本發(fā)明涉及酶工業(yè)領(lǐng)域以及免疫檢測領(lǐng)域，具體地說涉及凝血酶溶液的穩(wěn)定劑、凝血酶溶液以及相關(guān)的檢測試劑、制備穩(wěn)定的凝血酶溶液的方法以及凝血酶溶液的穩(wěn)定劑的用途。
背景技術(shù)：
纖維蛋白原(Fibrinogen，F(xiàn)IB)是作為血凝塊的主要蛋白質(zhì)的纖維蛋白的前體物質(zhì)，由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。生物體中的纖維蛋白原的約80％分布于血漿中(正常成年人中約為200～400mg/dL)，其余分布于組織中。纖維蛋白原是含有經(jīng)二硫鍵結(jié)合的3對多肽(Aα，Bβ和γ)鏈的糖蛋白質(zhì)，Aα，Bβ鏈通過凝血酶被分解而形成纖維蛋白，從而起到血栓生成、止血血栓的主要作用。在臨床上，在炎癥中增加，在高度的肝功能障礙、DIC等中減少。
纖維蛋白原測定的臨床意義包括但不限于：1.病理性增高：(1)血栓前狀態(tài)和血栓性疾病時(shí)，機(jī)體凝血功能增強(qiáng)，血漿纖維蛋白原增多，如急性心肌梗塞、糖尿病、妊娠高血壓癥、動脈粥樣硬化、惡性腫瘤等。(2)蛋白合成增多，如結(jié)締組織病、多發(fā)性骨髓瘤等。(3)反應(yīng)性增多，如急性感染、急性腎炎、燒傷、休克、大手術(shù)后等。2.病理性降低：(1)消耗過多，導(dǎo)致血漿含量減少，如DIC等。(2)纖溶系統(tǒng)活性增強(qiáng)，F(xiàn)IB被分解，如原發(fā)性纖溶亢進(jìn)癥等。(3)合成減少，如重癥肝炎、肝硬化等。
纖維蛋白原的測定法包括凝血酶添加法(Clauss法)、凝固時(shí)間法(PT演算法)、免疫比濁法(TIA)、乳膠法等，一般采用凝血酶添加法。
在凝血酶添加法下，纖維蛋白原的含量根據(jù)纖維蛋白原與凝血酶作用最終形成纖維蛋白的原理測定，以國際標(biāo)準(zhǔn)品為參比血漿制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用凝血酶來測定血漿凝固時(shí)間，即凝血酶時(shí)間(Thrombin Time，TT)，所得血漿凝固時(shí)間與血漿中纖維蛋白原濃度呈負(fù)相關(guān)，從而得到纖維蛋白原的含量。
具體而言，凝血酶時(shí)間是指在血漿中加入標(biāo)準(zhǔn)化的凝血酶原后血漿凝固的時(shí)間。在凝血酶作用下，待檢血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白。當(dāng)待檢查的血漿中抗凝物質(zhì)增多時(shí)，凝血酶時(shí)間延長。當(dāng)待檢查的血漿呈酸性、測試對象患有異常纖維蛋白血癥等情況下，凝血酶時(shí)間縮短。
例如，凝血酶時(shí)間延長見于血漿纖維蛋白原減低或結(jié)構(gòu)異常；臨床應(yīng)用肝素，或在肝病、腎病及系統(tǒng)性紅斑狼瘡時(shí)的肝素樣抗凝物質(zhì)增多；纖溶蛋白溶解系統(tǒng)功能亢進(jìn)。
在纖維蛋白原測定時(shí)使用的凝血酶，從作為其前體的凝血酶原中切下肽而形成具有凝固活性的α-凝血酶。已知這種α-凝血酶會自分解成低分子量的不具有凝固活性的β-凝血酶，進(jìn)而分解成γ-凝血酶，長期保存時(shí)，通常進(jìn)行冷凍干燥。
對于測定纖維蛋白原(FIB)含量或凝血酶時(shí)間(TT)的試劑而言，現(xiàn)有的試劑均為凍干試劑，除了價(jià)格昂貴，在使用過程中，均需要復(fù)溶，使用不方便，而且必然會帶來復(fù)溶過程中造成體積誤差，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差。而液體試劑不存在這一問題，并且使用方便，即開即用，批間差更小，結(jié)果更準(zhǔn)確。因此迫切地需要開發(fā)出能夠穩(wěn)定凝血酶溶液的穩(wěn)定劑以及穩(wěn)定的凝血酶溶液制品。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對凝血酶溶液不便于保存的缺陷，改善凝血酶溶液的穩(wěn)定性，從而延長保存時(shí)間，降低保存成本，方便使用，減少實(shí)驗(yàn)誤差。
本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)葡萄糖酸根離子與谷氨酸根離子具有穩(wěn)定凝血酶溶液的協(xié)同效應(yīng)。
