本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體地涉及一種大量抽提質粒的方法及其應用。
背景技術：
：質粒是染色體外能夠進行自主復制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器和細菌細胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子。目前，質粒通常專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。把一個有用的目的DNA片段通過重組DNA技術，送進受體細胞中去進行繁殖和表達的工具叫載體(Vector)。細菌質粒是重組DNA技術中最常用的載體之一。質粒分子本身是含有復制功能的遺傳結構。質粒還帶有某些遺傳信息，所以會賦予宿主細胞一些遺傳性狀比如標記基因。其自我復制能力及所攜帶的遺傳信息在重組DNA操作(如擴增、篩選過程)中對基因工程研究及其下游的應用都是非常實用和極具價值的。在產品研發(fā)過程中，研發(fā)人員對質粒量的需求一般不大，μg級別的質粒足以滿足大量研發(fā)實驗的需求；但在實際的產業(yè)化應用中，質粒的使用量往往會比研發(fā)時的高2-3個數(shù)量級，達到100μg乃至1000μg級別。以用于治療急性淋巴細胞白血病的抗CD19嵌合抗原受體T(CAR-T)細胞為例，該治療方案的流程大致如下：首先抽取患者的血液，分離其中的外周血單個核細胞，并誘導培養(yǎng)其中的T細胞；接著將表達抗CD19單鏈抗體(scFv)基因的通過慢病毒導入到T細胞中，并繼續(xù)培養(yǎng)這些細胞；當這些細胞的數(shù)量和質量達到臨床使用的標準后，即可將這些細胞回輸?shù)交颊唧w內開展治療。這一流程中，最為關鍵的就是將基因導入細胞內所用的慢病毒?，F(xiàn)有技術中，用于治療的慢病毒主要是用293T細胞和慢病毒質粒、輔助質粒進行并包裝并純化所得到的。這一步驟對質粒的量要求較高，一般可達到數(shù)百μg級別?，F(xiàn)有技術中，大量提取質粒的方法主要包括借助質粒吸附柱和借助氯化銫(CsCl)超速離心兩種。借助質粒吸附柱的方法，僅需大約2個小時即可從400mL左右的菌液中提取出1000μg左右的質粒；而借助CsCl超速離心的方法則需要離心過夜，時間相對較長。但CsCl超速離心法在其他方面遠優(yōu)于質粒吸附柱法：1、基本上不存在細菌基因組DNA污染。與之相比，質粒吸附柱法提取的質粒被細菌基因組DNA污染的潛在風險要高不少。2、提取的質粒中共價、閉合、環(huán)狀DNA分子(cccDNA)是質粒在后期正常發(fā)揮作用的主要形式，借助CsCl超速離心法提取的質粒，cccDNA的比例顯著高于通過質粒吸附柱法提取的質粒。3、借助超速離心，細菌內毒素可以被更徹底地清除。因此借助超速離心法進行質粒的大量提取是一種更好的方法，這已被本領域內的實驗人員所接受。CsCl超速離心法大量提取質粒的過程中，需要加入核酸染料，以使質粒在超速離心后顯色，方便實驗人員借助注射器等器具對其進行吸取?，F(xiàn)有技術中常用的核酸染料為溴化乙錠(EB)，這是一種靈敏度非常高的核酸染料，能檢測低至10ng的DNA。但是EB是一種強誘變劑，具有較高的致癌性，因此對長期使用該核酸染料的實驗人員來說，如何既保護好自己的身體健康，又要獲得理想的實驗結果成為了他們日常工作中不得不面對的一個重要問題?，F(xiàn)有技術中尚未有能很好解決該問題的方法。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種大量提取質粒的方法，其特點如下：應用新型的GoldenView染料替代高毒性的EB染料進行CsCl超速離心提取質粒。本發(fā)明的具體技術方案如下：S1、將含有目的質粒的大腸桿菌接種至400mLTB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)過夜。然后4℃，6000g離心10min，棄上清，倒置離心管使殘余的液體流出。S2、加入預冷至4℃的P1緩沖液至終體積到10mL，震蕩重懸使沉淀的細菌均勻分散。所述P1緩沖液的成分為50mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA,100ug/mLRnaseA,pH＝8.0。S3、加入20mg固體溶菌酶(heneggwhitelysozyme)，完全重懸沉淀，室溫放置10min。S4、加入20mL新鮮制備的P2溶液，用移液管輕輕混勻直至溶液均一透明，室溫放置5-10min。所述P2緩沖液的成分為200mmol/LNaOH,1％SDS。