本發(fā)明涉及化學(xué)與制劑領(lǐng)域。具體涉及無(wú)銅催化點(diǎn)擊反應(yīng)模塊分子的制備以及其在藥物遞送載體的構(gòu)建和表面多功能修飾中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

“點(diǎn)擊化學(xué)”是有機(jī)化學(xué)中一類(lèi)以溫和高效著稱(chēng)的反應(yīng)的總稱(chēng)，由2001年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者、美國(guó)化學(xué)家Sharpless首次提出，近十幾年來(lái)發(fā)展迅速，在許多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，因其反應(yīng)條件溫和，選擇性強(qiáng)以及可以在水相中反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在醫(yī)藥領(lǐng)域受到越來(lái)越多的關(guān)注。

其中，以銅離子催化疊氮和末端炔進(jìn)行Huisgen 1,3-偶極環(huán)加成是點(diǎn)擊化學(xué)中的經(jīng)典反應(yīng)，且反應(yīng)生成的三氮唑具有很好的化學(xué)穩(wěn)定性，因而是一種常用的化學(xué)修飾方法。如發(fā)明人課題組在前期的研究中，基于銅催化的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)和層層組裝的物理作用，提出了“協(xié)同組裝”的策略(JACS,2015,137(18):6000-6010)。這種組裝手段既避免了單一的化學(xué)修飾或物理組裝存在的弊端，又同時(shí)提高了載體的穩(wěn)定性和安全性，是一種安全高效的組裝手段。但是，由于點(diǎn)擊反應(yīng)過(guò)程中引入了銅離子作為催化劑，殘留銅離子的生理毒性會(huì)導(dǎo)致DNA的降解和蛋白質(zhì)的變性，在很大程度上限制了該“協(xié)同組裝”策略在醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。

為了進(jìn)一步拓展“協(xié)同組裝”策略在載體表面多功能修飾的應(yīng)用，增加其臨床應(yīng)用的可能性，應(yīng)用無(wú)銅催化的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)作為化學(xué)組裝的工具將是一種切實(shí)可行的解決辦法。無(wú)銅催化的點(diǎn)擊反應(yīng)是發(fā)生在環(huán)辛炔基團(tuán)與疊氮基團(tuán)之間，因此，制備兩種可應(yīng)用于遞藥載體系統(tǒng)的構(gòu)建和表面修飾的點(diǎn)擊反應(yīng)模塊分子是解決以上問(wèn)題的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開(kāi)了一類(lèi)氮雜二苯并環(huán)辛炔衍生物(I)、(II)、(III),

其中，R₁代表：

R₂、R₅、R₆各自獨(dú)立的代表：

R₂代表

R₅代表

R₆代表

R代表-(CH₂)x-CH₃，x＝7-12、-(CH₂)₈-CH＝CH-(CH₂)₈-CH₃或-(CH₂)₈-CH＝CH-CH₂-CH＝CH-(CH₂)₅-CH₃；

R₃代表-(CH₂)x-CH₃，x＝7-19、-(CH₂)₈-CH＝CH-(CH₂)₈-CH₃或-(CH₂)₈-CH＝CH-CH₂-CH＝CH-(CH₂)₅-CH₃；

n＝1或2。

氮雜二苯并環(huán)辛炔是以5-二苯并環(huán)庚烯酮為起始原料，經(jīng)過(guò)肟化、貝克曼重排、酰胺還原、保護(hù)、加成、脫溴、脫保護(hù)等合成反應(yīng)得到了最終產(chǎn)物氮雜二苯并環(huán)辛炔(ADIBO)。

合成環(huán)辛炔磷脂類(lèi)衍生物使用的原料是ADIBO和合成磷脂。使用的合成磷脂包括親水端為乙醇胺的二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂?；字Ｒ掖及?DSPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等。

合成環(huán)辛炔膽固醇使用的原料是ADIBO和膽固醇。

合成的環(huán)辛炔類(lèi)脂類(lèi)衍生物是一類(lèi)全合成的材料。該材料由谷氨酸(或天冬氨酸)—賴(lài)氨酸(或甘氨酸、苯丙氨酸，組氨酸、精氨酸、丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，色氨酸，蛋氨酸，脯氨酸；絲氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸)與氮雜二苯并環(huán)辛炔組成親水頭基，由雙鏈烷烴(正癸醇—正二十醇，油醇，亞油醇)作為疏水尾(結(jié)構(gòu)式II)；

或由賴(lài)氨酸(或甘氨酸、苯丙氨酸，組氨酸、精氨酸、丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，色氨酸，蛋氨酸，脯氨酸；絲氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸)與氮雜二苯并環(huán)辛炔組成親水頭基，由單鏈烷烴(正癸醇—正二十醇，油醇，亞油醇)作為疏水尾(結(jié)構(gòu)式Ⅲ)。

本發(fā)明公開(kāi)了一種藥物脂質(zhì)體，含有藥物和脂質(zhì)體基質(zhì)，還含有作為修飾劑的本發(fā)明的氮雜二苯并環(huán)辛炔衍生物，該修飾劑插入到藥物脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子層中，環(huán)辛炔基端位于脂質(zhì)體表面，藥物在脂質(zhì)體中間。見(jiàn)圖1中b。

