本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域的基因重組表達(dá)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種通過點(diǎn)突變提高大片段嗜熱脂肪地芽孢桿菌DNA聚合酶(BstDNA聚合酶)活性的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：核酸擴(kuò)增技術(shù)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，特別是傳染病病原的檢測，近年來以等溫?cái)U(kuò)增為代表的新方法因檢測簡單、快速以及高特異性高靈敏性，具有更為廣泛的的應(yīng)用價(jià)值。(TsugunoriNotomi,HarumiMasubuchi,ToshhihiroYonekawaetal.,“Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA,”NucleicAcidsResearch,vol,28,No.12,2000)。IsothermalMultiple-Self-Matching-InitiatedAmplification(IMSA)等溫?cái)U(kuò)增是Loop-mediatedisothermalamplification(LAMP)等溫?cái)U(kuò)增基礎(chǔ)上發(fā)展起來的另一種新型等溫?cái)U(kuò)增方法，與之相比具有更高的靈敏度，檢測限更低等優(yōu)點(diǎn)(XiongDing,KaiNie,LeiShi,XuejunMa,“ImprovedDetectionLimitinRapidDetectionofHumanEnterovirus71andCoxsackievirusA16byaNovelReverseTranscription–IsothermalMultiple-Self-Matching-InitiatedAmplificationAssay,”JournalofClinicalMicrobiology,vol.52,no.6,pp.1862–1870,2014)，因此本發(fā)明所涉及的等溫?cái)U(kuò)增方法均選擇IMSA。等溫?cái)U(kuò)增依賴于BstDNA聚合酶，其屬于I型DNA聚合酶，來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌屬，完整序列包含三種活性(i):5′-3′外切酶活性(ii)5′-3′聚合酶活性(iii)3′-5′外切酶活性，與其他DNA聚合酶相比，BstDNA聚合酶有著較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、鏈置換活性及聚合酶活性，因此吸引了越來越多的人的研究興趣(Seng-MengPhang,Chai-YawTeo,VictorWongThiWong,etal.,“CloningandcompletesequenceoftheDNApolymerase-encodinggene(BstpolⅠ)andcharacterisationoftheKleow-likefragmentfromBacillusstearothermophilus,”Gene,vol.163,pp.65-68,1995)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種通過點(diǎn)突變提高大片段嗜熱脂肪地芽孢桿菌DNA聚合酶活性的方法。酶的基因來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)GIM1.543(購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)。通過基因重組獲得大片段BstDNA聚合酶質(zhì)粒。將大片段BstDNA聚合酶的第310位氨基酸G突變?yōu)長或A，或?qū)?10位氨基酸D突變?yōu)镋，突變位點(diǎn)氨基酸均為保守氨基酸。結(jié)果顯示與野生型BstDNA聚合酶相比，突變體G310L、G310A和D540E的聚合效率均有顯著提高，且都高于商業(yè)化BstDNA聚合酶，具有較大的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的另一目的在于提供一種定量檢測BstDNA聚合酶聚合效率的方法。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種通過點(diǎn)突變提高大片段嗜熱脂肪地芽孢桿菌DNA聚合酶活性的方法，是通過酶切連接將野生型BstDNA聚合酶基因克隆到原核表達(dá)載體上，并通過RF克隆技術(shù)對氨基酸G310或D540進(jìn)行點(diǎn)突變構(gòu)建突變體，并轉(zhuǎn)入原核表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，純化，并進(jìn)行酶活檢測；所述的野生型BstDNA聚合酶的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。編碼野生型BstDNA聚合酶的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。所述的突變體為G310L、G310A或D540E。所述的突變體G310L的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。所述的突變體G310L的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。