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。