本發(fā)明還公開(kāi)了一類(lèi)功能化的疊氮衍生物，該疊氮衍生物由小分子酸、透明質(zhì)酸、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮鏈、奧曲肽、葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、細(xì)胞穿膜肽、熒光標(biāo)記物Alexa Fluor、花青染料、香豆素6、熒光素、羅丹明、別藻藍(lán)蛋白或色霉素疊氮化而得。部分衍生物結(jié)構(gòu)如下：

優(yōu)選將小分子酸、聚乙二醇、奧曲肽等進(jìn)行疊氮化衍生。

一種功能型藥物脂質(zhì)體，由前述脂質(zhì)體中修飾劑中的環(huán)辛炔基與上述任一疊氮衍生物通過(guò)化學(xué)鍵鏈接。其中修飾劑氮雜二苯并環(huán)辛炔衍生物中的環(huán)辛炔基與上述疊氮衍生物的疊氮基之間進(jìn)行無(wú)銅催化的點(diǎn)擊反應(yīng)，在藥物脂質(zhì)體表面形成化學(xué)鍵。見(jiàn)圖1中c。

本發(fā)明還基于合成的兩類(lèi)無(wú)銅催化點(diǎn)擊反應(yīng)的模塊分子，公開(kāi)了一種藥物脂質(zhì)體。本發(fā)明的環(huán)辛炔衍生物作為脂質(zhì)體的修飾劑，可以與脂質(zhì)體基質(zhì)共同制備表面修飾有環(huán)辛炔基團(tuán)的脂質(zhì)體，并與基因治療藥物或化療藥物制備成藥物脂質(zhì)體。疊氮化衍生物則通過(guò)疊氮和環(huán)辛炔間張力推動(dòng)的疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)(SPAAC)修飾到藥物脂質(zhì)體的表面，從而提高藥物和載體系統(tǒng)的體內(nèi)外穩(wěn)定性、賦予載體靶向性、促進(jìn)細(xì)胞對(duì)載體的攝取以及實(shí)現(xiàn)載體可視監(jiān)測(cè)等多種功能。

本發(fā)明的藥物脂質(zhì)體，其中修飾劑與磷脂的重量比優(yōu)選1:1-1:10。

修飾劑與疊氮化衍生物重量比優(yōu)選1:1-1:20。

藥物與空白脂質(zhì)體的重量比優(yōu)選1:5-1:20。

藥物優(yōu)選自坦西莫斯、喜樹(shù)堿類(lèi)、紫杉醇、多西紫杉醇、藤黃酸、環(huán)孢素A、足葉乙苷、替尼泊甙、依托泊甙、長(zhǎng)春酰胺、尼莫地平、硝苯地平、尼群地平、阿霉素、柔紅霉素、絲裂霉素、甲氨喋呤、冬凌草素、三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿、燈盞花素、銀杏內(nèi)酯、水飛薊素、靛玉紅、質(zhì)粒DNA、寡核苷酸或siRNA。

本發(fā)明首先將環(huán)辛炔衍生物和脂質(zhì)體基質(zhì)通過(guò)薄膜分散法形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體；再利用物理作用高效荷載基因治療藥物或化療藥物，進(jìn)而形成穩(wěn)定的藥物脂質(zhì)體；最后，通過(guò)無(wú)銅催化的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，將具有不同功能的疊氮化衍生物按要求，通過(guò)化學(xué)鍵的形成修飾到藥物脂質(zhì)體表面。此方法避免了重金屬銅離子的毒性，克服了有銅催化帶來(lái)的DNA降解、蛋白質(zhì)變性等缺點(diǎn)。在保證高效穩(wěn)定載藥的同時(shí)，獲得多種預(yù)期功能；實(shí)現(xiàn)安全、穩(wěn)定、高效的多功能藥物遞送系統(tǒng)的構(gòu)建。示意圖見(jiàn)圖1。

本發(fā)明中環(huán)辛炔修飾劑的加入對(duì)陽(yáng)離子載體基因藥物包覆能力沒(méi)有影響，見(jiàn)實(shí)施例11。PEG可以在陽(yáng)離子載體表面形成水化層，克服其正電性帶來(lái)的毒性，同時(shí)提高載體在循環(huán)系統(tǒng)中滯留時(shí)間。因而采用疊氮PEG與載體表面的環(huán)辛炔點(diǎn)擊后，可以賦予納米載體長(zhǎng)循環(huán)功能；奧曲肽(Oct)是由8個(gè)氨基酸構(gòu)成的環(huán)狀多肽，是天然生長(zhǎng)抑素的人工合成類(lèi)似物，與生長(zhǎng)抑素受體(SSTRs)有較強(qiáng)親和力。SSTRs在乳腺、腎、結(jié)腸、卵巢以及腦膜等部位起源的腫瘤中都有過(guò)度表達(dá)，是一種重要的腫瘤表面標(biāo)志物以及潛在的腫瘤治療靶標(biāo)。因而采用疊氮奧曲肽與載體表面的環(huán)辛炔點(diǎn)擊后，使其能在SSTRs高度表達(dá)的腫瘤部位高效聚集，賦予納米載體靶向功能。環(huán)辛炔修飾的載藥陽(yáng)離子脂質(zhì)體可以同時(shí)完成兩種疊氮模塊分子的點(diǎn)擊，見(jiàn)實(shí)施例13?；瘜W(xué)組裝過(guò)程中，載體中的siRNA沒(méi)有被置換和破壞，見(jiàn)實(shí)施例14。表面帶正電荷的納米粒與細(xì)胞膜相互作用增強(qiáng)，有利于細(xì)胞攝取納米粒；但帶正電荷的納米粒很快與血液中的蛋白質(zhì)相互作用，使其在血循環(huán)中聚集被快速清除，難以到達(dá)靶部位。因而采用疊氮負(fù)電性酸與正電性載體表面的環(huán)辛炔點(diǎn)擊后，可以完成電荷反轉(zhuǎn)型納米載體的構(gòu)建，使納米載體在血循環(huán)中保持惰性，在實(shí)體瘤中通過(guò)滲透增強(qiáng)和滯留效應(yīng)(EPR)富集納米粒，進(jìn)而被腫瘤組織的弱酸性活化，表面轉(zhuǎn)變?yōu)檎姾?，增?qiáng)與細(xì)胞膜的相互作用，提高細(xì)胞攝取和藥物療效，見(jiàn)實(shí)施例15。