所述的突變體G310A的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示。所述的突變體G310A的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。所述的突變體D540E的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示。所述的突變體D540E的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示。所述的原核表達(dá)載體優(yōu)選為pET28a；所述的突變體的具體獲得步驟如下：以野生型pET28a-Bst質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)突變引物，通過RF克隆，經(jīng)核酸擴(kuò)增及DpnⅠ酶消化后，轉(zhuǎn)化。所述的純化是鎳柱親和層析方法進(jìn)行純化。一種定量檢測BstDNA聚合酶聚合效率的方法，是用HPLC方法檢測等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)前后dCTP的減少量，繼而計(jì)算酶或突變體的Kcat。Kcat值越大，表明聚合效率越高，其酶活性越高。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，IMSA等溫?cái)U(kuò)增方法用到的模板為手足口病EV71病毒的VP1基因。所述的通過點(diǎn)突變提高大片段嗜熱脂肪地芽孢桿菌DNA聚合酶活性的方法在提高大片段嗜熱脂肪地芽孢桿菌DNA聚合酶活性中的應(yīng)用。所述的定量檢測BstDNA聚合酶聚合效率的方法在定量檢測BstDNA聚合酶聚合效率中的應(yīng)用。本發(fā)明的機(jī)理是：本研究從嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)GIM1.543中獲得BstDNA聚合酶基因組，并對BstDNA聚合酶進(jìn)行克隆，表達(dá)，純化及定向改造，以滿足不斷增長的市場需要。大片段BstDNA聚合酶具有5′-3′聚合酶活性，無5′-3′外切酶活性，熱穩(wěn)定性高，鏈置換活性好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：(1)由于專利保護(hù)制度嚴(yán)謹(jǐn)，BstDNA聚合酶目前僅有NEWENGLANDBioLabs公司有售，且價(jià)格比普通的聚合酶都要昂貴，國內(nèi)卻鮮少有公司出售。因此我們在實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)大片段BsDNA聚合酶。(2)在大片段BstDNA聚合酶基礎(chǔ)上對G310L(A)和D540E兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，與野生型BstDNA聚合酶相比，G310L和G310A的突變體聚合效率都有所提高，且都高于商業(yè)化BstDNA聚合酶，而D540E與野生型聚合效率略有改變。說明G310L，G310A和D540E的突變體聚合效率顯著高于野生型BstDNA聚合酶，遠(yuǎn)高于商業(yè)化BstDNA聚合酶。本發(fā)明通過點(diǎn)突變提高BstDNA聚合酶活性，為科研及實(shí)際檢測提供更高效率的BstDNA聚合酶，應(yīng)用價(jià)值明顯。(3)本發(fā)明運(yùn)用高效液相(HPLC)方法定量檢測IMSA等溫?cái)U(kuò)增方法消耗的dCTP。(4)本發(fā)明提供一種快捷簡便的方法表達(dá)BstDNA聚合酶，并使其與商業(yè)化的BstDNA聚合酶有更快的聚合速率，為BstDNA聚合酶國產(chǎn)化提供便利。附圖說明圖1是大片段pET28a-Bst重組質(zhì)粒構(gòu)建圖；其中，(a)泳道M：DNAMarker，泳道1：基因組PCR圖；(b)泳道M：DNAMarker，泳道1：重組質(zhì)粒雙酶切。圖2是WT大片段BstDNA聚合酶表達(dá)的SDS-PAGE鑒定；其中，泳道M：proteinMarker，泳道1：未誘導(dǎo)全菌，泳道2：未誘導(dǎo)上清，泳道3：未誘導(dǎo)沉淀，泳道4：誘導(dǎo)全菌，泳道5：誘導(dǎo)上清，泳道6：誘導(dǎo)沉淀。圖3是IMSA顏色判定法定性檢測酶活；其中，每個(gè)反應(yīng)管對應(yīng)加入的蛋白為1：商業(yè)化，2：野生型，3：D540E，4：G310A，5：G310L，6：陰性對照。圖4是恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀DEAOU-3080C檢測聚合效率；其中，1：商業(yè)化，2：野生型，3：D540E，4：G310A，5：G310L，6：陰性對照。圖5是高效液相檢測定量檢測聚合效率；其中，(a)陰性對照，dCTP保留時(shí)間為16.583min，對應(yīng)峰面積為2459.42；(b)G310L，dCTP保留時(shí)間為17.447min，對應(yīng)峰面積為1781.62；(c)野生型(WT)，dCTP保留時(shí)間為17.059min，對應(yīng)峰面積為1840.69；(d)商業(yè)化，dCTP保留時(shí)間為17.454min，對應(yīng)峰面積為1941.52。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。如無特別說明，均認(rèn)為常規(guī)方法。