S5、加入預冷至4℃的P3溶液10mL，輕輕但完全地震蕩混勻數(shù)次，直至兩個液相不再分離，原有的黃色消失，白色絮狀物出現(xiàn)，然后置于冰上10min。所述P3溶液的成分為3mol/LKAc，pH＝4.8。S6、4℃，8000rpm離心10min，棄沉淀，將上清通過四層紗布過濾到量筒中。S7、加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10-15min，然后置于50mL離心管中。S8、8000rpm離心15min后，將上清棄處干凈，回收核酸沉淀。S9、洗滌沉淀。在室溫下，用2mL70％乙醇涮洗管底及管壁。然后將乙醇倒出，并吸干管壁上的液滴；或8000rpm，常溫離心10min，棄上清。敞開離心管管口10-15min，使剩余的乙醇完全揮發(fā)掉。S10、加入7mL1×TE溶液溶解沉淀，并加入7mL該溶液沖洗管壁。S11、加入CsCl12.5g，溶解混勻。S12、加入GoldenView核酸染料10微升后混勻。S13、轉移上述溶液至超速離心管中，充滿離心管并平衡密封。S14、室溫下55000rpm離心至少12h，或65000rpm離心4h。S15、離心結束后，將離心管取出，置于錫箔紙包裹的試管架上，在僅有微光的室內，可見兩條DNA區(qū)帶，上層區(qū)帶是染色體和線性DNA，下層為所需的cccDNA。S16、用18號針管，小心收集cccDNA，置于50mL離心管中。S17、加入等體積的水飽和異戊醇，蓋緊管蓋，震蕩混合有機相和水相。S18、室溫下450g離心3min，使水相和有機相分離，并將上層有機相(粉紅色)轉移至合適的廢液桶中。S19、重復抽提上述三個步驟4-6次，直到水相和有機相均不見綠色。S20、加入2.2倍體積的水，0.6倍體積的異丙醇，混勻。S21、室溫下，8000rpm離心15min，完全棄上清，并回收核酸沉淀。S22、加入8mL超純水重懸沉淀，再加入10mol/L醋酸銨溶液至終濃度2mol/L，充分混勻后加入2.5-3倍體積，預冷至-20℃的乙醇(-20℃)，混勻，置于干冰或-80℃冰箱中，孵育10min。S23、4℃，8000rpm離心10min，棄上清。S24、加入20mL70％乙醇，混合，4℃，12000g離心10min，棄上清。S25、將離心管置于超凈臺中風干2min，加入TE溶解質粒。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明對傳統(tǒng)的CsCl超速離心法提取質粒進行了改造，應用新型的GoldenView染料替代了高毒性的EB染料，在降低實驗操作對研究人員的潛在毒性風險的同時，還保證了所提取質粒的產量和質量均無明顯下降。附圖說明圖1為應用GoldenView和EB進行CsCl質粒提取，獲得質?？偭康慕Y果圖。圖2為CsCl提取質粒的電泳結果圖。a.應用GolenView染料進行質粒提取的結果(3次重復)；b.應用EB染料進行質粒提取的結果(3次重復)。圖3為BSA標準曲線圖。具體實施方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。下述實施例中所用的方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見：《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook,J.,Russell,DavidW.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,2001,NY,ColdSpringHarbor)。本發(fā)明所使用的CsCl購自SigmaAldrich，GoldenView染料購自北京賽百盛基因技術有限公司。其它實驗試劑與耗材如無明確說明，均為市售商品。實施例一大腸桿菌的培養(yǎng)取含有質粒的大腸桿菌10μL，置于400mLTB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)14h后，4℃，6000g離心10min收集菌體。實施例二CsCl超速離心提取質粒按照以下步驟應用CsCl超速離心法提取質粒：1、加入預冷至4℃的P1緩沖液至10mL，重懸上述菌體，震蕩重懸使沉淀的細菌均勻分散。2、加入20mg固體溶菌酶(heneggwhitelysozyme)，完全重懸沉淀，室溫放置10min。3、加入20mL新鮮制備的P2溶液，用移液管輕輕混勻直至溶液均一透明，室溫放置5-10min。4、加入預冷至4℃的P3溶液10mL，輕輕但完全地震蕩混勻數(shù)次，直至兩個液相不再分離，原有的黃色消失，白色絮狀物出現(xiàn)，然后置于冰上10min。