本發(fā)明提供了用于凝血酶溶液的穩(wěn)定劑，其包含水溶性葡萄糖酸化合物與水溶性谷氨酸化合物。在一種實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定劑由水溶性葡萄糖酸化合物與水溶性谷氨酸化合物組成。在另一種實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定劑包含水溶性葡萄糖酸化合物、水溶性谷氨酸化合物以及溶劑。在此外的另一種實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定劑包含水溶性葡萄糖酸化合物、水溶性谷氨酸化合物、溶劑以及本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠常規(guī)使用的輔助成分(例如緩沖劑、表面活性劑、防腐劑等)。所述溶劑可以是水、有機(jī)溶劑或者本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠常規(guī)確定或使用的溶劑中的一種或兩種以上的組合。優(yōu)選地，所述溶劑是水。
優(yōu)選地，本發(fā)明的用于凝血酶溶液的穩(wěn)定劑中，水溶性葡萄糖酸化合物與水溶性谷氨酸化合物的比例是1:50至50:1。優(yōu)選地，所述比例的上限可以是40:1、30:1、20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1，所述比例的下限可以是1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2，所述比例可以是上述上限值和下限值任意組合的范圍。更優(yōu)選地，所述比例可以是1:1。
優(yōu)選地，所述水溶性葡萄糖酸化合物可以是水溶性葡萄糖酸鹽。所述水溶性葡萄糖酸鹽可以是葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鋅或葡萄糖酸鎂中的一種或兩種以上的組合。優(yōu)選地，所述水溶性葡萄糖酸鹽是葡萄糖酸鈣或葡萄糖酸鋅。
本發(fā)明所使用的水溶性葡萄糖酸化合物是可商購的，例如來自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(上海晶純生化科技股份有限公司)的商標(biāo)為阿拉丁(Aladdin)的葡萄糖酸鈣(例如，貨號C110858)、來自百靈威科技有限公司的葡萄糖酸鋅等。
優(yōu)選地，所述水溶性谷氨酸化合物可以是水溶性谷氨酸鹽。更優(yōu)選地，所述水溶性谷氨酸鹽是谷氨酸鈉、谷氨酸鉀或其組合。最優(yōu)選地，所述水溶性谷氨酸鹽是谷氨酸鈉。
本發(fā)明所使用的水溶性谷氨酸化合物是可商購的，例如來自上海天宇生物試劑有限公司的谷氨酸鈉、來自上海源葉生物科技有限公司的商標(biāo)為源葉的谷氨酸鉀(例如，貨號S20427)等。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的穩(wěn)定劑的凝血酶溶液。
本發(fā)明的穩(wěn)定劑所適用的凝血酶溶液(簡稱“本發(fā)明的凝血酶溶液”)是使凝血酶懸浮或溶解于水和/或有機(jī)溶劑中而成的水溶液、有機(jī)溶劑溶液或者水和有機(jī)溶劑的混合溶液，優(yōu)選為水溶液或者水和有機(jī)溶劑混合溶液。所述有機(jī)溶劑，只要不會造成凝血酶的分解和活性抑制等，且對其最終用途沒有影響，就沒有特別限定，例如二甲基亞砜、甘油、聚乙二醇、聚丙二醇等。還可以將這些物質(zhì)中的一種或兩種以上組合使用。
優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，水溶性葡萄糖酸化合物的濃度是1g/L至50g/L；更優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，水溶性葡萄糖酸化合物的濃度是2g/L至40g/L；更優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，水溶性葡萄糖酸化合物的濃度是3g/L至30g/L；更優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，水溶性葡萄糖酸化合物的濃度是3g/L至25g/L；更優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，水溶性葡萄糖酸化合物的濃度是2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L。進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，水溶性葡萄糖酸化合物的濃度是7.7g/L。
