本發(fā)明涉及生物技術領域，特別提供了一種利用光觸媒促進雨生紅球藻積累蝦青素的方法。

背景技術：

蝦青素（Astaxanthin），即3,3′-二羥基-4,4 ′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素，化學分子式為C₄₀H₅₂O₄，是一種廣泛存在于自然界中的類胡蘿卜素。天然來源的蝦青素是迄今為止自然界發(fā)現(xiàn)的最強抗氧化劑，其抗氧化能力是β-胡蘿卜素的10倍，輔酶Q10的800倍，可以有效清除自由基，具有抗氧化、抑制腫瘤生成、增強免疫功能、抵御紫外線傷害等多種生理功效。雨生紅球藻是天然蝦青素的主要生產(chǎn)原料，在2010年獲得衛(wèi)生部批準作為新資源食品，正式進入中國食品、保健品以及日化行業(yè)，具有廣泛的市場潛力。

雨生紅球藻是一種單細胞的綠藻，通常在光照較弱、氮磷豐富的環(huán)境中藻的存在形態(tài)為綠色營養(yǎng)細胞，快速分裂生殖，細胞內(nèi)蝦青素含量較低；在脅迫條件（高光照、高溫、高鹽或營養(yǎng)鹽饑餓等）下，游動細胞或孢子退去鞭毛，轉入不動細胞階段，以不動的厚壁孢子形態(tài)存在，并積累大量的蝦青素以抵御不良環(huán)境。在環(huán)境脅迫情況下，細胞內(nèi)活性氧（ROS）的合成與解毒作用之間的平衡被打破，雨生紅球藻細胞內(nèi)的ROS淬滅系統(tǒng)啟動，其中蝦青素因合成過程中能夠消耗大量ROS而在細胞內(nèi)大量合成并積累。因此，ROS在藻細胞內(nèi)的積累是促進蝦青素合成的關鍵因素。目前，雖然有相關文獻報道通過添加外源ROS誘生劑如過氧化氫、亞甲基藍等可以一定程度促進雨生紅球藻蝦青素的積累，但由于極易分解失效、價格高昂、無法回收利用等因素，難以應用到實際生產(chǎn)中。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用光觸媒促進雨生紅球藻積累蝦青素的方法，通過應用光觸媒材料在光催化條件下持續(xù)產(chǎn)生活性氧的特性，從而提高雨生紅球藻蝦青素的生產(chǎn)效率。采用的技術方案如下：

一種利用光觸媒促進雨生紅球藻積累蝦青素的方法，包括以下步驟：

a、將光觸媒材料加入到純凈水中并進行分散，配制成濃度為1~10 g/L分散性良好的光觸媒母液，將光觸媒母液添加到基礎培養(yǎng)基中，配制成含有光觸媒濃度為1~100 mg/L的誘導培養(yǎng)基；

b、將雨生紅球藻細胞接種到步驟a所述的含有光觸媒的誘導培養(yǎng)基；

c、將接種完成后的培養(yǎng)基置于光生物反應器中，在光照和攪拌條件下進行培養(yǎng)，誘導雨生紅球藻快速積累蝦青素。

優(yōu)選的，征在于：步驟a所述的光觸媒母液，其分散方法為機械攪拌、超聲波震蕩、添加分散劑中的一種。

優(yōu)選的，步驟a所述的光觸媒為納米級的二氧化鈦TiO₂、氧化鋅ZnO、二氧化鋯ZrO₂、硫化鎘CdS、三氧化鎢WO₃、三氧化二鐵Fe₂O₃、硫化鉛PbS、氧化錫SnO₂、硫化鋅ZnS、鈦酸鍶SrTiO₃、二氧化硅SiO₂、銀Ag、鉑Pt、銠Rh、鈀Pd以及復合光觸媒材料中的一種或多種。

優(yōu)選的，二氧化鈦為銳鈦型、金紅石型、板鈦型晶體結構中的一種或多種。

優(yōu)選的，步驟b所述的基礎培養(yǎng)基為含有碳源、氮、硫、磷和微量元素的全營養(yǎng)培養(yǎng)基、缺少其中一種或者多種營養(yǎng)成分的營養(yǎng)缺失培養(yǎng)基、鹽度0.1%~5%的加鹽培養(yǎng)基中的一種。

