本發(fā)明涉及一種光纖回音壁DNA雜交微流控探測(cè)器，特別是涉及一種基于微納光纖輔助的微腔回音壁DNA雜交微流控探測(cè)器，屬于傳感探測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

與傳統(tǒng)DNA探測(cè)手段相比，其性能在探測(cè)靈敏度及微型化尺寸上解決了痕量DNA樣本檢測(cè)的難題。

背景技術(shù)：

自從人類(lèi)基因組計(jì)劃實(shí)施以來(lái)，越來(lái)越多的生物基因序列得到確定，但是一旦某一序列出現(xiàn)混亂，快速測(cè)序及準(zhǔn)確辨識(shí)混亂序列的基因檢測(cè)技術(shù)將會(huì)成為科研工作者的研究目標(biāo)。因此，探索新型、高效、準(zhǔn)確的DNA檢測(cè)技術(shù)對(duì)大量遺傳信息的分析顯得尤為重要。

隨著光纖技術(shù)的突破與發(fā)展，光纖結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)靈活，模式調(diào)控手段豐富，高度集成化尺寸，為無(wú)標(biāo)記DNA探測(cè)器件的發(fā)展提供了技術(shù)支持。其中光纖回音壁模式因?yàn)榫哂懈〉哪Ｊ襟w積和極高的品質(zhì)因子，使其在高精度生物檢測(cè)方面具有重大應(yīng)用價(jià)值。光由光密介質(zhì)向光疏介質(zhì)傳輸，當(dāng)入射角度足夠大時(shí)，會(huì)發(fā)生全反射，在彎曲的高折射率界面內(nèi)，光會(huì)被限制在閉合的腔體邊界內(nèi)，保持穩(wěn)定的行波傳輸模式，此即為回音壁模式。對(duì)于回音壁微諧振腔內(nèi)的模式，主要能量被束縛在介質(zhì)腔內(nèi)，還有一部分能量在腔界面全反射處，由于古斯-漢森相移，泄露于微腔外部表面環(huán)境中，這就是模式的倏逝場(chǎng)，這部分能量以指數(shù)衰減的形式分布在微腔外表面幾百納米到一微米的范圍內(nèi)。當(dāng)微諧振腔外部環(huán)境發(fā)生變化或微腔外表面粘附納米顆?；蛏锓肿訒r(shí)，就會(huì)引起回音壁共振模式的頻率漂移，因回音壁模式體積很小，且具有很高的品質(zhì)因子，其譜線線寬非常窄，譜線很微小的漂移也很容易被檢測(cè)到，因此，在精細(xì)和微量生物探測(cè)方面具有重大應(yīng)用潛力。

目前，大多采用拉錐光纖近場(chǎng)外部耦合方式將光耦合進(jìn)環(huán)形微腔，實(shí)現(xiàn)高效率的回音壁模式激發(fā)和耦合。此時(shí)拉錐光纖的直徑一般要求小于2微米，且錐區(qū)較長(zhǎng)，以降低因直徑減小對(duì)傳輸光能量的限制損耗。但直徑小于2微米的光纖十分脆弱，空氣粉塵污染和擾動(dòng)對(duì)細(xì)錐光纖的影響很大，且超凈實(shí)驗(yàn)環(huán)境苛刻。鑒于以上不足，研究高魯棒性，高耦合效率，高度集成的光纖回音壁模式耦合方式是順應(yīng)當(dāng)今醫(yī)療需求的發(fā)展目標(biāo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種基于微納光纖輔助的微腔回音壁DNA雜交微流控探測(cè)器。它可以保證具有較強(qiáng)的近場(chǎng)倏逝波耦合，且結(jié)構(gòu)緊湊，魯棒性和穩(wěn)定性高，也可以對(duì)待測(cè)DNA雜交進(jìn)行實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記高靈敏探測(cè)。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種基于光纖微腔回音壁的DNA雜交微流控探測(cè)器，至少包括一個(gè)光纖近場(chǎng)耦合結(jié)構(gòu)，一個(gè)空芯石英光纖，單模光纖。所述的光纖近場(chǎng)耦合結(jié)構(gòu)是由微光纖輔助的“U”型微腔結(jié)構(gòu)構(gòu)成，包括一段百微米長(zhǎng)度的拉錐微光纖，拉錐微光纖兩端分別與普通單模光纖錯(cuò)位熔接，錯(cuò)位量為拉錐單模光纖的半徑，從而形成“U”型空氣微腔。所述拉錐微光纖無(wú)需很細(xì)，直徑在30～62.5μm之間，可保證有較強(qiáng)的魯棒性和倏逝場(chǎng)強(qiáng)度?！癠”型空氣微腔兩端分別通過(guò)單模光纖與穩(wěn)定的窄帶激光光源和高分辨率光譜儀相連。由于在熔接點(diǎn)引入較大錯(cuò)位，由單模光纖入射的光在錯(cuò)位點(diǎn)分為兩個(gè)部分，一部分進(jìn)入拉錐微光纖的包層中傳輸，一部分通過(guò)空氣腔進(jìn)行傳輸，在拉錐微光纖的表面，部分光能量泄露出來(lái)形成倏逝場(chǎng)?？招臼⒐饫w垂直置于拉錐微光纖表面(“U”型微腔的長(zhǎng)度必須大于空芯石英光纖的外徑)，且其內(nèi)壁表面上利用離子吸附作用修飾多聚賴(lài)氨酸分子(PLL)和單鏈DNA(ssDNA)探針?lè)肿?，滿(mǎn)足匹配條件的倏逝場(chǎng)即會(huì)耦合進(jìn)入空芯光纖的石英壁內(nèi)激發(fā)回音壁模式，通過(guò)靶ssDNA分子與固定在空心石英光纖內(nèi)壁表面的ssDNA探針?lè)肿娱g的雜交引起所述空芯石英光纖內(nèi)折射率變化而起作用。空芯石英光纖作為微流通道，其兩端通過(guò)微流管分別與蠕動(dòng)注射泵和廢液杯相連，便于生物分子偶聯(lián)劑、DNA探針及多組待測(cè)DNA樣本等試劑的注入和更換，保證DNA檢測(cè)的連續(xù)性和實(shí)時(shí)性，并可避免人工操作中的污染。