優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，水溶性谷氨酸化合物的濃度是1g/L至150g/L；更優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，水溶性谷氨酸化合物的濃度是10g/L至100g/L；更優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，水溶性谷氨酸化合物的濃度是10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L或100g/L；進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，水溶性谷氨酸化合物的濃度是50g/L。
本發(fā)明的凝血酶溶液還可以包含緩沖劑、表面活性劑和防腐劑。
優(yōu)選地，所述緩沖劑可以是4-羥乙基哌嗪乙磺酸(N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸；分子式:C8H18N2O4S，亦稱HEPES酸)、檸檬酸、磷酸、乙酸、咪唑、3-(N-嗎啡啉)丙磺(MOPS)、二(2-羥乙基)亞胺基三(羥甲基)甲烷(BIS-TRIS)、三羥甲基氨基甲烷(TRIS)、3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸(MOPSO)、N-(2-乙酰氨基)-亞氨基二醋酸(ADA)或2-嗎啉乙磺酸(MES)中的一種或兩種以上的組合；更優(yōu)選地，緩沖劑是4-羥乙基哌嗪乙磺酸。
本發(fā)明所使用的緩沖劑是可商購的，例如來自蘇州市貝克生物科技有限公司的4-羥乙基哌嗪乙磺酸、來自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司的3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸(例如，產(chǎn)品編碼H0671)、來自薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司的商標(biāo)為安耐吉的2-嗎啉乙磺酸(例如，商品編號D090002)。
所述緩沖劑的添加量只要是具有緩沖能力的量就沒有特別的限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)確定適合使用的緩沖劑的含量。但是，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，當(dāng)緩沖劑的濃度是以下數(shù)值范圍時(shí)，更有利于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的：優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，緩沖劑的濃度是1g/L至50g/L；更優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，緩沖劑的濃度是5g/L至24g/L；更優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，緩沖劑的濃度是5.9g/L至23.8g/L；更優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，緩沖劑的濃度是5.9g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、11.9g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、17.9g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L或23.8g/L；更進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，緩沖劑的濃度是11.9g/L。
所述表面活性劑可以是陰離子性表面活性劑、陽離子性表面活性劑、兩性離子表面活性劑或非離子性表面活性劑中的一種或兩種以上的組合。
所述陰離子性表面活性劑可以是十二烷基硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉、十二烷基-N-肌氨酸鈉、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉或?；敲撗跄懰徕c中的一種或兩種以上的組合。
所述陽離子性表面活性劑可以是十六烷基三甲基溴化銨、四癸基溴化銨或十二烷基吡啶鎓氯化物中的一種或兩種以上的組合。
所述兩性離子表面活性劑可以是3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸鹽、3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基銨]-2-羥基-1-丙磺酸鹽、棕櫚酰溶血卵磷脂、十二烷基-N-甜菜堿或十二烷基-β-丙氨酸中的一種或兩種以上的組合。