本發(fā)明的點(diǎn)擊反應(yīng)模塊分子可以分別用下列方法制備：

環(huán)辛炔磷脂衍生物

a.將ADIBO溶解于氯仿中，滴加三乙胺，室溫反應(yīng)1～3h后加入丁二酸酐，室溫反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)完成后，稀鹽酸洗滌兩次，飽和食鹽水洗滌一次，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮。二氯甲烷/甲醇柱層析分離得到羧基端的ADIBO-COOH。

ADIBO-COOH的合成反應(yīng)式1：

b.將ADIBO-COOH和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶解于氯仿中，攪拌一段時(shí)間后加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。反應(yīng)完成后，抽濾，濾液旋干。二氯甲烷/甲醇柱層析分離得到ADIBO的活化酯ADIBO-NHS。

ADIBO-NHS的合成反應(yīng)式2：

c.將磷脂溶解于二氯甲烷(或氯仿，或乙酸乙酯)中，滴加三乙胺后室溫?cái)嚢枰欢螘r(shí)間后，加入ADIBO-NHS，攪拌過(guò)夜。二氯甲烷/甲醇柱層析分離得到環(huán)辛炔磷脂衍生物。

環(huán)辛炔磷脂衍生物的合成反應(yīng)式3：

環(huán)辛炔膽固醇衍生物

a.將膽固醇與丁二酸酐溶于吡啶中，90℃回流10～24h，冷卻至室溫，加入稀鹽酸，產(chǎn)生白色沉淀，過(guò)濾，濾餅水洗，然后用乙酸乙酯溶解，二氯甲烷/甲醇柱層析分離得到膽固醇琥珀酸單酯。

膽固醇琥珀酸單酯的合成反應(yīng)式4：

b.將膽固醇琥珀酸單酯溶于二氯甲烷(或氯仿，或乙酸乙酯)中，室溫?cái)嚢?，加?-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)、1-羥基苯并三唑(HOBt)和三乙胺，1～3h后加入ADIBO，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后用水洗，濃縮至干，二氯甲烷/甲醇柱層析分離得到環(huán)辛炔膽固醇衍生物。

環(huán)辛炔膽固醇衍生物的合成反應(yīng)式5：

環(huán)辛炔類(lèi)脂衍生物

a.將單羧基氨基酸或二元羧基氨基酸和對(duì)甲苯磺酸溶于甲苯中，回流1h～3h。加入脂肪醇，回流5h～15h。冷卻至室溫，減壓蒸餾去除甲苯。用二氯甲烷(或三氯甲烷，或乙酸乙酯)溶解后，5％～15％碳酸氫鈉溶液(或碳酸鈉，或碳酸鉀)、水洗滌，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉(或無(wú)水硫酸鎂)干燥后濃縮，甲醇(或乙醇，或丙酮)重結(jié)晶，得到脂肪醇-二元羧基氨基酸(6)或脂肪醇-單羧基氨基酸(7)，反應(yīng)式如下：

脂肪醇-二元羧基氨基酸的合成反應(yīng)式6：

脂肪醇-單羧基氨基酸的合成反應(yīng)式7：

b.將叔丁氧羰基保護(hù)的單羧基氨基酸，N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)；N-羥基丁二酰亞胺(NHS)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(或氯仿)中，室溫?cái)嚢?h～3h；將6或7和三乙胺溶于DMF(或氯仿)中，室溫?cái)嚢?h～3h后，加入上述混合溶液中，室溫?cái)嚢?0h～24h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液加入水中，二氯甲烷(或氯仿，或乙酸乙酯)萃取產(chǎn)物，濃縮二氯甲烷層(或氯仿，或乙酸乙酯)；乙酸乙酯(或丙酮)溶解，除去析出的DCU，重復(fù)此操作，直至DCU完全去除。甲醇(或乙醇，或丙酮)重結(jié)晶，得到脂肪醇-二元羧基氨基酸-單羧酸氨基酸(含保護(hù)基)(8)或脂肪醇-單羧基氨基酸-單羧酸氨基酸(含保護(hù)基)(9)。