實(shí)施例1：野生型pET28a-Bst重組蛋白工程菌構(gòu)建1、嗜熱脂肪地芽孢桿菌基因組的獲得(1)取少量甘油凍存菌種嗜熱脂肪地芽孢桿菌劃線至無抗LB平板中，55℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48h。(2)挑取單菌落至無抗液體LB培養(yǎng)基中55℃，220rpm搖床培養(yǎng)過夜。(3)用細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根DP302)對嗜熱脂肪地芽孢桿菌進(jìn)行基因組提取。2、以提取的基因組為模板對BstDNA聚合酶基因進(jìn)行擴(kuò)增。(1)擴(kuò)增引物序列的設(shè)計(jì)引物名稱序列Bst-F5′-CTGTTCCATATG(NdeI)GAAGGCGAAAAGCCGCTC-3′Bst-R5′-CCGCTCGAG(XhoI)TTTGGCGTCGTACCACGTC-3′(2)PCR反應(yīng)體系(50μL)：反應(yīng)組分含量GenomeDNA1μLPrimeSTARHS(Premix)25μLBst-F(10μM)1μLBst-R(10μM)1μLddH2OUpto50μL(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：(4)PCR反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行1％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。(5)PCR產(chǎn)物37℃雙酶切2h，體系如下：反應(yīng)組分體積Bst基因2μgNdeI2μLXhoI2μL10×FastDigestbuffer5μLddH2OUpto50μL(6)載體37℃雙酶切2h，體系如下：反應(yīng)組分體積pET28a2μgNdeI2μLXhoI2μL10×FastDigestbuffer5μLddH2OUpto50μL(7)16℃連接過夜，連接體系如下：反應(yīng)組分體積pET28a雙酶切產(chǎn)物80μgBst雙酶切產(chǎn)物40μgT4DNALigase0.5μL10×T4DNALigaseBuffer1μLddH2OUpto10μL結(jié)果見圖1，測序結(jié)果與理論結(jié)果一致，并與預(yù)期核苷酸序列完全一致。結(jié)論：pET28a-Bst重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。3、pET28a-Bst重組蛋白的表達(dá)(1)上述步驟2中的陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中，挑取單克隆接種至5mL含有50μg/mLKanLB液體培養(yǎng)基中37℃擴(kuò)大培養(yǎng)。(2)于OD600為0.5時(shí)加入1mMIPTG，37℃誘導(dǎo)6h后離心收集菌體。(3)超聲裂解，上清和沉淀分別加入上樣緩沖液沸水煮10min。(4)濃縮膠80V，分離膠120V進(jìn)行SDS-PAGE電泳。(5)電泳完畢用考馬斯亮藍(lán)染色液染色，脫色液脫色。結(jié)果：如圖2所示，重組pET28a-Bst蛋白得到成功誘導(dǎo)表達(dá)。蛋白主要分布于上清中。結(jié)論：pET28a-Bst重組蛋白成功表達(dá)。4、pET28a-Bst重組蛋白的純化(1)pET28a-Bst在37℃，180rpm的情況下誘導(dǎo)表達(dá)6h。(2)收集菌體，用純化BindingBuffer重懸，鎳柱親和層析方法純化。(3)收集純化前后的樣品，SDS-PAGE檢測，并將上樣樣品進(jìn)行WesternBlot檢測。(4)將純化后的蛋白4℃透析過夜，BCA試劑盒測定蛋白濃度。結(jié)果：如圖2所示，200mM咪唑洗脫下來的蛋白條帶大小為61kDa與重組蛋白理論大小一致。結(jié)論：成功純化獲得野生型重組蛋白。實(shí)施例2：突變體蛋白工程菌構(gòu)建1、RF克隆法構(gòu)建各突變體(1)擴(kuò)增引物序列的設(shè)計(jì)(2)PCR反應(yīng)體系(20μL)：反應(yīng)組分含量野生型pET28a-Bst0.3μLPrimeSTARHS(Premix)10μLF(10μM)0.4μLR(10μM)0.4μLddH2OUpto20μL(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：DpnⅠ消化反應(yīng)組分含量PCRF反應(yīng)液17μL10×FastDigestBuffer2μLDpnⅠ1μL條件：37℃反應(yīng)2h。(4)取消化后的產(chǎn)物10μL轉(zhuǎn)化E.CoilDH5a。2、各個(gè)突變體的表達(dá)與純化：方法參照實(shí)施例1中pET28a-Bst重組蛋白的表達(dá)及純化。結(jié)果：各突變體蛋白得到成功誘導(dǎo)表達(dá)且主要分布于上清中。200mM咪唑洗脫下來的蛋白條帶大小為61kDa與理論大小一致，與商業(yè)化BstDNA聚合酶67kDa相比，重組蛋白分子量小于商業(yè)化蛋白。結(jié)論：成功純化獲得G310L(A)，D540E突變體蛋白。