所述非離子性表面活性劑可以是辛基葡糖苷、庚基硫代葡糖苷、癸酰基-N-甲基葡糖胺、聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯七甲基己基醚、聚氧乙烯異辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯或聚環(huán)氧乙烷山梨糖醇酯中的一種或兩種以上的組合。
優(yōu)選地，所述表面活性劑是非離子性表面活性劑；更優(yōu)選地，所述表面活性劑是聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯(亦稱吐溫80)。
本發(fā)明所使用的表面活性劑是可商購的，例如來自成都科龍化工試劑廠的吐溫80、來自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(上海晶純生化科技股份有限公司)的商標(biāo)為阿拉丁(Aladdin)的吐溫80(例如，貨號T104866)、上海源葉生物科技有限公司的商標(biāo)為源葉的蔗糖脂肪酸酯(例如，貨號S30894)等。
所述表面活性劑的添加量只要是使凝血酶溶液的穩(wěn)定性提高的量即可，沒有特別限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)確定適合使用的表面活性劑的含量。但是，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，當(dāng)表面活性劑的濃度是以下數(shù)值范圍時(shí)，更有利于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的：優(yōu)選地，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，表面活性劑的濃度是10μl/L至1000μl/L；更優(yōu)選地，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，表面活性劑的濃度是50μl/L至500μl/L；更優(yōu)選地，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，表面活性劑的濃度是100μl/L至400μl/L；進(jìn)一步優(yōu)選地，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，表面活性劑的濃度是100μl/L、200μl/L、300μl/L或400μl/L；更進(jìn)一步優(yōu)選地，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，表面活性劑的濃度是200μl/L。
所述防腐劑可以是疊氮鈉(NaN3)、環(huán)丙沙星、丙酸或苯甲酸鈉中的一種或兩種以上的組合。優(yōu)選地，所述防腐劑是疊氮鈉。
本發(fā)明所使用的防腐劑是可商購的，例如來自西寶生物科技(上海)股份有限公司的商標(biāo)為Amresco的疊氮鈉(例如，貨號為0639)、來自成都化夏化學(xué)試劑有限公司疊氮鈉(例如，貨號為H1100046)、上海阿拉丁生化科技股份有限公司(上海晶純生化科技股份有限公司)的商標(biāo)為阿拉丁(Aladdin)的苯甲酸鈉(例如，貨號為S104128)、來自西格瑪奧德里奇有限責(zé)任公司(Sigma-Aldrich LLC)的商標(biāo)為Proclin300的防腐劑(例如，產(chǎn)品編號為48914-U)等。
所述防腐劑的添加量只要在規(guī)定范圍內(nèi)就沒有特別的限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)確定適合使用的防腐劑的含量。但是，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，當(dāng)防腐劑的濃度是以下數(shù)值范圍時(shí)，更有利于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的：優(yōu)選地，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，防腐劑的濃度是0.1g/L至5.0g/L；更優(yōu)選地，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，防腐劑的濃度是0.2g/L至2.5g/L；更優(yōu)選地，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，防腐劑的濃度是0.4g/L至1.3g/L；進(jìn)一步優(yōu)選地，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，防腐劑的濃度是0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1.0g/L、1.1g/L、1.2g/L或1.3g/L；更進(jìn)一步優(yōu)選地，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，防腐劑的濃度是1.0g/L。