脂肪醇-二元羧基氨基酸-單羧酸氨基酸(含保護(hù)基)的合成反應(yīng)式8：

脂肪醇-單羧基氨基酸-單羧酸氨基酸(含保護(hù)基)的合成反應(yīng)式9：

c.將8或9溶解在三氟醋酸和二氯甲烷混合溶液中，室溫?cái)嚢?.5h～4h；反應(yīng)結(jié)束后，加入5％～15％碳酸氫鈉溶液(或碳酸鈉，或碳酸鉀)調(diào)pH值至中性，收集有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉(或無(wú)水硫酸鎂)干燥后濃縮有機(jī)層，二氯甲烷/甲醇柱層析，得到脂肪醇-二元羧基氨基酸-單羧基氨基酸(10)或脂肪醇-單羧基氨基酸-單羧基氨基酸(11)。

脂肪醇-二元羧基氨基酸-單羧基氨基酸的合成反應(yīng)式10：

脂肪醇-單羧基氨基酸-單羧基氨基酸的合成反應(yīng)式11：

d.將10或11溶解于二氯甲烷(或氯仿，或乙酸乙酯)中，滴加三乙胺后室溫?cái)嚢?0～30min后，加入ADIBO-NHS，攪拌過(guò)夜。稀鹽酸洗滌后用二氯甲烷(或氯仿，或乙酸乙酯)萃取產(chǎn)物，濃縮二氯甲烷層(或氯仿，或乙酸乙酯)，二氯甲烷/甲醇柱層析分離得到環(huán)辛炔衍生化的脂肪醇-二元羧基氨基酸-單羧基氨基酸(12)或脂肪醇-單羧基氨基酸-單羧基氨基酸(13)。

脂肪醇-二元羧基氨基酸-二元羧基氨基酸-環(huán)辛炔的合成反應(yīng)式12：

脂肪醇-二元羧基氨基酸-單羧基氨基酸-環(huán)辛炔的合成反應(yīng)式13：

疊氮小分子酸

將3-溴丙酸(或溴丁酸、溴戊酸、溴己酸等)和疊氮化鈉溶解于乙腈中，90℃回流3～6h。反應(yīng)完成后，旋干溶劑。加入乙酸乙酯。稀鹽酸洗滌后用二氯甲烷(或氯仿，或乙酸乙酯)萃取產(chǎn)物，濃縮二氯甲烷層(或氯仿，或乙酸乙酯)，得到疊氮丙酸(或疊氮丁酸、疊氮戊酸、疊氮己酸等)。

疊氮小分子酸的合成反應(yīng)式14：

疊氮奧曲肽

a.將3-氯-1-丙醇與疊氮鈉溶于水中，90℃攪拌20～24h，乙醚萃取產(chǎn)物，濃縮有機(jī)層，得到3-疊氮-1-丙醇。將3-疊氮-1-丙醇與戴斯馬丁氧化劑(Dess-Martin Periodinane，DMP)。溶于二氯甲烷(或氯仿，或乙酸乙酯)中，室溫，攪拌1～4h，過(guò)濾，濾液濃縮，柱層析純化得到3-疊氮丙醛。

3-疊氮丙醛的合成反應(yīng)式15：

b.將醋酸奧曲肽溶于醋酸-醋酸鈉緩沖液中，加入氰基硼氫化鈉，4℃攪拌，加入3-疊氮丙醛，反應(yīng)10～15h，凍干得到疊氮奧曲肽。

疊氮奧曲肽的合成反應(yīng)式16：

疊氮PEG

a.將mPEG2000溶于二氯甲烷(或氯仿，或乙酸乙酯)中，加入戴斯-馬丁氧化劑，室溫?cái)嚢?～4h，過(guò)濾，濾液濃縮，硅膠柱層析純化得到mPEG-乙醛。將mPEG-乙醛溶于甲醇中，加入2-羥乙基肼，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，濃縮至干，加少量甲醇溶解，滴加無(wú)水乙醚，產(chǎn)生白色沉淀，過(guò)濾，真空干燥，得到mPEG-hyd-ol。

mPEG-hyd-ol的合成反應(yīng)式17：

b.將2-((2-疊氮乙基)氨基甲酰)苯甲酸(N₃-HHPA)溶于二氯甲烷(或氯仿，或乙酸乙酯)中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，冰浴攪拌1～5h，加入mPEG-hyd-ol，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，濃縮，柱層析純化，得到疊氮PEG。

疊氮PEG的合成反應(yīng)式18：

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明的物理-化學(xué)協(xié)同組裝的藥物遞送系統(tǒng)