實(shí)施例3：IMSA法酶活驗(yàn)證1、HNB染色法定性檢測酶活(1)以EV71病毒C4亞型VP1基因的2978～3248nt序列依據(jù)PrimerExplorerV4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/)在線軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：PrimernameSequence(5′-3′)DsF-EV715′-ACCATTGATAAGCACTCGCAGGGTCAAGCTGTCAGACCCTCC-3′DsR-EV715′-GAACACAAACAGGAGAAAGATCTTGTGAGAACGTGCCCATCA-3′FIT-EV715′-TCCGAATGTGGGATATCCGTCATAAGTTTCAGTGCCATTCATGTC-3′RIT-EV715′-TTATGACGGATATCCCACATTCGGAAGGACATGCCCCGTATT-3′SteF-EV715′-GAACACAAACAGGAGAAAGATCTTG-3′SteR-EV715′-ACCATTGATAAGCACTCGCAGG-3′(2)IMSA等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)組分含量模板0.3μLBstDNApol(NEB)1μLDsF-EV71(5.0mM)1μLDsR-EV71(5.0mM)1μLFIT-EV71(20.0mM)1μLRIT-EV71(20.0mM)1μLSteF-EV71(40.0mM)1μLSteR-EV71(40.0mM)1μL2×RM12.5μLHNB1μLddH2OUpto25μL以上反應(yīng)體系是商業(yè)化BstDNA聚合酶作為陽性對照，在本發(fā)明中參照陽性對照設(shè)置了5個(gè)反應(yīng)體系，1中加入的商業(yè)化BstDNA聚合酶，2～5分別加入與商業(yè)化BstDNA聚合酶等量的各種蛋白，順序依次為：商業(yè)化，野生型，D540E，G310L，G310A；6為陰性對照。(3)IMSA等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)程序63℃60min85℃2min結(jié)果：如圖3所示，1～5為陽性，顯示天藍(lán)色；6為陰性對照，顯示紫色。其中，每個(gè)數(shù)字標(biāo)記對應(yīng)的蛋白如下表所示：NO.123456sampleNEBWTD540EG310AG310L陰-/++++++－Tt(min)18:3015:0016:0013:3012:00結(jié)論：野生型及突變體D540E，G310A，G310L均有活性。2、熒光法檢測酶活方法參照上述1、HNB染色法定性檢測酶活，各反應(yīng)體系中不加HNB，均改為加入1μL熒光染料，所用熒光染料為稀釋1000倍的syto9。實(shí)驗(yàn)所需儀器為廣州迪奧生物科技有限公司的恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀，反應(yīng)時(shí)間為60min。以反應(yīng)時(shí)間檢測酶反應(yīng)的效率。結(jié)果：如圖4所示，1～5為陽性，有S型曲線；6為陰性，無S型曲線。其中1代表NEB商業(yè)化BstDNA聚合酶，2代表WT，3代表D540E，4代表G310A，5代表G310L。其中，G310L反應(yīng)時(shí)間最短為12min，野生型為15min，商業(yè)化為18:30min。結(jié)論：與野生型BstDNA聚合酶相比，G310L和G310A的突變體聚合效率都有所提高，且都高于商業(yè)化BstDNA聚合酶，而D540E比野生型聚合效率略有提高。3、HPLC法定量檢測酶活并對Kcat值進(jìn)行研究(1)HPLC條件采用WaterssymmetryC18色譜柱(3.5μm，4.6×150mm)，流動(dòng)相緩沖液A：10mM氫氧化四丁基銨作為離子對試劑，10mM磷酸二氫鈉及0.25％甲醇。緩沖液B：5.6mM氫氧化四丁基銨作為離子對試劑，50mM磷酸二氫鈉及30％甲醇。采用梯度洗脫方法：0～30min為60％A及40％B，30～60min為40％A及60％B。流速：1.0mL/min。柱溫：27℃。(2)以不同濃度的dCTP(sigmaHPLC級)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，2倍梯度稀釋，最終為5個(gè)濃度梯度：0，3mM，0.15mM，0.075mM，0.0375mM，0.0187mM。0.22μm的膜進(jìn)行過濾。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照上述IMSA反應(yīng)體系及程序進(jìn)行反應(yīng)，其中不含HNB和熒光染料，且反應(yīng)體系為75μL。IMSA反應(yīng)完成后的反應(yīng)液10稀釋，HPLC檢測，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果：dCTP標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，線性方程為y＝－174.22+26309.69x(R2＝0.997)a：陰性對照：保留時(shí)間為16.583min峰面積為2459.42；見圖5(a)。b：G310L：突變體保留時(shí)間為17.447min，峰面積為1781.62；見圖5(b)。c：WT：保留時(shí)間為17.059min，峰面積為1840.69；見圖5(c)。d：NEB：商業(yè)化BstDNA聚合酶為17.454min，峰面積為1941.52；見圖5(d)。結(jié)論：以表格形式呈現(xiàn)dCTP的Kcat其中IMSA反應(yīng)體系為75μL。從表中可以看出G310L突變體聚合反應(yīng)效率最高，野生型其次，商業(yè)化最慢，與熒光法檢測酶活結(jié)論一致。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3