本發(fā)明中使用的凝血酶可以是人、豬、牛等動物來源的凝血酶、通過基因工程法制備的凝血酶或市售的藥品。本發(fā)明所使用的凝血酶是可商購的，例如是來自湖南一格制藥有限公司的凝血酶凍干粉、來自西格瑪奧德里奇有限責(zé)任公司(Sigma-Aldrich LLC)的凝血酶制劑(例如，產(chǎn)品編號為10602400001)等。
本發(fā)明的凝血酶溶液中的凝血酶的添加量只要適合本發(fā)明的目的就沒有特別的限定。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，凝血酶的濃度可以是1KU/L至120KU/L；更優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，凝血酶的濃度可以是1KU/L、2KU/L、3KU/L、4KU/L、5KU/L、6KU/L、7KU/L、8KU/L、9KU/L、10KU/L、20KU/L、30KU/L、40KU/L、50KU/L、60KU/L、70KU/L、80KU/L、90KU/L、100KU/L、110KU/L或120KU/L；更優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，凝血酶的濃度可以是2KU/L至110KU/L、5KU/L至100KU/L、10KU/L至90KU/L、15KU/L至80KU/L、20KU/L至70KU/L、25KU/L至60KU/L、30KU/L至50KU/L；進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液中，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，凝血酶的濃度可以是2KU/L、4KU/L、30KU/L、70KU/L、120KU/L。
優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，包含濃度是7.7g/L的葡萄糖酸鈣、濃度是50g/L的谷氨酸鈉、濃度是11.9g/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸、濃度是1.0g/L的疊氮鈉、濃度是200μl/L的聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯。更優(yōu)選地，上述凝血酶溶液中，包含濃度是2KU/L、4KU/L、30KU/L或70KU/L的凝血酶。
優(yōu)選地，本發(fā)明的凝血酶溶液，以凝血酶溶液的總體積計(jì)算，包含濃度是7.7g/L的葡萄糖酸鋅、濃度是50g/L的谷氨酸鈉、濃度是11.9g/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸、濃度是1.0g/L的疊氮鈉、濃度是200μl/L的聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯。更優(yōu)選地，上述凝血酶溶液中，包含濃度是2KU/L、4KU/L、30KU/L或70KU/L的凝血酶。
本發(fā)明還提供了制備凝血酶溶液的方法，所述方法包括使用本發(fā)明的穩(wěn)定劑的步驟。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的穩(wěn)定劑用于提高凝血酶溶液穩(wěn)定性的用途。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的穩(wěn)定劑或本發(fā)明的凝血酶溶液用于制備試劑的用途。
本發(fā)明還提供了一種試劑，其含有本發(fā)明的穩(wěn)定劑或本發(fā)明的凝血酶溶液。
利用本發(fā)明的穩(wěn)定劑或本發(fā)明的凝血酶溶液制備的試劑或者含有本發(fā)明的穩(wěn)定劑或本發(fā)明的凝血酶溶液的試劑可以被稱為本發(fā)明的試劑。
優(yōu)選地，所述試劑是用于檢測纖維蛋白原或凝血酶時(shí)間的試劑。
優(yōu)選地，對于本發(fā)明的用于檢測纖維蛋白原的試劑，凝血酶溶液中的凝血酶的含量為30KU/L或70KU/L；對于本發(fā)明的用于檢測凝血酶時(shí)間的試劑，凝血酶溶液中的凝血酶的含量為2KU/L或4KU/L。