圖2是點(diǎn)擊反應(yīng)前后空白納米載體的紅外圖譜

圖3是環(huán)辛炔修飾劑的加入對(duì)陽(yáng)離子脂質(zhì)體siRNA包載的影響

圖4是點(diǎn)擊反應(yīng)前后疊氮化奧曲肽的高效液相色譜圖

圖5是點(diǎn)擊反應(yīng)前后載藥納米復(fù)合物的紅外圖譜

圖6是點(diǎn)擊反應(yīng)對(duì)陽(yáng)離子脂質(zhì)體siRNA包覆的影響

圖7是腫瘤細(xì)胞對(duì)點(diǎn)擊后載藥納米復(fù)合物的攝取

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

氮雜二苯并環(huán)辛炔化二硬脂?；字Ｒ掖及返闹苽?/p>

將220mg氮雜二苯并環(huán)辛炔(ADIBO)溶解于15mL氯仿中，滴加0.2mL三乙胺，室溫反應(yīng)0.5h。加入105mg丁二酸酐，室溫反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)完成后，稀鹽酸洗滌兩次，飽和食鹽水洗滌一次，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮有機(jī)層。二氯甲烷/甲醇柱層析，得到黃色油狀物(ADIBO-COOH，224mg，74.7％)。將124mg ADIBO-COOH和37.9mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶解于5mL氯仿中，加入60.3mg二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。反應(yīng)完成后，抽濾，除去產(chǎn)生的全稱(chēng)(DCU)沉淀，濾液旋干。二氯甲烷/甲醇柱層析，得到淡黃色固體(ADIBO-NHS，101mg，64.7％)。將74.8mg二硬脂?；字Ｒ掖及?DSPE)溶解于4mL氯仿中，滴加30.36mg三乙胺。室溫?cái)嚢?h后，加入47.34mg ADIBO-NHS，攪拌過(guò)夜。二氯甲烷/甲醇柱層析，得到白色固體(氮雜二苯并環(huán)辛炔化二硬脂?；字Ｒ掖及罚?2mg，72.1％)。

¹H-NMR(CDCl₃,300MHz,δppm):0.88(t,6H,CH₃),1.29(m,52H,CH₂),1.49,1.39(m,4H,CH₂),1.68(m,4H,COCH₂CH₂),2.25(m,4H,CH₂-O),2.46(m,4H,CH₂CH₂),2.6(m,2H,CHCO),3.47(m,2H,CH₂-NH),3.48(m,2H,CH₂CH₂-NH),3.80,3.65(m,2H,CH₂-O),3.93,3.86(m,2H,CH₂),4.32,4.08(m,2H,CH₂),5.20-5.16(m,1H,CH₂-N),6.84(m,1H,CH₂-N),7.40-7.27(m,7H,CH),7.67-7.65(m,7H,CH).

實(shí)施例2

氮雜二苯并環(huán)辛炔化膽固醇的制備

將5g膽固醇與1.55g丁二酸酐溶于90mL吡啶中，90℃回流24h，冷卻至室溫，加入稀鹽酸(pH 1.0，100mL)，產(chǎn)生白色沉淀，過(guò)濾，濾餅水洗后用乙酸乙酯溶復(fù)溶，二氯甲烷/甲醇柱層析，得到白色固體(膽固醇琥珀酸單酯，5.24g，85.3％)。將100mg膽固醇琥珀酸單酯溶于10mL氯仿中，室溫?cái)嚢?，加?5mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)、46mg 1-羥基苯并三唑(HOBt)和150μL三乙胺，1h后加入62.5mg ADIBO，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后用水洗(10mL×3)，濃縮有機(jī)層，二氯甲烷/甲醇柱層析，得到淡黃色固體(氮雜二苯并環(huán)辛炔膽固醇，64mg，40.3％)。

¹H-NMR(DMSO,300MHz,δppm):1.93-0.64(m,44H,CH₂&COCH₂CH₂N),2.45-2.20(m,5H,COCH₂CH₂CO&COCH₂CH₂N),3.2-2.8(m,2H,COCH₂CH₂N),3.69(d,1H,CH₂-N),4.36(m,1H,CHOCO),5.11(d,1H,CH₂-N),5.36(d,1H,C＝CH),7.45-7.07(m,7H,CH),7.72-7.65(d,1H,CH).