5、4℃，8000rpm離心10min，棄沉淀，將上清通過四層紗布過濾到量筒中。6、加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10-15min，然后置于50mL離心管中。7、8000rpm離心15min后，將上清棄處干凈，回收核酸沉淀。8、洗滌沉淀。在室溫下，用2mL70％乙醇涮洗管底及管壁。然后將乙醇倒出，并吸干管壁上的液滴；或8000rpm，常溫離心10min，棄上清。敞開離心管管口10-15min，使剩余的乙醇完全揮發(fā)掉。9、加入7mL1×TE溶液溶解沉淀，并加入7mL該溶液沖洗管壁。10、加入氯化銫12.5g，溶解混勻。11、加入GoldenView核酸染料10微升后混勻。12、轉移上述溶液至超速離心管中，充滿離心管并平衡密封。13、室溫下55000rpm離心至少12h，或65000rpm離心4h。14、離心結束后，將離心管取出，置于錫箔紙包裹的試管架上，在僅有微光的室內，可見兩條DNA區(qū)帶，上層區(qū)帶是染色體和線性DNA，下層為所需的cccDNA。15、用18號針管，小心收集cccDNA，置于50mL離心管中。16、加入等體積的水飽和異戊醇，蓋緊管蓋，震蕩混合有機相和水相。17、室溫下450g離心3min，使水相和有機相分離，并將上層有機相(粉紅色)轉移至合適的廢液桶中。18、重復抽提上述三個步驟4-6次，直到水相和有機相均不見綠色。19、加入2.2倍體積的水，0.6倍體積的異丙醇，混勻。20、室溫下，8000rpm離心15min，完全棄上清，并回收核酸沉淀。21、加入8mL超純水重懸沉淀，再加入10mol/L醋酸銨溶液至終濃度2mol/L，充分混勻后加入2.5-3倍體積，預冷至-20℃的乙醇(-20℃)，混勻，置于干冰或-80℃冰箱中，孵育10min。22、4℃，8000rpm離心10min，棄上清。23、加入20mL70％乙醇，混合，4℃，12000g離心10min，棄上清。24、將離心管置于超凈臺中風干2min，加入TE溶解質粒。實施例三質粒提取量的檢測抬起ThermoNanodrop2000檢測儀的樣品臂，取1μLTE溶液加到檢測基座上，用于儀器調零，完成后用干凈的擦拭紙將基座擦拭干凈；然后再取1μL溶于TE的質粒加到檢測基座上，然后將樣品臂放下，運行控制軟件讀取吸光值；再由軟件根據(jù)吸光值估算出質粒的濃度。按照以下公式對質粒的提取量進行計算：n＝C×V。其中n為質粒的提取量，C為質粒的濃度，V為溶解質粒所用的TE的體積。發(fā)明人用GoldenView和溴化乙錠(EB)各重復質粒提取實驗三次，提取情況如下表所示：表1質粒提取情況對這些數(shù)據(jù)進行T檢驗分析，結果如圖1所示?？梢钥吹?，應用GoldenView染料提取所得質粒的總量高于應用EB染料提取的，但無顯著差異(p>0.05)。實施例四提取質粒內毒素的檢測使用湛江安度斯生物有限公司生產的凝膠法鱟試劑檢測質粒樣品中的內毒素殘留。用超純水將內毒素標準品稀釋為10EU/mL、1EU/mL、0.5EU/mL、0.25EU/mL、0.125EU/mL、0.0625EU/mL6個濃度梯度作標準曲線；再按凝膠法鱟試劑說明書對樣品進行稀釋(MVD＝CL/λ)，并進行內毒素的檢測。每個樣品進行2次重復，所得結果表明，全部質粒樣品均呈內毒素陰性，表明質粒樣品內所含內毒素均≦5EU/mL，即在要樣品控制內毒素限值為5EU/mL范圍，說明質粒樣品內內毒素含量極低。實施例五提取質粒殘留蛋白質的檢測使用北京全式金生物技術有限公司生產的BCA檢測試劑盒對提取質粒中的殘留蛋白質含量進行測定。用超純水配制濃度分別為0、25ng/μL、50ng/μL、100ng/μL、200ng/μL、300ng/μL、400ng/μL和500ng/μL的BSA標準品，繪制標準曲線，結果表2和如圖3所示?？梢钥吹?，吸光值與標準品濃度呈線性相關趨勢，r2值大于0.99。表2BSA標準曲線繪制數(shù)據(jù)標準品濃度02550100200300400500吸光值0.1690.1860.2100.2440.3350.4170.4880.551按照相同步驟對實施例三中獲得的6個質粒提取樣品進行殘留蛋白質含量的檢測，其吸光值如表3所示?？梢钥吹?，6個樣品檢測所得到的吸光度值均小于標準品濃度為0時對應的吸光度值，未檢測出蛋白質殘留，說明提取質粒的純度很高。表36個質粒樣品殘留蛋白質檢測結果樣品名GoldenView-1GoldenView-2GoldenView-3EB-1EB-2EB-3吸光值0.1640.1650.1660.1630.1650.163以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3