本發(fā)明還提供了一種試劑盒，其包含本發(fā)明的試劑。
本發(fā)明人注意到，在凝血酶溶液其他組分不變的情況下，不同的凝血酶濃度下，含有本發(fā)明的凝血酶溶液的試劑的測值會整體提高，但是這對本發(fā)明的凝血酶溶液以及相關(guān)產(chǎn)品本身的穩(wěn)定性以及相關(guān)的用途、方法的實(shí)施并沒有影響，測值的提高也不會妨礙本發(fā)明的凝血酶溶液以及相關(guān)產(chǎn)品的功能的實(shí)現(xiàn)。為了獲得理想范圍內(nèi)的測值，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)調(diào)整凝血酶的含量來實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)。
含有本發(fā)明的穩(wěn)定劑的凝血酶溶液方便使用，無需復(fù)溶，避免由于復(fù)溶體積差異導(dǎo)致誤差。即開即用，批間差更小，結(jié)果更準(zhǔn)確。
利用本發(fā)明的穩(wěn)定劑制備的凝血酶溶液穩(wěn)定性強(qiáng)，2-8℃穩(wěn)定一年以上，37℃穩(wěn)定20天以上，2-8℃開瓶穩(wěn)定性10天以上。由此，本發(fā)明的穩(wěn)定劑可以提高凝血酶溶液的穩(wěn)定性，改善相關(guān)產(chǎn)品的貯存形式和條件，降低生產(chǎn)和應(yīng)用的成本。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的以下實(shí)施例中使用的各組分來源分別為：來自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(上海晶純生化科技股份有限公司)的商標(biāo)為阿拉丁(Aladdin)的葡萄糖酸鈣(例如，貨號C110858)、來自百靈威科技有限公司的葡萄糖酸鋅、來自上海源葉生物科技有限公司的商標(biāo)為源葉的谷氨酸鉀(例如，貨號S20427)、上海天宇生物試劑有限公司的谷氨酸鈉、蘇州市貝克生物科技有限公司的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES酸)、成都科龍化工試劑廠的吐溫80、西寶生物科技(上海)股份有限公司的商標(biāo)為Amresco的疊氮鈉(貨號0639)、湖南一格制藥有限公司的凝血酶凍干粉。
實(shí)施例1
含有本發(fā)明的穩(wěn)定劑的凝血酶時(shí)間(TT)檢測試劑的制備
稱取HEPES酸11.9g，葡萄糖酸鈣7.7g，谷氨酸鈉50g，疊氮鈉1g，吐溫80 0.2g，加入蒸餾水中溶解，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.4，定容至1L。取凝血酶2只(2000U/支)，用以上配制緩沖液1mL/支溶解，取溶解凝血酶3.6mL(可調(diào)節(jié)酶量控制批間差)，加入1L緩沖液中搖勻，TT檢測試劑配制完成。
產(chǎn)品性能指標(biāo)
1.重復(fù)性：變異系數(shù)(CV)≤5％；用正常質(zhì)控血漿重復(fù)測試10次，計(jì)算測定的平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)。按照公式(1)計(jì)算變異系數(shù)(CV)。所得結(jié)果應(yīng)符合下述3.穩(wěn)定性的要求。
式中：
S中：標(biāo)準(zhǔn)差
——測定均值
2.批間差：變異系數(shù)(CV)≤10％；用正常質(zhì)控血漿分別測試3個(gè)不同批次的試劑，每個(gè)批次測定重復(fù)測試10次，計(jì)算30個(gè)測量值平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)，按照公式(1)計(jì)算變異系數(shù)(CV)。
3.穩(wěn)定性
本品2℃～8℃密閉保存，每次新開一瓶測定質(zhì)控血漿，與第一天對比，相對偏差在15％內(nèi)，有效期12個(gè)月。
實(shí)施例2
凝血酶時(shí)間(TT)檢測試劑的檢測方法
取血漿100μL，37℃預(yù)熱2分鐘，然后加入凝血酶試劑100μL，在CA550全自動凝血儀(廠家SYSMEX)按照廠家的說明書測定。
注意事項(xiàng)：
1.采血應(yīng)避免溶血，防止組織液混入。抽血時(shí)要順利，抗凝要充分，不可有凝血塊；分離血漿時(shí)務(wù)必去除血小板。
2.樣本收集時(shí)不宜用EDTA和肝素作抗凝劑。血液和抗凝劑的比例應(yīng)準(zhǔn)確，采血量偏差大于10％的標(biāo)本不宜使用。
3.如果血球壓積≤20％或≥55％，則需調(diào)整血樣與抗凝劑的比例，抗凝劑毫升數(shù)＝0.00185×血液毫升數(shù)×(100－壓積)。