實(shí)施例3

氮雜二苯并環(huán)辛炔化賴(lài)氨酸-谷氨酸-十四醇的制備

將2.9g谷氨酸和2.22g對(duì)甲苯磺酸(TsOH)溶于50mL甲苯中，回流1h。加入5g正十四醇回流12h。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾去除甲苯。濃縮物用35mL甲醇重結(jié)晶，將得到的白色粉末狀固體溶解于適量二氯甲烷，用5％碳酸氫鈉水溶液洗滌(10mL×2)，再用適量的飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，得白色粉末狀固體(十四醇-谷氨酸，TA₂-Glu，3.42g，53.4％)。將3.6g N-α-(叔丁氧羰基)-N-ε-芐氧羰基-L-賴(lài)氨酸(Boc-Lys(Z)-OH)；2.9g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)；2.04g1-羥基苯并三氮唑(HOBt)溶于40mL氯仿中，室溫?cái)嚢?h；將5.1gTA₂-Glu和3.9mL三乙胺溶于30mL氯仿中，室溫?cái)嚢?h后，加入上述混合溶液中，室溫?cái)嚢?2h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用水洗滌(50mL×2)，再用適量飽和食鹽水洗滌，濃縮有機(jī)層，二氯甲烷/甲醇柱層析，得到白色固體(十四醇-谷氨酸-N-α-(叔丁氧羰基)-N-ε-芐氧羰基-L-賴(lài)氨酸，TA₂-Glu-(Boc)Lys(Z)，2.75g，32.2％)。將2.75g TA₂-Glu-(Boc)Lys(Z)溶解于55mL四氫呋喃和5.5mL無(wú)水甲醇的混合溶劑中，加入10％鈀碳(Pt/C,275mg)，氫氣環(huán)境下，室溫反應(yīng)3h。反應(yīng)完成后，抽濾除去鈀碳，蒸去溶劑后，二氯甲烷/甲醇柱層析，得到透明蠟狀固體(十四醇-谷氨酸-Nα-(叔丁氧羰基)-L-賴(lài)氨酸，TA₂-Glu-(Boc)Lys，690mg，29.5％)。將690mg TA₂-Glu-(Boc)Lys溶解于15mL氯仿中，滴加272mg三乙胺。室溫?cái)嚢?min后，加入425.3mg ADIBO-NHS，攪拌過(guò)夜。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用水洗滌(30mL×2)，再用適量飽和食鹽水洗滌，蒸去溶劑后，二氯甲烷/甲醇柱層析，得到黃色固體(十四醇-谷氨酸-Nα-(叔丁氧羰基)-L-賴(lài)氨酸-氮雜二苯并環(huán)辛炔，TA₂-Glu-(Boc)Lys-ADIBO，336mg，33.2％)。將336mgTA₂-Glu-(Boc)Lys-ADIBO溶解于17mL飽和HCl的乙酸乙酯溶液，0℃攪拌12h。反應(yīng)完成后，使用5％碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7-8，乙酸乙酯萃取(30mL×3)，合并有機(jī)層。二氯甲烷/甲醇柱層析，得到淡黃色固體(十四醇-谷氨酸-賴(lài)氨酸-氮雜二苯并環(huán)辛炔，TA₂-Glu-Lys-ADIBO，82mg，26.9％)。

¹H-NMR(CDCl₃,300MHz,δppm):0.88(t,6H,CH₃),1.26(m,42H,CH₂),1.43(m,4H,CH₂),1.63(m,4H,CH₂),2.01,1.83(m,2H,CH₂CH₂NHCO),2.18(m,2H,CH₂CHCO),2.19(m,2H,CH₂CH₂COO),2.39(m,2H,CH₂COO),2.51(s,4H,NHCOCH₂CH₂CONH),2.72(m,2H,CH₂CON),3.24(m,2H,CH₂NHCO),3.42(m,1H,NHCHCO),3.50(m,CH2CH₂NH),4.09(m,4H,CH₂OCO),4.57(m,1H,NH),5.20-5.16(m,1H,CH₂-N),6.84(m,1H,CH₂-N),7.36-7.01(m,8H,CH),8.0(m,1H,NH).

實(shí)施例4

疊氮丙酸的制備

將0.77g3-溴丙酸溶解于4mL無(wú)水DMF中，加入0.65g疊氮化鈉，100℃回流4h。

反應(yīng)完成后，加入30mL水，用乙酸乙酯萃取多次，合并有機(jī)層。二氯甲烷/甲醇柱層析，得到棕黃色油狀物(疊氮丙酸，419mg，72.4％)。

¹H-NMR(CDCl₃,300MHz,δppm):3.60(t,2HCH₂-N₃),2.66(t,2H,CH₂-COOH).

實(shí)施例5

疊氮奧曲肽的制備

將3.2g3-氯-1-丙醇與6.5g疊氮鈉溶于100mL水中，90℃攪拌20h，乙醚萃取(100mL×5)，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮得到淡黃色油狀物(3-疊氮-1-丙醇，71.4％)。將0.5g3-疊氮-1-丙醇與3.15g戴斯馬丁氧化劑溶于50mL二氯甲烷中，室溫，攪拌1h，過(guò)濾，濾液濃縮，二氯甲烷/甲醇柱層析，得到黃色油狀物(3-疊氮丙炔，34.2％)。將20mg醋酸奧曲肽溶于20mL pH5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.1mM)中，加入25mg氰基硼氫化鈉，4℃攪拌下加入5mg3-疊氮丙炔，維持4℃反應(yīng)10h，凍干得到白色粉末(疊氮奧曲肽)。

制備得到的疊氮奧曲肽通過(guò)高效液相色譜、高分辨質(zhì)譜和圓二色譜表征。

實(shí)施例6

疊氮PEG的制備

將2gmPEG2000溶于20mL二氯甲烷中，加入840mg戴斯-馬丁氧化劑，室溫?cái)嚢?h，過(guò)濾，濾液濃縮，二氯甲烷/甲醇柱層析，得到淡黃色固體(mPEG-乙醛，93.2％)。將400mg PEG-乙醛溶于30mL甲醇中，加入5μL 2-羥乙基肼，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，濃縮至干，加少量甲醇溶解，在冰浴中加入無(wú)水乙醚，產(chǎn)生白色沉淀，過(guò)濾，真空干燥，得到淡黃色固體(mPEG-hyd-ol，91.5％)。將48mg N₃-HHPA(疊氮六氫苯酐)溶于10mL氯仿中，加入76mg EDCI和5mg DMAP，冰浴攪拌2h，加入400mg mPEG-hyd-ol，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，濃縮，二氯甲烷/甲醇柱層析，得黃色固體(疊氮PEG，92.3％)。

¹H-NMR(CDCl₃,300MHz,δppm):2.77-0.58(m,10H,cyclohexane),2.11-1.75(m,2H,N₃CH₂),3.30-3.22(m,2H,N-NHCH₂),3.38-3.30(m,2H,CONHCH₂),3.46(s,3H,OCH₃),3.55(m,OCH₂CH₂O(PEG)),4.28-4.05(m,2H,COOCH₂),5.22(d,2H,OCH₂-CH＝N),7.19(t,1H,CH＝N).