優(yōu)選的，步驟c所述的光照為每天24小時連續(xù)光照或者間斷光照，所述光照采用自然光源、人工光源中的一種或多種；所述的光照其光譜特征為紫外光、可見光、遠紅外光中的一種或多種。

優(yōu)選的，人工光源為LED燈、熒光燈、紫外燈、白熾燈、鹵素燈、鈉燈。

優(yōu)選的，步驟c所述的攪拌為鼓泡式攪拌、機械式攪拌、泵循環(huán)攪拌。

優(yōu)選的，鼓泡式攪拌其通入的氣體為空氣或者含有0.5%~5%（v/v）二氧化碳的混合氣體。

優(yōu)選的，步驟c所述光生物反應器為平板式光生物反應器、管道式光生物反應器、柱式光生物反應、薄膜立袋或吊袋式光生物反應器、跑道池或圓池光生物反應器、帶光源的發(fā)酵罐。

本發(fā)明具有以下有益效果：

（1）本發(fā)明操作簡單、成本低廉，適合大規(guī)模生產(chǎn)應用。

（2）通過在培養(yǎng)基中添加光觸媒，在一定的光照條件下，利用光觸媒光催化產(chǎn)生活性氧的特性，使雨生紅球藻積累蝦青素的效率得到顯著提高。

（3）本發(fā)明提供的方法，積累的蝦青素含量高，使用光觸媒的實驗組蝦青素含量比不添加光觸媒的對照組提高了37.9%~60.2%。

（4）光觸媒作為催化劑，在培養(yǎng)過程中不會消耗，在培養(yǎng)結束后，基于光觸媒材料與雨生紅球藻細胞粒徑和比重的差異，通過簡單過濾或者沉降等方法可實現(xiàn)回收利用。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明做進一步詳細的描述，但僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。其他任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、結合、簡化，均為等效形式，同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

實施例1

（1）將主要成分為納米二氧化鈦、納米銀的復合光觸媒材料加入到純凈水中，配制的濃度為1g/L，在使用前利用超聲波震蕩，獲得分散性良好的光觸媒母液。

（2）將光觸媒母液添加到含有50mM碳酸氫鈉的BBM培養(yǎng)基中，配制成光觸媒濃度為10mg/L的誘導培養(yǎng)基。

（3）取進入對數(shù)生長期后期的雨生紅球藻藻種，將藻細胞接種到盛有誘導培養(yǎng)基的柱式光生物反應器內(nèi)，采用熒光燈進行每天12小時的間斷光照培養(yǎng)，并持續(xù)通入CO₂含量為5%（v/v）的過濾空氣進行鼓泡式攪拌。

誘導培養(yǎng)10天后，收集藻細胞并使用改良的Boussiba方法測定蝦青素含量。實驗結果顯示，光觸媒誘導培養(yǎng)的實驗組蝦青素含量達到1.66%，相比于未添加光觸媒的空白對照組（蝦青素含量1.19%）提高了39.5%。

實施例2

（1）將銳鈦型納米二氧化鈦光觸媒材料加入到純凈水中，配制濃度為10 g/L，在使用前利用超聲波震蕩，獲得分散性良好的光觸媒母液。

（2）將光觸媒母液添加到含有100 mM醋酸鈉的BG11缺氮培養(yǎng)基中，配制成光觸媒濃度為100 mg/L的誘導培養(yǎng)基。

（3）取進入對數(shù)生長期后期的雨生紅球藻藻種，將藻細胞接種到添加盛有誘導培養(yǎng)基的透明發(fā)酵罐內(nèi)，采用LED和紫外燈的組合光源進行每天24小時的連續(xù)光照培養(yǎng)，并利用攪拌槳和持續(xù)通入過濾空氣的方式進行攪拌。

誘導培養(yǎng)10天后，收集藻細胞并使用改良的Boussiba方法測定蝦青素含量。實驗結果顯示，光觸媒誘導培養(yǎng)的實驗組蝦青素含量達到3.38%，相比于未添加光觸媒的空白對照組（蝦青素含量2.11%）提高了60.2%。

