本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗腫瘤活性的吳茱萸堿銅鹽化合物及其合成方法。

背景技術(shù)：

本發(fā)明配體選擇來源于中藥吳茱萸生物堿有效成分吳茱萸堿(Evodiamine)，吳茱萸堿屬于吲哚喹唑啉生物堿的經(jīng)典母核結(jié)構(gòu)，這樣的功能結(jié)構(gòu)與金屬離子容易螯合生成配合物或以生物堿鹽形式存在，絡(luò)合金屬離子后有望發(fā)揮中藥有效成分與金屬離子的雙效協(xié)同作用。

自從順鉑抗腫瘤金屬藥物在臨床上的成功使用，與其相關(guān)的鉑等過渡金屬配合物抗癌試劑的研究也越來越引起廣泛關(guān)注。銅，作為生物學(xué)必需的微量元素，對衰老和癌癥及其相關(guān)聯(lián)的內(nèi)源性氧化劑所致DNA損傷起著關(guān)鍵作用，銅的毒性比非必須微量元素如鉑的毒性要小，因此銅金屬配合物或銅離子鹽化合物有望具有類似于順鉑藥物的抗腫瘤活性而具有低毒性的特點(diǎn)。

目前，已有一些吳茱萸堿衍生物被開發(fā)出來用作抗腫瘤藥物的研究。但以往研究都停留在有機(jī)小分子階段，而吳茱萸堿的金屬鹽或配合物尚未有人研究。因此，仍然需要更好的供選方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種具有抗腫瘤活性的吳茱萸堿銅鹽化合物。

本發(fā)明提供的一種具有抗腫瘤活性的吳茱萸堿銅鹽化合物，其結(jié)構(gòu)式如下所示，

一種具有抗腫瘤活性的吳茱萸堿銅鹽化合物的合成方法為：將吳茱萸堿與CuCl₂·2H₂O按物質(zhì)的量1:0.5～1.5的配比加入溶劑，并放入密閉反應(yīng)容器中，加熱反應(yīng)至完全，將反應(yīng)容器取出靜置冷卻至室溫，并從容器中取出晶體，進(jìn)行洗滌、干燥即得到吳茱萸銅鹽化合物。

需要說明的是所述溶劑為丙酮，所述的丙酮的添加量為每克吳茱萸堿和CuCl₂·2H₂O的混合物加入10～100mL。

需要說明的是，所述的反應(yīng)容器為長度為15～20cm的Pyrex厚壁玻璃管；大量合成時，則改用聚四氟乙烯反應(yīng)釜。

需要說明的是，所述的加熱容器為烘箱，反應(yīng)溫度控制在90～110℃，反應(yīng)時間為4～8天。

需要說明的是，所述的洗滌采用的是石油醚、氯仿先后進(jìn)行洗滌。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明以吳茱萸堿為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在溶劑熱條件下，通過與CuCl₂·2H₂O發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)得到吳茱萸堿銅鹽化合物，合成方法簡單、反應(yīng)條件易于控制，且反應(yīng)原料價(jià)廉易得。

吳茱萸堿銅鹽化合物對卵巢癌細(xì)胞株Skov3具有明顯的抑制作用，IC50值為8.02μM，顯示出良好的潛在藥用價(jià)值，有望作為金屬抗腫瘤藥物。

附圖說明

圖1為本發(fā)明產(chǎn)物的紅外光譜譜圖

圖2為本發(fā)明產(chǎn)物的X射線單晶衍射結(jié)構(gòu)圖

具體實(shí)施方案

下面結(jié)合具體病例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何在權(quán)利范圍的內(nèi)所作出的沒有實(shí)質(zhì)的改變，仍在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

稱量吳茱萸堿(0.010g，0.03mmol)，CuCl₂·2H₂O(0.008g，0.04mmol)加入到一端封閉的15cm Pyrex厚壁玻璃管中，滴加1.8mL丙酮，在高溫條件下將開口端熔封，混合物混合均勻后放到100℃的烘箱中，反應(yīng)4天后玻璃管內(nèi)有黃色棒狀晶體生成。將玻璃管取出靜置室溫冷卻，把晶體從玻璃管中取出，用石油醚、氯仿洗滌，干燥得到吳茱萸堿銅鹽化合物，產(chǎn)率為85.4％。

產(chǎn)品檢測：對上述得到的棕色固體產(chǎn)物分別進(jìn)行紅外光譜、X-射線單晶衍射分析，如圖1～2所示。

具體的波譜特征如下：

IR光譜:3444,1704,1549,1499,1335,1103,813,759cm^-1。

1704為C＝O的特征吸收峰，1549cm^-1為C＝N的特征吸收峰，,1335cm^-1為C-N的特征吸收峰。

X-射線單晶衍射結(jié)構(gòu)：X-射線單晶衍射是最有效、最精確的結(jié)構(gòu)表征手段，X射線準(zhǔn)確測定了吳茱萸堿銅鹽化合物結(jié)晶樣品中各原子的連接方式和空間位置。結(jié)構(gòu)表明，中心離子銅離子與氯離子結(jié)合形成[Cu₄Cl₆]²⁺離子簇，兩個吳茱萸堿的N-H的氮原子與氫離子結(jié)合發(fā)生質(zhì)子化，形成離子型的吳茱萸堿銅鹽。