實(shí)施例7

取市售SPC 8mg，陽(yáng)離子脂質(zhì)10mg，膽固醇8mg，加入氮雜二苯并環(huán)辛炔化賴(lài)氨酸-谷氨酸-十四醇22mg，溶于3ml氯仿與2ml甲醇的混合有機(jī)溶劑中。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)5min除去有機(jī)溶劑，真空干燥過(guò)夜。加入5ml水，在37℃下水合30min。探頭超聲10-30min。得到的脂質(zhì)體溶液定依次過(guò)0.8μm，0.45μm，0.22μm濾膜，得到含ADIBO-Lys-Glu-TA₂的空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體ADL-1。以相同的流程，制備不含環(huán)辛炔的陽(yáng)離子脂質(zhì)體(CL-1)作為對(duì)照。處方為市售SPC 30mg，陽(yáng)離子脂質(zhì)10mg，膽固醇8mg。粒徑電位測(cè)定結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，氮雜二苯并環(huán)辛炔化賴(lài)氨酸-谷氨酸-十四醇的加入不會(huì)影響陽(yáng)離子脂質(zhì)體本身的大小和表面電性。

表1空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體的性質(zhì)

實(shí)施例8

取市售SPC 15mg，陽(yáng)離子脂質(zhì)15mg，加入氮雜二苯并環(huán)辛炔化膽固醇12mg，溶于3ml氯仿與2ml甲醇的混合有機(jī)溶劑中。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)5min除去有機(jī)溶劑，真空干燥過(guò)夜。加入5ml水，在37℃下水合30min。探頭超聲10-30min。得到的脂質(zhì)體溶液定依次過(guò)0.8μm，0.45μm，0.22μm濾膜，得到含ADIBO-chol的空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體ADL-2。以相同的流程，制備不含環(huán)辛炔的陽(yáng)離子脂質(zhì)體(CL-2)作為對(duì)照。處方為市售SPC 15mg，陽(yáng)離子脂質(zhì)15mg，膽固醇12mg。粒徑電位測(cè)定結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，氮雜二苯并環(huán)辛炔化膽固醇的加入不會(huì)影響陽(yáng)離子脂質(zhì)體本身的大小和表面電性。

表2 空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體的性質(zhì)

實(shí)施例9

取市售SPC 8mg，陽(yáng)離子脂質(zhì)10mg，加入氮雜二苯并環(huán)辛炔化二硬脂?；字Ｒ掖及?mg，氮雜二苯并環(huán)辛炔化膽固醇12mg，溶于3ml氯仿與2ml甲醇的混合有機(jī)溶劑中。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)5min除去有機(jī)溶劑，真空干燥過(guò)夜。加入5ml水，在37℃下水合30min。探頭超聲10-30min。得到的脂質(zhì)體溶液定依次過(guò)0.8μm，0.45μm，0.22μm濾膜，得到含ADIBO-DSPE和ADIBO-chol的空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體ADL-3。以相同的流程，制備不含環(huán)辛炔的陽(yáng)離子脂質(zhì)體(CL-3)作為對(duì)照。處方為市售SPC 16mg，陽(yáng)離子脂質(zhì)10mg，膽固醇12mg。粒徑電位測(cè)定結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，氮雜二苯并環(huán)辛炔化二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和氮雜二苯并環(huán)辛炔化膽固醇的加入不會(huì)影響陽(yáng)離子脂質(zhì)體本身的大小和表面電性。

表3 空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體的性質(zhì)

實(shí)施例10

取465μL實(shí)施例7的環(huán)辛炔修飾的空白脂質(zhì)體ADL-1置于西林瓶中，加入338μL疊氮化PEG的水溶液(1mg/mL，N₃:ADIBO＝0.15:1)，室溫孵育1h。將上述制劑凍干，掃描紅外吸收譜圖，如圖2。結(jié)果顯示,點(diǎn)擊反應(yīng)后,疊氮化PEG中的2100cm^-1處特征峰消失,說(shuō)明點(diǎn)擊反應(yīng)的發(fā)生。

實(shí)施例11

將實(shí)施例8中的兩種空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體，按照不同的氮磷比(N/P＝0.5，1，2，3，4)與siRNA進(jìn)行混合，渦旋10s，室溫放置30min，即得包載siRNA的環(huán)辛炔修飾的納米復(fù)合物，進(jìn)行凝膠阻滯電泳實(shí)驗(yàn)，紫外燈下觀察，結(jié)果顯示，當(dāng)N/P大于等于3時(shí)，陽(yáng)離子脂質(zhì)體可以將siRNA完全包覆，見(jiàn)圖3。