4.使用經(jīng)校準(zhǔn)后的刻度吸管和加樣器。
5.使用清潔無污染的塑料或硅化的玻璃器皿。
6.實(shí)驗(yàn)溫度控制在37℃±1.0℃。
7.試劑與樣本量可根據(jù)需要按比例改變。
8.試劑使用完畢，應(yīng)擦干凈瓶口，盡快旋緊瓶蓋，及時(shí)放回要求的儲存條件下保存。
實(shí)施例3
含有本發(fā)明的穩(wěn)定劑的纖維蛋白原(FIB)檢測試劑的制備
(一)配制試劑：稱取HEPES酸11.9g，葡萄糖酸鈣7.7g，谷氨酸鈉50g，疊氮鈉1g，吐溫80 0.2g，加入蒸餾水中溶解，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.4，定容至1L。取凝血酶30只(3000U/支)，用以上配制緩沖液1mL/支溶解，全部加入1L緩沖液中搖勻，F(xiàn)IB檢測試劑配制完成。
(二)配制稀釋樣本緩沖液：稱取咪唑3.06g，氯化鈉5.22g，檸檬酸鈉1.2g，疊氮鈉0.95g，加入蒸餾水中溶解，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.30，定容至1L。穩(wěn)定兩天后，再次調(diào)節(jié)pH至7.30。
產(chǎn)品性能指標(biāo)
1.準(zhǔn)確度：取參考物質(zhì)或正確度質(zhì)控物測試，，重復(fù)三次，得平均值，按照公式(2)計(jì)算平均值與參考物質(zhì)或主校準(zhǔn)品的相對偏差，結(jié)果應(yīng)符合相對偏差應(yīng)在±15％范圍內(nèi)的要求。計(jì)算公式：
式中：
x――檢測均值；
xc――參考物質(zhì)或正確度質(zhì)控物標(biāo)示值。
2.重復(fù)性
用正常質(zhì)控血漿和異常質(zhì)控血漿分別重復(fù)測試10次，并計(jì)算測定的平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(S)。按公式(1)計(jì)算變異系數(shù)(CV)，結(jié)果應(yīng)符合變異系數(shù)(CV)≤8％的要求。
3.批間差
用正常質(zhì)控血漿測試3個(gè)不同批次的試劑，每個(gè)批次測試10次，計(jì)算30個(gè)測量值平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(S)，按照公式(1)計(jì)算變異系數(shù)(CV)，結(jié)果應(yīng)符合變異系數(shù)(CV)≤15％的要求。
4.穩(wěn)定性
本品2℃～8℃密閉保存，每次新開一瓶測定質(zhì)控血漿，相對偏差在15％內(nèi)，有效期12個(gè)月。
實(shí)施例4
纖維蛋白原(FIB)檢測試劑的檢測方法
(一)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立
用稀釋液按下表稀釋參比血漿，即可獲得系列濃度：
取FIB檢測試劑預(yù)溫3分鐘，至37℃。取稀釋后的參比血漿100μl，37℃預(yù)溫2分鐘。加入50μl已預(yù)溫試劑，立刻混勻并計(jì)時(shí)，記錄凝固時(shí)間。以參比血漿梯度稀釋所獲靶濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)凝固時(shí)間(秒)為縱坐標(biāo)，測定結(jié)果在雙對數(shù)曲線上作圖，或輸入儀器按照相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型自動生成工作曲線。
(二)樣本測定
樣本用稀釋緩沖液進(jìn)行10倍稀釋，測定步驟同工作曲線的制備。用CA550全自動凝血儀(廠家SYSMEX)按照廠家的說明書測定。
注意事項(xiàng)：
1.采血應(yīng)避免溶血，防止組織液混入。抽血時(shí)要順利，抗凝要充分，不可有凝血塊；分離血漿時(shí)務(wù)必去除血小板。
2.樣本收集時(shí)不宜用EDTA和肝素作抗凝劑。血液和抗凝劑的比例應(yīng)準(zhǔn)確，采血量偏差大于10％的標(biāo)本不宜使用。
3.如果血球壓積≤20％或≥55％，則需調(diào)整血樣與抗凝劑的比例，抗凝劑毫升數(shù)＝0.00185×血液毫升數(shù)×(100－壓積)。
4.使用經(jīng)校準(zhǔn)后的刻度吸管和加樣器。
5.使用清潔無污染的塑料或硅化的玻璃器皿。
6.實(shí)驗(yàn)溫度控制在37℃±1.0℃。
7.試劑與樣本量可根據(jù)需要按比例改變。
8.試劑使用完畢，應(yīng)擦干凈瓶口，盡快旋緊瓶蓋，及時(shí)放回要求的儲存條件下保存。
實(shí)施例5