本發(fā)明的具體原理是：所述空芯石英光纖經(jīng)HF酸腐蝕至石英壁厚小于5μm。利用石英光纖表面本身和ssDNA帶有負(fù)電荷的特性，選用帶有氨基的PLL作為連接光纖與ssDNA探針的偶聯(lián)劑，實(shí)現(xiàn)ssDNA探針?lè)肿釉诳招臼⒐饫w內(nèi)壁的固定。當(dāng)空芯石英光纖內(nèi)注入與ssDNA探針相互匹配的靶ssDNA樣本后，靶ssDNA分子即會(huì)被固定于石英管內(nèi)壁的ssDNA探針捕獲，并發(fā)生雜交。由蠕動(dòng)注射泵向石英管內(nèi)注入偶聯(lián)劑、ssDNA探針和靶ssDNA樣本的過(guò)程中，大量分子聚集于石英管壁內(nèi)表面。石英管壁內(nèi)存在穩(wěn)定的行波傳輸，即回音壁模式，且有部分能量以倏逝場(chǎng)的形式存在于空芯石英光纖壁內(nèi)表面，這部分能量以指數(shù)衰減的形式分布在空芯石英光纖壁表面幾百納米到一微米的范圍內(nèi)?？招臼⒐饫w內(nèi)壁進(jìn)行PLL分子修飾和ssDNA探針固定以及DNA雜交反應(yīng)時(shí)，石英光纖內(nèi)壁表面的介質(zhì)折射率改變，就會(huì)引起回音壁共振模式的頻率漂移，因回音壁模式體積很小，且具有很高的品質(zhì)因子，其譜線線寬非常窄，譜線很微小的漂移或分裂也很容易被檢測(cè)到。因此，通過(guò)解調(diào)回音壁諧振光譜的波長(zhǎng)漂移或模式劈裂響應(yīng)可實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA分子的雜交及識(shí)別探測(cè)。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1)可精確控制近場(chǎng)耦合光纖微腔長(zhǎng)度實(shí)現(xiàn)幾十～幾百微米不等微型尺寸，大大縮短拉錐微纖的長(zhǎng)度，增強(qiáng)倏逝場(chǎng)強(qiáng)度，提高結(jié)構(gòu)的魯棒性。

2)回音壁模式的高品質(zhì)因子和小模式體積，提高DNA檢測(cè)的準(zhǔn)確性、靈敏度和精細(xì)度，為單個(gè)DNA分子的識(shí)別提供技術(shù)基礎(chǔ)。

3)以空芯光纖作為封閉式微流管，縮小微流通道尺寸，減少生物樣本的消耗量。

4)微流系統(tǒng)的集成極大地提高了檢測(cè)的連續(xù)性和實(shí)效性，自動(dòng)化流程避免人工操作中的樣本污染。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明所述DNA雜交微流控探測(cè)器的整體結(jié)構(gòu)裝置示意圖。

圖2為圖1中虛線橢圓處局部放大圖。

圖3是本發(fā)明所述空芯石英光纖微流通道內(nèi)DNA檢測(cè)示意圖。

圖中：1光源(窄帶激光光源)，2高分辨率光譜儀，3蠕動(dòng)注射泵，4廢液杯，5單模光纖，6微流管，7拉錐微光纖，8空芯石英光纖，9多聚賴(lài)氨酸(PLL)單分子層，10ssDNA探針，11ssDNA探針與靶ssDNA雜交的雙螺旋DNA(dsDNA)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1