實施例3

（1）將銳鈦型納米二氧化鈦光觸媒材料，加入到純凈水中，配制濃度為2g/L，在使用前利用機械攪拌，獲得分散性良好的光觸媒母液。

（2）將光觸媒母液添加到BG11缺氮培養(yǎng)基中，配制成光觸媒濃度為50 mg/L的誘導培養(yǎng)基。

（3）取進入對數(shù)生長期后期的雨生紅球藻藻種，將藻細胞接種到盛有誘導培養(yǎng)基的薄膜吊袋式光生物反應器內(nèi)，在室外自然光條件下培養(yǎng)，并持續(xù)通入CO₂含量為2%（v/v）的過濾空氣進行鼓泡式攪拌。

誘導培養(yǎng)10天后，收集藻細胞并使用改良的Boussiba方法測定蝦青素含量。實驗結果顯示，光觸媒誘導培養(yǎng)的實驗組蝦青素含量達到3.24%，相比于未添加光觸媒的空白對照組（蝦青素含量2.35%）提高了37.9%。

實施例4

（1）將主要成分為納米二氧化鈦、納米氧化鋅、納米二氧化硅、納米銀復合光觸媒材料加入到純凈水中，配制濃度為7g/L，在使用前利用超聲波震蕩，獲得分散性良好的母液。

（2）將光觸媒母液添加到含有海水晶的培養(yǎng)基中，鹽度為1%，配制成光觸媒濃度為5 mg/L的誘導培養(yǎng)基。

（3）取進入對數(shù)生長期后期的雨生紅球藻藻種，將藻細胞接種到盛有誘導培養(yǎng)基的管式光生物反應器內(nèi)，在室外自然光條件下培養(yǎng)，采用隔膜泵進行循環(huán)攪拌，并持續(xù)通入CO₂含量為1%（v/v）的過濾空氣。

誘導培養(yǎng)10天后，收集藻細胞并使用改良的Boussiba方法測定蝦青素含量。實驗結果顯示，光觸媒誘導培養(yǎng)的實驗組蝦青素含量達到3.54%，相比于未添加光觸媒的空白對照組（蝦青素含量2.29%）提高了54.6%。

蝦青素提取方法為改良的Boussiba蝦青素測定方法，具體步驟為：誘導培養(yǎng)結束后，取1mL藻液于3000~5000 r/min離心3~6 min，去上清得到誘導后的雨生紅球藻細胞沉淀，向其中加入4~5 mL 4~5%的KOH和25~30%的CH₃OH的混合液，于60~70℃水浴3~6 min破壞葉綠素；再次3000~5000 r/min離心3~6 min，去上清后得到處理過的雨生紅球藻細胞沉淀，向其中加入25μL冰醋酸和1 mL DMSO，于60~70℃水浴8~10 min，期間不斷搖勻，3000~5000 r/min離心3~6 min，取上清液，并重復抽提沉淀至少3次，直至沉淀發(fā)白。蝦青素DMSO抽提液用DMSO稀釋一定倍數(shù)至合適OD范圍，于492 nm下測定蝦青素含量OD₄₉₂值；單位體積雨生紅球藻蝦青素含量(C)按下列公式計算：

C (mg/L)=(4.5 × A₄₉₂ × V_a) /V_b

其中，C為蝦青素含量，A為OD值，V_a為DMSO的體積(稀釋倍數(shù)×DMSO抽提次數(shù))，V_b為藻液體積。

此外，需要說明的是，本說明書中所描述的具體實施例，其各部分名稱等可以不同，凡依本發(fā)明專利構思所述的構造、特征及原理所做的等效或簡單變化，均包括于本發(fā)明專利的保護范圍內(nèi)。本發(fā)明所屬技術領域的技術人員可以對所描述的具體實施例做修改或補充或采用類似的方式替代，只要不偏離本發(fā)明的結構或者超越本權利要求書所定義的范圍，均應屬于本發(fā)明的保護范圍。