確定上述黃色晶體產(chǎn)物為吳茱萸堿銅鹽化合物，其分子式為C₃₈H₃₂Cl₆Cu₄N₆O₂，分子量為1065.7g/mol，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明產(chǎn)品在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用試驗(yàn)：

采用吳茱萸堿銅鹽對卵巢癌Skov3腫瘤細(xì)胞株的體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)。

1、細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)選用卵巢癌Skov3腫瘤細(xì)胞株。

細(xì)胞株培養(yǎng)在含10wt％小牛血、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的RPMI～1640或DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，置37℃含體積濃度5％CO2孵箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，0.25％胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2、待測化合物的配制

所用的吳茱萸堿銅鹽化合物為本發(fā)明實(shí)施例1制得的產(chǎn)物，其純度≥95％，通過RMPI1640培養(yǎng)基依次稀釋成五個濃度梯度，分別為40、20、10、5、2.5μmol/L，測試20μmol/L濃度下吳茱萸堿銅鹽化合物對不同腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率。

3、細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)(MTT法)

(1)取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培養(yǎng)液配制成濃度為5000個/mL的細(xì)胞懸液，以每孔190μL接種于96孔培養(yǎng)板中，使待測細(xì)胞密度至1000～10000個/孔(邊緣孔用無菌PBS填充)；

(2)5％CO2，37℃孵育24h，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，每孔加入一定濃度梯度的藥物10μL，每個濃度梯度設(shè)4個復(fù)孔；

(3)5％CO2，37℃孵育48小時，倒置顯微鏡下觀察；

(4)每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL PBS，即0.5％MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h；

(5)終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO充分溶解甲瓚沉淀，振蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀用波長為570nm，參比波長為450nm測定各孔的光密度值；

(6)同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、DMSO)，對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、DMSO)。

(7)根據(jù)測得的光密度值(OD值)，來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)。利用公式：

計(jì)算化合物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率。

結(jié)果表明，吳茱萸堿銅鹽化合物對卵巢癌Skov3腫瘤細(xì)胞株，具有明顯的抑制作用，IC50值為8.02μM，表現(xiàn)了良好的潛在藥用價(jià)值。另一方面，金屬銅元素是人體必需的微量元素，吳茱萸堿來源于天然生物堿，原料天然、易于合成，具有深入研究開發(fā)的價(jià)值。

實(shí)施例2

稱量吳茱萸堿(1g，3mmol)，CuCl₂·2H₂O(0.8g，4mmol)，將吳茱萸堿、銅鹽放入25mL的聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，滴加丙酮20mL，在高溫條件下將開口端熔封，混合物混合均勻后放到90℃的烘箱中，反應(yīng)4天后玻璃管內(nèi)有棕色塊狀晶體生成。將玻璃管取出靜置室溫冷卻，把晶體從玻璃管中取出，用石油醚、氯仿洗滌，干燥得到吳茱萸堿銅鹽，產(chǎn)率為81.2％。

產(chǎn)品檢測方法同實(shí)施例1。

實(shí)施例3

稱量吳茱萸堿(10g，30mmol)，CuCl₂·2H₂O(8g，40mmol)，將吳茱萸堿、銅鹽放入200mL的聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，滴加丙180mL，在高溫條件下將開口端熔封，混合物混合均勻后放到100℃的烘箱中，反應(yīng)5天后玻璃管內(nèi)有棕色塊狀晶體生成。將玻璃管取出靜置室溫冷卻，把晶體從玻璃管中取出，用石油醚、氯仿洗滌，干燥得到吳茱萸堿銅鹽，產(chǎn)率為82.6％。

產(chǎn)品檢測方法同實(shí)施例1。

實(shí)施例4

稱量吳茱萸堿(20g，60mmol)，CuCl₂·2H₂O(8g，40mmol)，將吳茱萸堿、銅鹽放入2000mL的聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，滴加丙酮1800mL，在高溫條件下將開口端熔封，混合物混合均勻后放到100℃的烘箱中，反應(yīng)4天后玻璃管內(nèi)有棕色塊狀晶體生成。將玻璃管取出靜置室溫冷卻，把晶體從玻璃管中取出，用石油醚、氯仿洗滌，干燥得到吳茱萸堿銅鹽，產(chǎn)率為80.8％。

產(chǎn)品檢測方法同實(shí)施例1。

實(shí)施例5

稱量吳茱萸堿(1g，3mmol)，CuCl₂·2H₂O(0.4g，2mmol)，將吳茱萸堿、銅鹽放入50mL的聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，滴加丙酮40mL，混合物混合均勻后放到110℃的烘箱中，反應(yīng)8天后玻璃管內(nèi)有棕色塊狀晶體生成。將玻璃管取出靜置室溫冷卻，把晶體從玻璃管中取出，用石油醚、氯仿洗滌，干燥得到吳茱萸堿銅鹽，產(chǎn)率為76.3％。

產(chǎn)品檢測方法同實(shí)施例1。

以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。