如圖1所示，本發(fā)明所述的基于光纖微腔回音壁的DNA雜交微流控探測(cè)器，包括：5單模光纖，7拉錐微光纖和8空芯石英光纖，其中拉錐微光纖7的兩端與單模光纖5錯(cuò)位熔接呈“U”型空氣腔結(jié)構(gòu)——即“U”型空氣微腔，整體空氣“U”型微腔結(jié)構(gòu)的兩端分別通過(guò)單模光纖5與穩(wěn)定的窄帶激光光源1和高分辨率光譜儀2相連?？招臼⒐饫w8與拉錐微光纖7垂直放置在“U”型空氣微腔內(nèi)，空芯石英光纖兩端分別通過(guò)微流管6與蠕動(dòng)注射泵3和廢液杯4相連。

空芯光纖微流通道內(nèi)DNA雜交檢測(cè)示意圖，如圖2所示，空芯石英光纖內(nèi)表面修飾PLL單分子層9，在離子吸附作用下ssDNA探針?lè)肿?0與PLL結(jié)合，實(shí)現(xiàn)ssDNA探針?lè)肿釉诳招臼⒐饫w內(nèi)表面的固定，這樣對(duì)特定序列靶ssDNA分子敏感的探測(cè)器即制作完成，當(dāng)有靶ssDNA分子存在的時(shí)，由于DNA堿基序列的特異識(shí)別機(jī)制，靶ssDNA分子被吸附到空芯石英光纖內(nèi)壁表面，并與ssDNA探針?lè)肿与s交形成dsDNA 11。

在目標(biāo)靶ssDNA分子存在時(shí)即會(huì)在空芯石英光纖內(nèi)表面形成富集作用，并與固定在石英光纖內(nèi)表面的探針ssDNA分子雜交。所述DNA雜交探頭制作步驟中的試劑注入及更換都是通過(guò)微流系統(tǒng)連續(xù)注入。實(shí)時(shí)掃描回音壁透射光譜，即可對(duì)空芯石英光纖內(nèi)表面修飾過(guò)程和DNA分子雜交過(guò)程進(jìn)行動(dòng)態(tài)解調(diào)。

本發(fā)明所述的基于光纖微腔回音壁的DNA雜交微流控探測(cè)器的制作過(guò)程如下：

1)光纖近場(chǎng)耦合結(jié)構(gòu)的制備

(a)氫氧火焰掃描拉錐系統(tǒng)對(duì)單模光纖進(jìn)行拉錐，拉制直徑緩變的絕熱錐。

(b)固定光纖切割刀及加持臺(tái)，選取拉錐光纖直徑范圍在30～62.5μm的均勻部分切斷。

(c)將微光纖斷面與普通未拉錐單模光纖熔接，并采用錯(cuò)位手法，使微光纖的包層邊緣對(duì)準(zhǔn)單模光纖的中心線。

(d)微調(diào)光纖加持臺(tái)，使熔接點(diǎn)平移一定位移(大于空芯光纖直徑)，在固定的光纖切割刀位置截?cái)嗬F微光纖。

(e)將帶有一段微光纖的單模光纖與另一單模光纖熔接，保持相同方向且相同大小的錯(cuò)位量。利用以上所述步驟，兩端同方向同量級(jí)的錯(cuò)位熔接形成“U”型空氣腔，光纖微腔即制作完成。

2)對(duì)DNA敏感的回音壁模式諧振腔的制備

(a)選用內(nèi)徑90μm的空芯石英光纖，將其浸泡在氫氟酸：水：氟化銨為2:2:1的混合溶液中，腐蝕至石英管壁厚小于5μm。

(b)由微流泵注入0.01mg/mL的PLL/PBS(磷酸緩沖液)，充分反應(yīng)，并用PBS沖洗。在石英管內(nèi)壁表面修飾上PLL單分子層。

(c)注入ssDNA探針樣本溶液，充分反應(yīng)，并用TE緩沖液沖洗。完成ssDNA探針在石英管內(nèi)壁表面上的固定。

3)DNA雜交的探測(cè)

選用C波段窄帶激光器作為光源，分辨率為3pm的安捷倫光譜儀作為高分辨率光譜儀，空芯石英光纖外徑90μm，內(nèi)徑80μm。針對(duì)不同濃度的與ssDNA探針匹配的靶ssDNA樣本和不匹配ssDNA樣本分別對(duì)本發(fā)明的探測(cè)靈敏度，探測(cè)極限，特異性進(jìn)行測(cè)試。將在回音壁透射諧振光譜中的波長(zhǎng)位置1552.477nm處，激起的第121階高階模作為解調(diào)對(duì)象，其對(duì)靶ssDNA樣本的探測(cè)靈敏度高達(dá)1255.08nm/RIU，比傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)高出一個(gè)數(shù)量級(jí)；樣本濃度的探測(cè)極限為0.1nM；對(duì)應(yīng)樣本分析折射率分辨率可達(dá)2.39ⅹ10-⁶RIU；并且對(duì)不匹配ssDNA樣本不具有吸附作用，顯示出良好的DNA特異識(shí)別功能。