水溶性葡萄糖酸化合物與水溶性谷氨酸化合物之間存在穩(wěn)定凝血酶溶液的協(xié)同效應(yīng)
在其他變量一致的條件下，對于僅含有葡萄糖酸鈣、僅含有谷氨酸鈉、同時(shí)含有葡萄糖酸鈣和谷氨酸鈉以及同時(shí)含有葡萄糖酸鈣和谷氨酸鉀的四種凝血酶溶液測定37℃下的穩(wěn)定時(shí)間，以相對偏差10％為質(zhì)控線，觀察上述凝血酶溶液的檢測結(jié)果。檢測結(jié)果取5次試驗(yàn)的均值。
表1中凝血酶溶液的各成分的含量分別為：葡萄糖酸鈣7.7g/L(如含有)、谷氨酸鈉50g/L(如含有)、谷氨酸鉀50g/L(如含有)、HEPES酸11.9g/L、疊氮鈉1g/L、吐溫80 200μl/L、凝血酶2KU/L。
表1：葡萄糖酸鈣與水溶性谷氨酸化合物穩(wěn)定凝血酶溶液的協(xié)同效應(yīng)
表2葡萄糖酸鈣與水溶性谷氨酸化合物穩(wěn)定凝血酶溶液的試驗(yàn)
從表1、表2可以觀察到，葡萄糖酸鈣與水溶性谷氨酸化合物同時(shí)存在時(shí)，凝血酶溶液的穩(wěn)定天數(shù)最長。因此，葡萄糖酸鈣與水溶性谷氨酸化合物之間存在穩(wěn)定凝血酶溶液的協(xié)同效應(yīng)。
本發(fā)明還選取了含有葡萄糖酸鋅和谷氨酸鈉的凝血酶溶液來進(jìn)一步驗(yàn)證水溶性葡萄糖酸化合物與水溶性谷氨酸化合物之間存在穩(wěn)定凝血酶溶液的協(xié)同效應(yīng)。測定37℃下的穩(wěn)定時(shí)間，以相對偏差10％為質(zhì)控線，觀察上述凝血酶溶液的檢測結(jié)果。檢測結(jié)果取3次試驗(yàn)的均值。
上述葡萄糖酸鋅和谷氨酸鈉作為穩(wěn)定劑作為穩(wěn)定劑的凝血酶溶液中各成分的含量分別為：葡萄糖酸鋅7.7g/L、谷氨酸鈉50g/L、HEPES酸11.9g/L、疊氮鈉1g/L、吐溫80 200μl/L、凝血酶30KU/L(FIB試劑)或2KU/L(TT試劑)。上述凝血酶溶液的穩(wěn)定性測試如下。
表3葡萄糖酸鋅與谷氨酸鈉穩(wěn)定凝血酶溶液的試驗(yàn)
由表3可見葡萄糖酸鋅與谷氨酸鈉也具有很好的協(xié)同穩(wěn)定效應(yīng)。
因此，從上述實(shí)驗(yàn)可以看出，水溶性葡萄糖酸化合物與水溶性谷氨酸化合物之間存在穩(wěn)定凝血酶溶液的協(xié)同效應(yīng)。
實(shí)施例6
葡萄糖酸鈣與其他非谷氨酸的氨基酸或其鹽對凝血酶溶液的穩(wěn)定效果
凝血酶溶液中各成分的含量分別為：葡萄糖酸鈣7.7g/L、甘氨酸50g/L(如含有)、精氨酸50g/L(如含有)、絲氨酸50g/L(如含有)、谷氨酸50g/L(如含有)、HEPES酸11.9g/L、疊氮鈉1g/L、吐溫80200μl/L。凝血酶為2KU/L。
以相對偏差10％為質(zhì)控線，根據(jù)實(shí)施例5中表1以及本實(shí)施例中表4、5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，葡萄糖酸鈣與其他非谷氨酸的氨基酸或其鹽并不能實(shí)現(xiàn)水溶性谷氨酸化合物對凝血酶溶液的穩(wěn)定效果。
表4：葡萄糖酸鈣與其他非谷氨酸的氨基酸穩(wěn)定凝血酶溶液的協(xié)同效應(yīng)
表5：葡萄糖酸鈣與甘氨酸或纈氨酸穩(wěn)定凝血酶溶液的協(xié)同效應(yīng)
實(shí)施例7-11中，凝血酶溶液中某一成分含量變化時(shí)，其他成分的含量遵循以下數(shù)值：葡萄糖酸鈣7.7g/L、谷氨酸鈉50g/L、HEPES酸11.9g/L、疊氮鈉1g/L、吐溫80 200μl/L。關(guān)于凝血酶溶液中酶的含量，TT試劑中，酶的含量為2KU/L；FIB試劑中，酶的含量為30KU/L。
實(shí)施例7
凝血酶溶液中HEPES酸的含量范圍
根據(jù)表6，以15％為質(zhì)控線，凝血酶溶液中HEPES酸的含量范圍可以是5.9g/L至23.8g/L。
表6凝血酶溶液中HEPES酸的含量范圍
實(shí)施例8
凝血酶溶液中葡萄糖酸鈣的含量范圍
根據(jù)表7，以15％為質(zhì)控線，凝血酶溶液中葡萄糖酸鈣的含量范圍可以是3g/L至25g/L。
表7凝血酶溶液中葡萄糖酸鈣的含量范圍
實(shí)施例9
凝血酶溶液中谷氨酸鈉的含量范圍
根據(jù)表8，以15％為質(zhì)控線，凝血酶溶液中谷氨酸鈉的含量范圍可以是10g/L至100g/L。
表8凝血酶溶液中谷氨酸鈉的含量范圍
實(shí)施例10
凝血酶溶液中疊氮鈉的含量范圍
根據(jù)表9，以15％為質(zhì)控線，凝血酶溶液中疊氮鈉的含量范圍可以是0.4g/L至1.3g/L。
表9凝血酶溶液中疊氮鈉的含量范圍
實(shí)施例11
凝血酶溶液中吐溫80的含量范圍
根據(jù)表10，以15％為質(zhì)控線，凝血酶溶液中吐溫80的含量范圍可以是100μl/L至400μl/L。
表10凝血酶溶液中吐溫80的含量范圍