實(shí)施例12

根據(jù)實(shí)施例11，當(dāng)N/P大于等于3時(shí)，siRNA可以被穩(wěn)定地包覆。所以本實(shí)施例選取N/P等于4的比例。取180μLsiRNA(濃度0.5μg/μL)和200μL實(shí)施例8中的空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體ADL-2，分別以1mL純水稀釋?zhuān)旌?，室溫靜置20min，得包載siRNA的環(huán)辛炔修飾的脂質(zhì)體AD-CC-1。粒徑電位測(cè)定結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，包載負(fù)電性的siRNA后，粒徑略微有所增加，由于靜電吸附后抵消了部分正電荷，電位略微降低。說(shuō)明，siRNA可以成功裝載到環(huán)辛炔修飾的脂質(zhì)體中。

表4 包載siRNA前后陽(yáng)離子脂質(zhì)體的性質(zhì)

實(shí)施例13

向?qū)嵤├?2制備的包載siRNA的環(huán)辛炔修飾的脂質(zhì)體AD-CC-1同時(shí)加入70μL疊氮化奧曲肽溶液(0.5mg/mL，N₃:ADIBO＝0.05)與140μL疊氮化PEG溶液(1mg/mL，N₃:ADIBO＝0.1)，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，得到點(diǎn)擊修飾奧曲肽與PEG的包載siRNA的納米復(fù)合物AD-CC-PEG/Oct-1。取100μL上述制劑，加入1％Triton X-100溶液將脂質(zhì)體破乳，渦旋5min，置于離心機(jī)中離心(12000rpm，10min)，然后取上清液進(jìn)樣，HPLC測(cè)定N₃-Oct濃度，如圖4。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，制劑中游離疊氮化奧曲肽峰消失，說(shuō)明加入的N₃-Oct完全連接到了載體表面。其余制劑凍干，掃描紅外吸收譜圖。如圖5。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，疊氮基團(tuán)的峰信號(hào)消失，說(shuō)明N₃-PEG點(diǎn)擊反應(yīng)完全發(fā)生。綜合以上結(jié)果可以顯示，包載siRNA的環(huán)辛炔修飾的脂質(zhì)體AD-CC-1可以同時(shí)完成N₃-Oct與N₃-PEG的點(diǎn)擊反應(yīng)。

實(shí)施例14

取36μL siRNA(濃度0.5μg/μL)和40μL實(shí)施例8中的空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體ADL-2，分別以200μL純水稀釋?zhuān)旌?，室溫靜置20min，得包載siRNA的環(huán)辛炔修飾的脂質(zhì)體AD-CC-2。平行制備兩份上述AD-CC-2，其中一份同時(shí)加入70μL疊氮化奧曲肽溶液(0.5mg/mL，N₃:ADIBO＝0.05)與140μL疊氮化PEG溶液(1mg/mL，N₃:ADIBO＝0.1)，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，得制劑AD-CC-PEG/Oct-2并進(jìn)行瓊脂糖電泳。紫外燈下觀察，如圖6。結(jié)果顯示，在N/P＝4時(shí)，本發(fā)明制備的環(huán)辛炔修飾的陽(yáng)離子脂質(zhì)體可以有效地包覆siRNA，并且在進(jìn)行無(wú)銅催化的點(diǎn)擊反應(yīng)之后，siRNA仍然穩(wěn)定地包覆在載體中，沒(méi)有發(fā)生泄漏。

實(shí)施例15

取20μL siRNA(濃度為0.5μg/μL)和13μL實(shí)施例9中的空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體ADL-3，分別以400μL純水稀釋?zhuān)旌暇鶆蚝?，室溫靜置30min，然后加入32μL疊氮丙酸(0.5mg/mL，N₃:ADIBO＝0.5:1)，補(bǔ)充體積至900μL。取上述液體各450μL，用pH 7.4和pH 6.5的緩沖鹽分別稀釋至2mL，測(cè)定其電位粒徑。粒徑電位測(cè)定結(jié)果(如表4所示)。結(jié)果顯示，本發(fā)明制備的環(huán)辛炔修飾的陽(yáng)離子脂質(zhì)體與疊氮丙酸進(jìn)行無(wú)銅催化的點(diǎn)擊反應(yīng)之后，可以完成電荷反轉(zhuǎn)，即在中性情況下表面電荷為負(fù)，弱酸性情況下表面電荷為正。

表4 載有siRNA的陽(yáng)離子脂質(zhì)體點(diǎn)擊疊氮丙酸后的性質(zhì)

實(shí)施例16

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞Bel-7402和宮頸癌細(xì)胞Hela以1×10⁵個(gè)/孔分別接種于24孔板和激光共聚焦小皿中，完全培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)48h。將實(shí)施例13中點(diǎn)擊疊氮丙酸后的載藥脂質(zhì)體分別在pH7.4、pH6.5條件下與肝癌細(xì)胞Bel-7402和宮頸癌細(xì)胞Hela進(jìn)行孵育。3h后，通過(guò)流式細(xì)胞儀定量觀察pH值對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞攝取納米復(fù)合物的影響，如圖7所示。結(jié)果顯示，在偏酸性情況下，脂質(zhì)體表面的電荷由負(fù)轉(zhuǎn)化為正，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的攝取增加。